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摘要

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

摘要

病原体特异性T细胞的过继转移可用于预防和治疗机会性感染如巨细胞病毒（CMV）感染异基因造血干细胞移植后发生。从供者，包括第三方捐助者病毒特异性T细胞，可以传播体外 ，符合现行良好生产规范（cGMP），采用多轮抗原驱动的刺激有选择性地繁殖所需的T细胞。抗原特异性T细胞的鉴定和分离，也可基于T细胞的细胞因子的捕获系统，该系统已经被激活以分泌γ-干扰素（IFN-γ）进行。然而，广泛的人类应用的细胞因子捕获系统（CCS），以帮助恢复免疫的已受到了限制生产过程是耗时，并且需要熟练的操作人员。第二代细胞富集设备，如CliniMACS神童发展到现在使研究者以产生使用自动化，更少劳动密集的系统的病毒特异性T细胞。该装置中分离磁使用磁激活细胞分选技术，产生临床级产品未标记细胞标记的细胞，被设计为封闭系统，并且可以进行访问和操作上的台式。我们证明这个新的自动化细胞富集装置的操作来制造从CMV启动血清阳性供体获得一个稳态单采产物获得的CMV pp65抗原特异性T细胞。这些分离的T细胞可以被直接注入机构和联邦监管监督下的患者。所有的生物处理步骤包括去除红血细胞，T细胞，抗原特异性T细胞，纯化和洗涤分离的刺激完全自动化。设备，如这提高的可能性，T细胞对人类应用能奉献良好生产规范GMP外（制造）设施，而是在血库设施的工作人员可以监控自动化协议，以生产多种产品的生产。

引言

造血干细胞移植（HSCT）1可以与过继性T细胞治疗相结合，以提高移植物抗肿瘤效果，并提供免疫机会感染2。产生抗原特异性供体来源的T细胞输注历来所需的技能型人才和使用专门的设施，是按照GMP标准。这种T细胞的递送导致的机会性感染3的分辨率以及治疗潜在恶性肿瘤4。最近，研究人员已经证明，只有几千病毒特异性T细胞的过继转移（〜1×10 4 - 2.5×10 5细胞/千克接受者体重）可以成功地治疗同种异体HSCT后5-9机会性巨细胞病毒感染。数量有限的GMP设施，相关精湛的制造要求和电池生产相关的成本高了，但是，restricted患者获得希望的T细胞疗法10。的一种方法分离抗原特异性T细胞是基于使用一个双特异性试剂来识别CD45和IFN-γ在CCS。如图所示，这种方法可以用于产生临床级的CMV特异性T细胞采用一种自动化细胞富集的CCS装置（ 图1B）。

通过将重叠肽从CMV病毒pp65抗原用感染CMV血清阳性供体白细胞分离总有核细胞（TNC）产生CMV特异性T细胞。这些肽在人类白细胞抗原（HLA）的环境中显示的，激活该TNC内CMV启动病毒pp65特异性T细胞分泌的IFN-γ。这些T细胞可以被"捕获"和磁性分离。第一代细胞富集装置（图1A）的操作所需的在细胞培养人员熟练GMP条件下，和协调工作人员承担的多个STEPS必须产生一个"俘获"的产品。

该过程通常需要10至12小时的连续运行，因此，人员可能需要工作在两班在GMP的设施。这些约束现在由第二代装置（ 图 1B所示）的执行避免。该装置进行磁性富集，与第一代设备，但在自动化的漂白的方法的CCS的其他方面。这显著降低作为大多数步骤可以完成无人参与由工作人员在GMP的球队的负担。另外，由于装置作为一个封闭系统中，抗原特异性T细胞可以被捕获并在除参与白细胞分离的分离和制备的材料启动仪器之前的步骤台式处理。完整的仪器和第二代细胞富集设备的功能性的细节已经酒馆lished 11。

这里，我们描述的步骤，从使用自动细胞富集的CCS系统稳态单采产品丰富的CMV pp65抗原特异性T细胞。一旦分离，这些CMV特异性T细胞可以被立即注入到病人体内。

研究方案

1.准备在无菌条件下材料（见材料和​​设备表）

  1. 准备3升的PBS / EDTA缓冲液补充有人血清白蛋白（HSA），以0.5％的终浓度（重量/体积）。
  2. 制备1升的临床级0.9％氯化钠（NaCl）中溶液袋和2升GMP级细胞培养基。
  3. 由重构CMV pp65抗原的一小瓶用8ml无菌水中制备60纳摩尔的CMV特异性抗原肽的鸡尾酒。
  4. 转移CMV病毒pp65肽混合物成使用鲁尔/穗互连50毫升的容量冷冻袋，并用钳钳锁，以避免后续的分配鸡尾酒到管道组。打开细胞富集管道组（TS 500）在无菌条件下。
  5. 使用无菌管道焊接，连接肽混合物冷冻袋成管路的阀门2 TS 500，不要在这个时候打开肽混合物袋夹管连接。
  6. 删除1×10 9吨数控从开始细胞产物和暂停在含有2.5％HSA至50毫升的总体积的PBS / EDTA缓冲液。细胞产品注入150ml的输液袋。

2.准备和使用自动化的细胞富集系统（见材料和​​设备表）

  1. 切换细胞富集系统 （图1B），选择节目"CCS_IFN-γ富集 "。观察显示具有说明书和图片通过程序引导操作员屏幕的用户界面。
  2. 输入参数" 操作员 "和" 管路P / N号 "。接下来，安装管500设置到自动细胞富集设备按交互式监视器屏幕上显示的指令。
  3. 遵循由显示在屏幕上以连接介质和缓冲液至设备步骤的指令的步骤。记录产品编号和connectin前试剂的批号克至仪器。
  4. 管道组的最后检查后，打开肽混合物袋的夹子。打开介质包和发起管路装置的自动启动。
  5. 后引发步骤完成后，补充的HSA（2.5％）为NaCl缓冲液中贮存袋（200毫升）与无菌管道焊机的帮助。起始细胞产品转移到"应用程序包"使用无菌管道焊工。
  6. 通过适配器连接CCS（IFNγ）试剂进入各自的管道。输入首选时间浓缩过程之前收集细胞物质的一小部分。审查和核实所有数据的准确度/参数输入。开始处理。
  7. 自动细胞富集过程开始之前，除去质量控制袋（QCB，原始分数（ORI）约含1.3毫升出用PBS / EDTA缓冲液稀释百毫升室的内容）。密封的QCB，称重，并在4℃下保存。
  8. 启动enrichmeNT进程。在该过程结束时，靶细胞将被洗脱的洗脱缓冲液从贮存袋中的近似体积。
  9. 密封的非目标单元格袋（NTCB，负分数=负）和靶细胞袋（TCB，阳性率= POS）和权衡每个袋子。的权重将被用于以后的细胞数的计算。
  10. 立即富集过程后收集每级分两等份用于流式细胞分析，样品的其余部分存储在4℃。用细胞计数测定和富集性能分析（表1），另取试样一个样本等份。
  11. 拆下油管从细胞富集仪器设置。日志文件传送到USB驱动器以备将来使用。
    注:所有的试剂应该在无菌条件下制备。使用生物安全II型吸油烟机的强烈建议。使用稳态单采蜂窝产品（非动员），从健康的隔离巨细胞病毒阳性捐助，充实巨细胞病毒抗原特异性T细胞。唯一获得FDA许可的HSA应该被使用。缓冲对细胞制剂应保持在19℃至25℃的较低或较高的环境温度会导致降低纯度和靶细胞的产率降低。

3.细胞计数的测定

  1. 取QCB，NTCB和TCB的用于细胞计数的等分试样如表 1所示。加入CD45-VoBlue至每个等分试样（效价1点11分）和孵化在黑暗中进行10分钟，在4℃。
  2. 加1.5毫升新制备的红细胞溶解溶液（1倍）的原始分数和阴性部分，450微升新鲜制备的红细胞溶解溶液的阳性分数，孵化的所有级分进行15分钟，在室温。
  3. 只是在分析之前，碘化丙锭添加于1μg/ ml的终浓度（1:100稀释的100微克/毫升）。使用自动细胞计数，以确定细胞计数和vi能力。用细胞计数设备推荐的软件进行流式细胞分析。确定白细胞绝对计数的原创，消极和积极的部分。
    注:每毫升采取细胞计数分析样品的可行的白细胞的细胞数，使用的细胞分析软件建议确定的。
  4. 设置区域，如图2（区域5，可行的白细胞）。使用以下的门控策略，以确定细胞计数。在原级分A可行白细胞见图2。
  5. 所指示的区域（图2，1-6）是分层如下:
    1:时间门→2:单细胞→3:CD45 +细胞 →4:白细胞（碎片除外）→5:活白细胞→6:活的淋巴细胞
  6. 重复相同的步骤，以确定细胞计数的消极和积极的部分。计算整个部分的细胞计数通过考虑在样品和分数（表2）的总体积的稀释剂因子。

4.考试的分离性能

  1. 预冷的PBS / EDTA缓冲液/ 0.5％AB血清洗QCB，NTCB和TCB级分的细胞的等分试样。离心细胞，在300×g离心5分钟，在4℃，吸出上清液。
  2. 悬浮细胞在含有100微升抗体 - 荧光染料染色混合物:CD3-FITC，CD4-APC，CD8-APC-Vio770，CD14-PerCP，CD20-PerCP，CD45-VioBlue和抗IFNγ-PE（滴度一时11）和孵育在黑暗中在4℃下10分钟。
  3. 加入1毫升新鲜制备的红细胞溶解溶液（1x）和孵育15分钟，在室温。离心机在300×g离心5分钟，在4℃，吸出上清液。重悬在PBS / EDTA缓冲/ 0.5％AB血清的货量充足的细胞。
  4. 加入碘化丙啶至1微克/毫升之前，为了分析（1最终浓度:100 diluti上的100微克/毫升）。进行流式细胞分析来评价样品的纯度。
  5. 使用以下的门控策略来计算的CD3 + T细胞在活白细胞门控策略用于确定CD3 + T细胞示出在CCS浓缩过程后阳性分数。所指示的区域（ 图3A和3B，1-6）分层联如下:
    1:时间门→2:单细胞→3:CD45 +细胞 →4:电池（碎片除外）→5:活白细胞→6:活CD3 +细胞群
  6. 确定CD4 +，CD8 +，CD4 + IFN-γ+和CD8 + IFN-γ+的CCS富集处理后的T细胞（表2）的频率。
  7. 使用门控策略来确定CD4 +，CD8 +，CD4 + IFN-γ+和CD8 + IFN-γ+ T细胞示出所有低于f的频率还是原始和丰富（捕获）阳性CCS处理后部分。所指示的区域被分层链接并命名如下:
    1:时间门→2:单细胞→3:CD45 +细胞 →4:电池（碎片除外）→5:活白细胞→6:活CD3 +细胞→7:CD4 +细胞→7A:CD4 + IFN-γ+细胞（盒）→8:CD8 +细胞→8A:CD8 + IFN-γ+细胞（盒）

注:层级链接的前6所示区域是相同的。图3中，（1-6）和最后2个区域示于图4（6-8a）。

结果

在这项研究中，一个自动细胞富集的CCS系统被用于自动化生产的CMV pp65抗原特异性T细胞。 CMV特异性T细胞从三个血液分离细胞产物富集。稳态单采产品收获了2小时从CMV血清阳性供体和生成的10 10总有核细胞（TNC）。 10 9 TNC然后用CMV病毒pp65衍生肽（60纳摩尔）4小时，所述IFN-γ的分泌使用自动化细胞富集设备上的CCS的T细胞中分离激活。操作者需要在实验开始时以装载所有的试剂和管?...

讨论

继T细胞疗法已成为一个可行的办法来治疗B细胞恶性肿瘤4。其治疗潜力是依赖于注入缺乏复制衰老2靶抗原特异性T细胞的期望数量。这可以通过用当前的良好生产规范整理抗原特异性T细胞的纯人口从扩增的T细胞的合规性来实现。两个分拣程序被广泛应用，即，荧光激活细胞分选（FACS）和磁性活化细胞分选（MACS）来产生的CMV抗原特异性T细胞因为我们最近5审查。使用一个?...

披露声明

这两个MD安德森癌症中心和Cooper博士拥有财务利益ZIOPHARM肿瘤，公司和Intrexon公司。 5月7日，2015年，Cooper博士被任命为ZIOPHARM肿瘤首席执行官。 Cooper博士现在是一个访问学者在MD安德森。 Cooper博士创立，拥有InCellerate，Inc.的他拥有的专利与Sangamo生物科学人工核酸酶。他担任过Targazyme公司（前身为美国干细胞公司），GE医疗集团，辉凌制药，命运治疗，扬森制药和百时美施贵宝。他是Cellectis公司的科学顾问委员会。他收到来自美天旎酬金。

致谢

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children's Foundation.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bagMiltenyi Biotec GmbH700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500Miltenyi Biotec GmbH130-097-182
5 L waste bagMiltenyi Biotec GmbH110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)Miltenyi Biotec GmbH279-01
Albumin (Human) 25% Grifols58516-5216-2
Luer/Spike InterconnectorMiltenyi Biotec GmbH130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65Miltenyi Biotec GmbH170-076-109
Water for injectionsHospira, inc, Lake Forest, ILNDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm MilliporeSLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bagMiltenyi Biotec GmbH170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)Miltenyi Biotec GmbH130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec GmbH200-074-400
60 ml Syringes, sterileBD, Laagstraat, Temse, Belgium309653
CMV sero positive apheresis productKey Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry MaterialsManufacturerCatalog number
AB Serum, GemCellGemini Bio-Products, West Sacramento, USA100-512
CD3-FITCMiltenyi Biotec GmbH130-080-401
CD4-APCMiltenyi Biotec GmbH130-098-033
CD8-APC-Vio770Miltenyi Biotec GmbH130-098-065
CD14-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-072
CD20-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-077
CD45-VioBlueMiltenyi Biotec GmbH130-098-136
aIFN-γ-PE, humanMiltenyi Biotec GmbH130-097-940
CD3-PEMiltenyi Biotec GmbH130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)Miltenyi Biotec GmbH130-093-233
EquipmentManufacturerCatalog Number
CliniMACS Prodigy Device Miltenyi Biotec GmbH200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec GmbH130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R Eppendorf AG22331
Cellometer K2Nexelom Bioscience, Lawrence, MALB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIBTerumo Medical Corp., Elkton, MA7811

参考文献

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