רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Summary

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Abstract

זיהום שפעת קשור על 36,000 מקרי מוות ויותר מ -200,000 אשפוזים מדי שנה בארצות הברית. הופעתה המתמשכת של זני נגיף שפעת חדשים עקב מוטציה ומחדש מבחר מסבכת את השליטה של ​​הנגיף ומחייבת פיתוח הקבוע של תרופות וחיסונים רומן. המחקר מבוסס המעבדה של שפעת דורש שיטה אמינה וחסכונית להתפשטות של הווירוס. כאן, פרוטוקול מקיף מסופק לשפעת התפשטות וירוס בביצי תרנגולת פורה, אשר מניבה באופן עקבי מניות נגיפיות גבוה כייל. בקיצור, ביצי סרום הפתוגן ללא (SPF) מופרה עוף טופחו על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 במשך 10 - 11 ימים. במהלך תקופה זו, פיתוח עובר יכול להיות במעקב בקלות באמצעות קנדלר ביצה. חיסון וירוס מתבצע על ידי הזרקה של מניות וירוס לתוך חלל allantoic באמצעות מחט. אחרי 2 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, הביציםמצונן לפחות 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס. קליפת הביצה מעל שק האוויר וקרום chorioallantoic לאחר מכן פתחה בזהירות, ונוזל allantoic המכיל את הנגיף שנקטפו. הנוזל מנוקה מפסולת על ידי צנטריפוגה, aliquoted והועבר ל-80 ° C לאחסון לטווח ארוך. הכמות הגדולה (5-10 מיליליטר של נוזל לביצה המכיל וירוס) כייל נגיף וגבוה אשר בדרך כלל מושגת עם פרוטוקול זה הפכה את השימוש בביצים להכנת וירוס השיטה נוחה שלנו, בפרט ללימודים במבחנה הדורשים כמויות גדולות של וירוס שבמינונים גבוהים של אותו מניות הווירוס יש צורך.

Introduction

השפעת ממשיך להיות איום גדול לבריאות אדם. זוהי מחלה בדרכי הנשימה שעלול להיות הרסנית עם נטל גלובלי גדול גורם עד 500,000 מקרי המוות בעולם בשנה ^1. נגיפי שפעת נמצאים במשפחת Orthomyxoviridae ולבצע RNA חד-גדילי 8 תחושה שלילית בגנום שלהם ^1,2. הניוון הגבוה (כלומר "להיסחף", אנטיגני) של הגנום הנגיפי מונע חסינות לטווח ארוך. יתר על כן, השפעת היא עמידה יותר ויותר לתרופות אנטי-ויראליות ^3.

מגיפת שפעת שפעת H1N1 2009 הדגישה את כל הנושאים המאתגרים הקשורים למחלת שפעת (זן מגפה, התנגדות אנטי-נגיפית, ייצור חיסון מתעכב). ניסוח החיסון נקבע מדי שנה על ידי ארגון הבריאות העולמית לזני שפעת הסביר ביותר פתוגניים (אחד עבור כל H1N1, H3N2 ושפעת B) ^4. מכיוון ששיטה זו מבוססת על זן שפעת חזהים, זנים פתוגניים מעת לעת באופן שגוי שזוהו ויעילות חיסון יורדת באופן דרמטי. יתר על כן, את המראה של זני שפעת רומן יכול לעקוף תוכניות המניעות אלה גורמים למחל מגיפת ^2.

יצירת חיסון נגד שפעת אוניברסלית כבר חמקמקה ^5. לכן, מחקר חייב להמשיך להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות. למחקר במעבדה מתקן, במספר שיטות פותחו עבור בידוד וריבוי ⁶ ויראלי. יכולים להיות מוגברים נגיפי שפעת אנושיים במגוון רחב של מצעי תאים יונקים. עם זאת, וירוסים גבוה כייל יצירה בכמויות גדולות מושגות הטובות ביותר בביצי embryonated. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקה לשפעת התפשטות וירוס ואחסון ממניות וירוס קיימות.

Protocol

הערה: הערות כלליות: בצע את כל הנהלים הקשורים מניפולציה של הביצה בתנאים סטריליים, ויש להשתמש בי טכניקה סטרילית בהתאם. טרום נקי כל הציוד עם אתנול 70% לפני השימוש. באופן כללי, חיסון נגיף שפעת וקציר צריכים להתנהל במעבדה BSL-2. עם זאת, אם פרוטוקול זה משמש כדי להפיץ הרבה יותר פתוגניים נגיפי שפעת (למשל, זני מגיפה ומראש מגיפה, זנים שמהווים סכנה לעופות ובעלי חיים, זני שפעת עופות אלימים במיוחד, זן H1N1 1918), רמות בטיחות ביולוגיות גבוהות ו בחלק ממקרים, אמצעי זהירות ביטחון ביולוגי ואישורים נדרשים. ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית המקומית צריכה לאשר את כל המחקר מעורב נגיף שפעת.

1. הכנת הביצים להרכבת חיסון

1. להשיג ביצי עופות לפתוגן חופשי (SPF) טרי מופרה סרום מספק מתאים. בדרך כלל, ביצי תרנגולת משמשות. ביצים צריכה להיות לנוed מייד עם הגעה.
2. על ביצי מקום הגעה בחממה ביצת humidified עם טרנר ביצה אוטומטי כדי לסובב ביצים באופן קבוע. אם טרנר ביצה אוטומטי אינו זמין, לסובב ידני ביצים לפחות 2-3 פעמים ביום (הקפד ללבוש כפפות ולשמור הכל כסטרילי ככל האפשר).
3. דגירה ביצים על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 ל10-11 ימים.

Candling 2. ביצה

1. השתמש קנדלר ביצה לבחון את הביצה נגד אור בהיר בחדר חשוך כדי לבדוק ביצים לבעיות פוריות בcandling לאחר כ -7 או 8 ימים של דגירה.
   1. נגב את קנדלר הביצה עם אתנול 70%. לשנות כפפות לעתים קרובות ולחטא עם אתנול 70% כדי לצמצם את הסיכון לזיהום על ידי פתוגנים.
   2. הסר את הביצים מן החממה ולמקם אותם בקרטונים ביצים ריקים.
   3. כבה את האורות בחדר.
   4. החזק את הקצה הרחב של כל ביצה אחת בכל פעם נגד קנדלר.
   5. שים לב לביצה לdeterminדואר אם זה פורה או לא פורה.
      הערה: כלי דם דקים מובילים לעובר בצורת שעועית צריכה להיות ברור לעין. ביצים מופרה תופיע ככתם דם קטן עם חלמון ביצת עין.
2. השלך ביצים כי הם מופרה, ולהחזיר את ביצי קיימא לחממה. אל תשאיר ביצים מחוץ לחממה עבור יותר מ -30 דקות. אם המצב של ביצה לא ניתן לאשר, לסמן אותו, ולבחון אותו מאוחר יותר.

3. הכנת הבידוד וירוס

1. לדלל מניות וירוס שפעת לכ ¹⁰ מרס ^- 10 אפריל pfu / מיליליטר PBS סטרילי המכיל 10 מ"מ HEPES (pH 7.4). צעד קריטי: לדלל את מניות הווירוס מייד לפני השימוש ולשמור את הווירוס בדילול מלא על קרח כל הזמן.

4. הרכבת חיסון שפעת וירוס דרך כביש allantoic

1. ביום של חיסון וירוס (יום 10 או 11), נר הביצים שוב ולחסל את כל עוברים מתים. להבחין עוברים חיים על ידימחפש תנועה בתוך הביצה.
2. הסר את שלוש ביצים מן החממה, ולסדר את הביצים בבעל נפרד עם שק האוויר למעלה.
3. סמן את המרחב האווירי של הביצים עם סמן קבע.
4. לשטוף את קליפת הביצה מעל המרחב האווירי עם 70% אתנול.
5. שים את הביצים עם החלל עד האוויר בקרטון ביצים ולמכסת מנוע בטיחות ביולוגי (BSL-2).
6. שימוש במחט 18G סטרילי אגרוף חור קטן בקליפה מעל שק האוויר של כל ביצה. היזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי, כדי למנוע דקירת העובר או חלמון.
7. צייר את נגיף השפעת המדולל לתוך מזרק 1 מיליליטר סטרילי ולצרף מחט 22g.
8. לקדם בזהירות את המזרק עם מחט בזווית של 45 מעלות לתוך חלל allantoic.
9. להזריק 0.2 מיליליטר של נגיף שפעת בדילול מלא.
10. חזור על הזריקה עם שתי ביצים האחרות, ואז להשליך את המזרק ומחט.
11. לאטום את החור עם ירידה של דבק מאקדח דבק (או שעוות פרפין נמס). Bדואר זהיר כי דבק לא ידלוף בתוך הביצה.
12. מניחים את הביצים בחזרה לתוך חממת הביצה עם המרחב האווירי הצביע כלפי מעלה.
13. חזור על שלבים 4.2-4.12 עד שכל הביצים כבר מחוסנת.

5. דגירה זמן

1. לדגור על הביצים נגועות מבלי להפוך על 37 מעלות צלזיוס ולחות ~ 60%.
2. בחר זמן דגירה אופטימלי בהתאם לסוג וירוס שפעת. דגירה שפעת במשך 48 שעות; דגירה השפעת B ו- C למשך 72 שעות.

6. וירוס שפעת קציר

1. לאחר תקופת דגירה, לצנן את הביצים על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות (או O / N) כדי להרוג את העובר ולהצר את כלי הדם כדי להפחית את הסיכון של זיהום נוזל allantoic הנגוע בדם. לעשות את זה כדי למנוע את תאי דם האדומים מפני ספיגת הווירוס, אשר מפחית את התשואה. לחלופין, ביצי צינה למשך 30 דקות ב -20 ° C; אולם זה מגביר את הסיכון לזיהום בדם.
2. לאחר הביצים היו מספיק קרות, להעביר את הביצים למכסת מנוע בטיחות ביולוגית. מניחים את הביצה לתוך בעל משרד עם שק האוויר פונה כלפי מעלה. נקה את משטח הביצה עם אתנול 70%.
3. השתמש במספרי סטרילי כדי לפתוח את קליפת הביצה מעל שק האוויר. הסר את הקליפה סביב שק האוויר והקפד לא להרוס את קרום chorioallantoic.
4. פתח את קרום chorioallantoic עם מלקחיים בוטים סטרילי. בעדינות להזיז הצידה את העובר וצק החלמון עם מרית קטנה או כף. יש להיזהר שלא לקרוע את החלמון.
5. בעזרת פיפטה Eppendorf 1 מיליליטר, לאסוף בזהירות את נוזל allantoic. במידת הצורך, להטות את הביצה קצת לצד כדי לאסוף כנוזל עד כמה שניתן.
6. מערבבים את נוזל allantoic מכל הביצים לתוך צינור חרוטי פלסטיק 50 מיליליטר. שמרו צינורות על קרח בכל העת במהלך קציר וירוס. תשואות ביצה אחת 5 - 10 מיליליטר של נוזל צהבהב במקצת.
7. ספין נוזל allantoic המכיל וירוס XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 46; C עד גלולה פסולת. העבר את הנוזל השקוף לתוך צינור 50 מיליליטר חדש כל הזמן על קרח. השלך ביצים לתוך מיכל פסולת BSL-2.

7. חפצים

1. מייד aliquot הנוזל הבהיר allantoic (למשל, 50, 100 או 500 aliquots ul) וsnap-הקפאה בחנקן נוזלי. העבר את מניות וירוס קפוא ל-80 ° C במקפיא לאחסון לטווח ארוך.

תוצאות

מספר שיטות פותחו כדי כייל נגיף שפעת. שיקול אחד בעת בחירת שיטה מתאימה הוא שחלק לקבוע חלקיקים כולל, ללא קשר ליכולת קיום (למשל, assay hemagglutinin) ואילו אחרים מבוססים על infectivity, אשר יהיה להעריך virions קיימא (למשל, assay פלאק) ^6. כאן, כייל הנגיף של נוזל allantoic נאסף מביצי תרנ?...

Discussion

שפעת גורמת לניטל עולמי גדול של מחלה, ועבודה נמשכת להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות ^7. למחקר הקל במחלה קטלנית, שיטות שונות פותחו כדי להפיץ את נגיף שפעת ^6. כאן אנו מתארים טכניקה לייצר וירוס שפעת בביצי תרנגולת. היתרון של שיטה זו הוא שזה מאוד לשחזור ותוצאות בכמויות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate buffered saline (PBS)	Cellgro	21-040-CV
serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs	VALO BioMedia	n/a
humidified egg incubator	FARM iNNOVATORS	Model 2100
automatic egg turner	FARM iNNOVATORS	Model 3200
egg candler	FARM iNNOVATORS	Model 3300
1 ml syringe	BD Bioscience	309659
18G needle	BD Bioscience	305196
20G / 22G needle	BD Bioscience	305176 / 305156
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Ethanol, >99.5%	Sigma-Aldrich	459844	diluted to 70% using water
glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	Model 1105
glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	220-34ZIP30
MDCK cells	ATCC	CRL-2935
Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%	Lampire Biological Laboratories	724908