在鸡胚的流感病毒传播

摘要

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

摘要

流感与约36000人死亡，每年有超过20万的住院在美国的关联。新的流感病毒株引起的突变，并重新分类连续出现复杂的病毒控制，并有必要的新颖的药物和疫苗的永久发展。流感的实验室为基础的研究中，需要对病毒的传播有可靠和具有成本效益的方法。在这里，一个全面的协议是为A型流感病毒的传播在肥沃的鸡蛋，它始终产生高滴度的病毒股票。简言之，血清的无病原体（SPF）的受精鸡蛋孵育在37℃和55-60％湿度下10 - 11天。在此期间，胚胎发育，可以很容易地用一个鸡蛋烛台监测。病毒接种是通过注射病毒原液的成使用的针的尿囊腔。后在37℃下孵育2天，将蛋冷冻至少4小时，在4℃。上方的空气囊和尿囊膜蛋壳然后小心地打开，并含有病毒的尿囊液收获。流体从碎屑清除通过离心，等分并转移至-80℃长期储存。大量（5-10毫升的病毒含有每蛋流体）和高病毒效价通常与该协议实现作出了鸡蛋的病毒制备我们的有利方法的使用，特别是用于在体外研究需要大量病毒在其中需要同样的病毒股票的高剂量。

引言

甲型流感仍然是一个重大威胁人类健康。这是一个潜在的破坏性呼吸系统疾病有大型的全球性负担造成了全球每年¹ 500,000人死亡。流感病毒是在家庭正粘病毒和携带8负义单链RNA在它们的基因组^1,2。病毒基因组的高可变性（ 即抗原"漂移"）防止长期免疫力。此外，流感是抗病毒的药物³日益抗性。

2009年甲型H1N1流感大流行强调所有流感病（流感病毒，抗病毒性，推迟疫苗的生产）相关的具有挑战性的问题。该疫苗配方是每年由世界卫生组织为最有可能致病的流感病毒株（分别为H1N1，H3N2和乙型流感^）4确定。因为这种方法是基于预测流感病毒株S，致病菌株偶尔错误地标识和疫苗的有效性急剧下降。此外，新型流感病毒株的出现可以绕开造成流行病²这些预防计划。

一个通用流感疫苗的创作一直难以捉摸^5。因此，研究必须继续为了解肺损伤的发病机制。到设施的实验室研究，几种方法已经被开发用于病毒分离和传播^6。人流感病毒可以在多种哺乳动物细胞基质进行放大。然而，在大批量生成高滴度病毒最好在胚卵实现。以下协议描述的技术为A型流感病毒的传播和存储，从现有的病毒股票。

研究方案

注:总论:执行涉及操纵在无菌条件下的蛋的所有程序，和无菌技术应相应地使用。预清洁所有的设备用70％乙醇后再使用。在一般情况下，流感病毒接种和收获应在BSL-2实验室中进行。但是，如果该协议被用于传播更多的致病性流感病毒（ 例如 ，流感大流行和大流行前的菌株，即危及家禽和牲畜，人感染高致病性禽流感毒株，1918年的H1N1病毒株），更高的生物安全水平，在某些情况下，生物安全防范措施和授权是必需的。当地生物安全委员会应批准涉及流感病毒的所有研究工作。

1.准备鸡蛋的接种

1. 从合适的供应商处获得的血清的无病原体（SPF）的新鲜受精禽卵。通常情况下，鸡卵被使用。鸡蛋应该是我们ED抵达后立即。
2. 抵达后的地方鸡蛋一个鸡蛋加湿孵化器与自动鸡蛋特纳经常转动鸡蛋。如果自动鸡蛋特纳不可用，手动旋转鸡蛋一天（一定要戴上手套并保留一切无菌地）至少2-3次。
3. 孵化卵在37℃和55-60％湿度为10-11天。

2.鸡蛋烛

1. 用一个鸡蛋烛台检查对着明亮光线的鸡蛋在一个黑暗的房间通过后约7或8天的潜伏期烛检查鸡蛋不育。
   1. 擦蛋烛台，用70％的乙醇。经常更换手套和用70％乙醇消毒，以减少污染的病原体的风险。
   2. 从孵化器中取出卵子，并将它们放在空的鸡蛋盒。
   3. 关灯的房间。
   4. 保持每个鸡蛋一体的大型月底在对烛台时间。
   5. 观察蛋determinË如果是肥沃还是贫瘠。
      注:细血管导致豆形胚应清晰可见。未受精的卵子会出现一个小血点有明显的蛋黄。
2. 丢弃卵是受精，并返回可行蛋的孵化器。不要让鸡蛋孵化器外超过30分钟。如果一个鸡蛋的状态不能得到证实，将其标记，后来观察它。

3.编写病毒的接种

1. 稀释的流感病毒原液至约10 ³ -在无菌PBS中含有10mM HEPES（pH 7.4）中10 ⁴ PFU / ml的。关键的一步:在使用前稀释病毒的股票，并保持病毒稀释冰上所有的时间。

通过尿囊路线4.流感病毒接种

1. 在病毒接种（10天或11）的一天，再次蜡烛鸡蛋和消除任何死胚。区分活胚胎通过找蛋内运动。
2. 从培养箱中取出三个鸡蛋，并安排在鸡蛋中与空气囊一个单独的支架。
3. 纪念鸡蛋用永久性记号笔的领空。
4. 洗蛋壳，用70％的乙醇的空气空间的上方。
5. 把鸡蛋与空气的空间在一个鸡蛋纸箱和成生物安全罩（BSL-2）。
6. 使用无菌18G针头打一个小孔，在外壳上每个鸡蛋的空气囊。要注意不要插入针过深，以免刺伤胚胎或蛋黄。
7. 拟定稀释流感病毒进入无菌1ml注射器，并附加一个22G针头。
8. 认真推进针注射器以45°角插入尿囊腔。
9. 注入0.2毫升稀释的流感病毒。
10. 重复注射与其他两个鸡蛋，然后丢弃的注射器和针头。
11. 密封带从胶枪（或熔融石蜡）一滴粘结剂的孔。 BË小心，胶水不漏蛋内。
12. 将鸡蛋放回蛋孵化器与空气空间指向向上。
13. 重复步骤4.2 - 4.12，直到所有的鸡蛋都已经接种。

5.孵化时间

1. 孵育感染鸡蛋无需转动，在37℃和〜60％的湿度。
2. 选择最佳孵育时间取决于流感病毒的类型。孵化甲型流感48小时;孵育流感B和C为72小时。

6.流感病毒收获

1. 经过潜伏期，寒意鸡蛋在4℃最少4小时（或O / N）杀死胚胎和收缩血管，减少污染的血液被感染的尿囊液的风险。这样做是为了防止红血细胞从吸收的病毒，从而降低了产率。可替代地，寒意鸡蛋30分钟在-20℃;然而，这会增加血液污染的风险。
2. 之后的鸡蛋被充分冷却，卵转移到生物安全罩。将蛋与气囊朝上牢固夹持。清洁蛋表面用70％的乙醇。
3. 用无菌剪刀打开上方的空气囊的蛋壳。周围的空气囊去掉外壳，注意不要破坏绒毛尿囊膜。
4. 打开绒毛尿囊膜，用无菌钝钳。轻轻移动胚胎和卵黄囊用小刮刀或汤匙放在一边。小心不要破裂的蛋黄。
5. 用1毫升的Eppendorf移液器，仔细收集尿囊液。如果需要的话，倾斜鸡蛋有点一边收集尽可能多的流体越好。
6. 组合来自所有鸡蛋尿囊液到50ml的塑料离心管中。保持病毒收获期间冰在任何时候都管。一个鸡蛋产量5 - 10毫升一个淡黄色的液体。
7. 旋转含有病毒的尿囊液在1000×g离心，在4 10分钟6℃到沉淀杂物。转移透明流体到一个新的50ml管中保持在冰上。配置鸡蛋放入一个BSL-2的废弃物容器。

7.储存

1. 立即等分澄清尿囊液（ 例如，50，100或500微升等分试样）和单元冷冻在液氮中。传输冻病毒储存至-80℃冰箱长期保存。

结果

多种方法已经发展到滴定流感病毒。当选择适当的方法之一的考虑是，某些确定总颗粒无论活力（ 例如 ，血凝素测定法），而其他人都基于感染性的，这将评估存活的病毒颗粒（ 例如 ，空斑测定^）6。此处，尿囊液的病毒滴度从接种小鼠-适应的流感病毒（A / PR / 8/34）鸡卵收集空斑测定（ 图1）和血凝试验（ 图2）进行测定。

流...

讨论

流感导致疾病的一个大的全球负担，工作持续到了解肺损伤⁷的发病机制。以促进研究在这种致命的疾病，各种方法已经被开发来传播的流感病毒^6。这里，我们描述了一种技术，以产生流感病毒在鸡卵。这种方法的优点是，它是高度可重复的，并导致大量的高滴度流感病毒的股票，这往往是必需的体外研究。

大多数实验室将能够快速，轻松地开发该协?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate buffered saline (PBS)	Cellgro	21-040-CV
serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs	VALO BioMedia	n/a
humidified egg incubator	FARM iNNOVATORS	Model 2100
automatic egg turner	FARM iNNOVATORS	Model 3200
egg candler	FARM iNNOVATORS	Model 3300
1 ml syringe	BD Bioscience	309659
18G needle	BD Bioscience	305196
20G / 22G needle	BD Bioscience	305176 / 305156
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Ethanol, >99.5%	Sigma-Aldrich	459844	diluted to 70% using water
glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	Model 1105
glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	220-34ZIP30
MDCK cells	ATCC	CRL-2935
Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%	Lampire Biological Laboratories	724908