Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

Riepilogo

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Abstract

Il trasferimento adottivo di cellule T specifiche per patogeno può essere usato per prevenire e curare le infezioni opportunistiche come il citomegalovirus (CMV) che si verificano dopo il trapianto allogenico di cellule staminali. Cellule T specifiche virali-da donatori allogenici, compresi donatori di terze parti, possono essere propagati ex vivo in conformità con le attuali buone prassi di fabbricazione (cGMP), impiegando ripetuti cicli di stimolazione antigenica-driven per propagare selettivamente le cellule T desiderate. L'identificazione e l'isolamento di cellule T antigene-specifiche possono essere effettuati anche in base al sistema di acquisizione di citochine di cellule T che sono state attivate a secernere gamma-interferone (IFN-γ). Tuttavia, diffusa applicazione umana del sistema di cattura di citochine (CCS) contribuire a ripristinare l'immunità è stata limitata come il processo di produzione richiede tempo e richiede un operatore esperto. Lo sviluppo di un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione come CliniMACS Prodigy oraconsente agli investigatori di generare cellule T specifiche virali-con un sistema ad alta intensità di manodopera automatizzato, meno. Questo dispositivo separa magneticamente etichettati cellule dalle cellule senza etichetta utilizzando la tecnologia magnetica ordinamento delle cellule attivate per generare prodotti ad uso clinico, è stato progettato come un sistema chiuso e si può accedere e gestito sul banco. Abbiamo dimostrato il funzionamento di questo nuovo dispositivo arricchimento delle cellule automatizzato per la fabbricazione di cellule T specifiche per CMV pp65 ottenute da un prodotto aferesi stato stazionario ottenuto da un donatore sieropositivo CMV. Queste cellule T isolate possono essere infuse direttamente in un paziente sotto la supervisione regolamentare istituzionale e federale. Tutte le fasi bio-trattamento compresi rimozione dei globuli rossi, la stimolazione di cellule T, la separazione delle cellule T antigene-specifiche, purificazione e lavaggio sono completamente automatizzati. Dispositivi come questo sollevano la possibilità che le cellule T per applicazioni sull'uomo possono essere realizzati al di fuori di buone pratiche di fabbricazione dedicato (GMP) Strutture e invece essere prodotti in sangue servizi bancari in cui il personale può supervisionare protocolli automatizzati per la produzione di più prodotti.

Introduzione

Il trapianto di cellule emopoietiche staminali (HSCT) ¹ può essere combinato con la terapia delle cellule T adottiva per migliorare effetto graft-versus-tumorale e per fornire l'immunità alle infezioni opportunistiche ^2. Generazione di linfociti T del donatore-derivato antigene-specifiche per infusione è storicamente richiesto personale specializzato e l'uso di strutture specializzate che sono GMP. La consegna di tali cellule T ha portato alla risoluzione di infezioni opportunistiche ³ e trattare il tumore di base ^4. Recentemente, i ricercatori hanno dimostrato che il trasferimento adottivo di solo poche migliaia di cellule T virus-specifici (~ 1 x 10 ^4-2,5 x 10 ⁵ cellule / kg di peso corporeo destinatario) in grado di trattare con successo le infezioni opportunistiche da CMV dopo HSCT allogenico ^5-9. Un numero limitato di strutture GMP con relative esigenze produttive qualificati e gli alti costi associati con la produzione delle cellule ha, tuttavia, Restrl'accesso dei pazienti alle itto promettenti terapie delle cellule T ^10. Un approccio per isolare le cellule T antigene-specifiche è basata su CCS utilizzando un reagente specifico bi-riconoscere CD45 e IFN-γ. Come mostrato, questa metodologia può essere utilizzato per generare uso clinico cellule T specifiche per CMV impiegano un dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato CCS (Figura 1B).

Cellule T specifiche per CMV sono generate incubando peptidi sovrapposti da pp65 CMV con le cellule leucoaferesi totale nucleari (TNC) da donatori CMV positivi. Questi peptidi, visualizzate nel contesto di leucociti antigene umano (HLA), attivare le cellule T specifiche CMV-PP65 nel TNC a secernere IFN-γ. Queste cellule T possono essere "catturati" e magneticamente separati. Il funzionamento del dispositivo di arricchimento delle cellule prima generazione (Figura 1A) richiesto personale specializzato in coltura in condizioni di GMP e coordinamento del personale di intraprendere le molteplici sTeps necessario generare un prodotto "catturato".

La procedura di richiesta tipicamente 10-12 ore di funzionamento continuo, e quindi il personale probabilmente bisogno di lavorare su due turni nella struttura GMP. Questi vincoli sono ora ovviato con l'attuazione di un dispositivo di seconda generazione (Figura 1B). Questo dispositivo si impegna arricchimento magnetico, simile al dispositivo di prima generazione, ma automatizza altri aspetti delle CCS in un approccio unbreached. Questo riduce notevolmente l'onere per la squadra GMP come la maggior parte delle fasi può essere realizzato senza sorveglianza da parte del personale. Inoltre, poiché il dispositivo opera come un sistema chiuso, le cellule T antigene-specifiche possono essere acquisiti e processati sul banco tranne le fasi isolatamente leucaferesi e preparazione dei materiali prima di avviare lo strumento. Dettagli della strumentazione completa e la funzionalità del dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione sono stati pubtuito ^11.

Qui, descriviamo la procedura per arricchire le cellule T specifiche per PP65 CMV da un prodotto aferesi steady-state utilizzando il sistema automatizzato CCS arricchimento delle cellule. Una volta isolato, queste cellule T specifiche per CMV possono essere immediatamente infuso in un paziente.

Protocollo

1. Preparazione dei materiali in condizioni sterili (vedi Materiali e attrezzature Table)

1. Preparare 3 L di tampone PBS / EDTA supplementato con albumina sierica umana (HSA) a una concentrazione finale di 0,5% (w / v).
2. Preparare 1 L sacchetto di soluzione clinica grade 0,9% di cloruro di sodio (NaCl) e 2 L di grado GMP terreno di coltura cellulare.
3. Preparare 60 nmol di specifici antigeni CMV peptide cocktail ricostituendo un flaconcino di CMV pp65 con 8 ml di acqua sterile.
4. Trasferire CMV pp65 peptide cocktail in un sacchetto di congelamento di 50 volumi ml utilizzando un Luer / Spike interconnessione e pinza con bloccaggio pinze per evitare la successiva distribuzione del cocktail nel set di tubi. Aperto cella set di tubi di arricchimento (TS 500) in condizioni di sterilità.
5. Utilizzando sterili tubi saldatore, collegare borsa congelamento peptide cocktail in collegamento tubo per valvola 2 del set di tubi TS 500. Non aprire il morsetto per sacco peptide cocktail in questo momento.
6. Rimuovere 1 x 10 ^{9 T}NC avvio prodotto cellulare e sospendere in tampone PBS / EDTA contenente 2,5% HSA ad un volume totale di 50 ml. Iniettare il prodotto cellulare in una sacca di trasferimento 150 ml.

2. Preparazione e utilizzo delle cellule automatizzato di arricchimento del sistema (vedi Materiali e attrezzature Table)

1. Accendere il sistema di arricchimento di cellule (Figura 1B) e selezionare il programma "CCS_IFN-γ arricchimento". Osservare una interfaccia utente che mostra schermi con le istruzioni e le immagini che guidano l'operatore attraverso la procedura.
2. Inserire il parametro "Operatore" e "Set di tubi P / N No". Successivamente, installare il Set di tubi da 500 ad un arricchimento delle cellule automatizzato dispositivo secondo le istruzioni visualizzate sullo schermo del monitor interattivo.
3. Seguire le istruzioni passo passo visualizzate sullo schermo per collegare il medio e buffer per il dispositivo. Record numero di catalogo e il numero di lotto dei reagenti prima connecting allo strumento.
4. Dopo il controllo finale del set di tubi, aprire il morsetto della borsa peptide cocktail. Aprire la busta medio e avviare innesco automatico del set di tubi.
5. Dopo la fase di caricamento è completato, integrare HSA (2,5%) in tampone NaCl nel sacchetto serbatoio (200 ml) con l'aiuto del tubo saldatore sterile. Trasferire il prodotto di partenza cellulare nella "borsa Applicazione" utilizzando il tubo saldatore sterile.
6. Collegare CCS (IFNγ) reagenti in rispettivo tubo tramite adattatori. Inserisci orario preferito per raccogliere una frazione del materiale cellulare prima di processo di arricchimento. Review e verificare l'esattezza di tutti i dati / parametri inseriti. Avviare il processo.
7. Prima dell'inizio del processo di arricchimento delle cellule automatizzato, rimuovere il sacchetto di Controllo Qualità (QCB, frazione originale (ori) contiene circa 1,3 ml su 100 ml di contenuto camera diluito con tampone PBS / EDTA). Sigillare il QCB, pesare, e conservare a 4 ° C.
8. Avviare il enrichmeprocesso nt. Alla fine del processo, cellule bersaglio vengono eluite con un volume di circa tampone di eluizione dal sacchetto serbatoio.
9. Sigillare il cellulare Sacchetto non Target (NTCB, frazione negativo = neg) e Cell obiettivo Bag (TCB, frazione positiva = pos) e pesare ogni sacchetto. I pesi saranno utilizzati successivamente per il calcolo del numero di cellule.
10. Immediatamente dopo la procedura di arricchimento raccogliere due aliquote per frazione per citometria a flusso, e memorizzare il resto dei campioni a 4 ° C. Utilizzare un'aliquota campione per la determinazione numero di celle e l'altra un'aliquota del campione per l'analisi delle prestazioni arricchimento (Tabella 1).
11. Rimuovere il set di tubi dallo strumento di arricchimento delle cellule. Trasferire il file di log di un drive USB per un utilizzo futuro.
    NOTA: Tutti i reagenti devono essere preparati in condizioni sterili. Si consiglia vivamente l'uso di un biosicurezza tipo II cofano. Utilizzare aferesi prodotto cellulare di stato stazionario (non mobilitati) isolato da un sanoCMV-sieropositivi donatore per arricchire specifiche cellule T antigene CMV. Solo la FDA licenza HSA deve essere utilizzato. Il buffer per la preparazione delle cellule deve essere conservato a 19 ° C a +25 ° C, temperature ambiente inferiori o superiori si tradurrà in purezza ridotta e una resa ridotta delle cellule bersaglio.

3. Determinazione delle cellule Conte

1. Prendete le aliquote di QCB, NTCB e TCB per la conta delle cellule, come indicato nella tabella 1. Aggiungere CD45-VoBlue a ciascuna aliquota (titolo 1,11) e incubare al buio per 10 minuti a 4 ° C.
2. Aggiungere 1,5 ml di soluzione di lisi dei globuli rossi preparata di fresco (1x) alla frazione originale e la frazione negativo, 450 microlitri soluzione appena preparata di lisi dei globuli rossi alla frazione positiva, e incubare tutte le frazioni per 15 minuti a RT.
3. Appena prima dell'analisi, aggiungere ioduro di propidio ad una concentrazione finale di 1 mg / ml (1: 100 di 100 mg di diluizione / ml). Utilizzare contatore di cellule automatico per determinare conteggio e vi cellacapacità. Utilizzare dispositivo contatore di cellule software consigliato per analisi di citometria a flusso. Determinare i conteggi assoluti di leucociti per frazioni originali, negativi e positivi.
   NOTA: Il numero di celle di leucociti vitali per ml dei campioni prelevati per l'analisi conta delle cellule è determinata con il software analizzatore di cellule consigliato.
4. Impostare la regione come mostrato nella Figura 2 (regione 5, leucociti vitali). Utilizzare la seguente strategia di gating per determinare il conteggio delle cellule. Un leucociti vitali in frazione originale è mostrato in Figura 2.
5. Le regioni indicate (Figura 2, 1-6) sono gerarchicamente come segue:
   1: Il tempo porta → 2: Singole cellule → 3: ^CD45 + cellule → 4: leucociti (detriti esclusa) → 5: leucociti vitali → 6: linfociti vitali
6. Ripetere gli stessi passaggi per determinare il conteggio delle cellule per le frazioni negativi e positivi. Calcolare il numero di cellule di tutta la frazioneconsiderando il fattore di diluente del campione e del volume totale della frazione (Tabella 2).

4. Esame della Performance separazione

1. Lavare le aliquote di QCB, NTCB e cellule frazione TCB con pre-refrigerati tampone PBS / EDTA / siero AB 0,5%. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante.
2. Risospendere le cellule in miscela colorazione 100 l anticorpi fluorocromo contenente: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue e anti-IFNγ-PE (titolo 1:11) e incubare al buio per 10 minuti a 4 ° C.
3. Aggiungere 1 ml di soluzione di lisi dei globuli rossi preparata di fresco (1x) e incubare per 15 minuti a RT. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in un adeguato volume di PBS / EDTA Buffer / 0,5% AB Serum.
4. Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 mg / ml appena prima dell'analisi (1: 100 dilutisu 100 mcg / ml). Eseguire analisi citofluorimetrica per valutare la purezza del campione.
5. Utilizzare la seguente strategia di gating per calcolare le ^cellule T CD3 + in percorribile strategia di gating leucociti per la determinazione delle ^cellule T CD3 + è mostrato nella frazione positiva dopo il processo di CCS arricchimento. Le regioni indicate (figura 3A e 3B, 1-6) sono gerarchicamente collegati come segue:
   1: Tempo di cancello → 2: Singole cellule → 3: CD45 ^{+ cellule} → 4: Cells (detriti esclusa) → 5: leucociti vitali → 6: CD3 ^{+ cellule} vitali di popolazione
6. Determinare le frequenze di CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ ⁺ e CD8 + IFN-γ ⁺ cellule T dopo processo di arricchimento CCS (Tabella 2).
7. Utilizzare la strategia di gating per determinare le frequenze di CD4 ^+, CD8 ^+, CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ e CD8 ⁺ cellule T IFN-γ ⁺ indicati di seguito fo (catturati) frazione positiva originale e arricchito dopo il processo di CCS. Le regioni indicate sono gerarchicamente collegati e denominati come segue:
   1: Tempo di cancello → 2: Singole cellule → 3: CD45 ^{+ cellule} → 4: Cells (detriti esclusa) → 5: I leucociti vitali → 6: CD3 ^{+ cellule} vitali → 7: ^cellule CD4 + → 7a: CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ celle (scatola) → 8: ^CD8 + cellule → 8a: ^{+ cellule} CD8 ⁺ IFN-g (scatola)

NOTA: I primi 6 regioni dei collegamenti gerarchia indicate sono le stesse di figura 3, (1-6) e l'ultima 2 regioni sono mostrati in Figura 4 (6-8a).

Risultati

In questo studio, una cella automatizzata arricchimento sistema CCS è stato utilizzato per la produzione automatica di cellule T specifiche per CMV pp65. Cellule T specifiche per CMV sono stati arricchiti da tre prodotti di cellule aferesi. Il prodotto aferesi steady-state è stato raccolto più di 2 ore da un donatore CMV-sieropositivi e ha generato 10 ¹⁰ cellule nucleari totali (TNC). 10 ⁹ TNC sono stati poi attivati ​​con CMV pp65 peptidi derivati ​​dal (60 nmol) per 4 ore e l'IFN-?...

Discussione

La terapia delle cellule T adottiva è emersa come una valida opzione per il trattamento di tumori a cellule B ^4. Il suo potenziale terapeutico dipende infondendo il numero desiderato di specifiche cellule T antigene bersaglio privi replicativa senescenza ^2. Ciò può essere ottenuto da sistemare una popolazione pura di cellule T specifiche antigene da cellule T espanse le vigenti buona fabbricazione. Due procedure di smistamento sono ampiamente utilizzati, vale a dire, la fluorescenza delle cellul...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-182
5 L waste bag	Miltenyi Biotec GmbH	110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)	Miltenyi Biotec GmbH	279-01
Albumin (Human) 25%	Grifols	58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)	Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-109
Water for injections	Hospira, inc, Lake Forest, IL	NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm	Millipore	SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag	Miltenyi Biotec GmbH	170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)	Miltenyi Biotec GmbH	130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec GmbH	200-074-400
60 ml Syringes, sterile	BD, Laagstraat, Temse, Belgium	309653
CMV sero positive apheresis product	Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials	Manufacturer	Catalog number
AB Serum, GemCell	Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA	100-512
CD3-FITC	Miltenyi Biotec GmbH	130-080-401
CD4-APC	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-033
CD8-APC-Vio770	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-065
CD14-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-072
CD20-PerCP	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-077
CD45-VioBlue	Miltenyi Biotec GmbH	130-098-136
aIFN-γ-PE, human	Miltenyi Biotec GmbH	130-097-940
CD3-PE	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-233
Equipment	Manufacturer	Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device	Miltenyi Biotec GmbH	200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec GmbH	130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R	Eppendorf AG	22331
Cellometer K2	Nexelom Bioscience, Lawrence, MA	LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB	Terumo Medical Corp., Elkton, MA	7811