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요약

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

초록

병원균 특이 T 세포의 대체 전송이 방지 및 동종 조혈 줄기 세포 이식 후 발생하는 감염 (CMV)와 같은 사이토 메갈로 바이러스 기회 감염을 치료하는데 사용될 수있다. 타사 도너 포함한 동종 공여자로부터 바이러스 특이 T 세포를 선택적으로 목적하는 T 세포를 전파 항원 구동 자극 반복 라운드를 이용하는 현재 우수 제조 CGMP ()을 준수 생체 전파 될 수있다. 항원 특이 적 T 세포의 식별 및 분리는 감마 인터페론 (IFN-γ)를 분비하는 활성화 된 T 세포의 사이토 카인 캡처 시스템에 기초하여 수행 될 수있다. 제조 공정은 시간 소모적이며, 숙련 작업자를 필요로하지만, 면역 복원 돕는 사이토 카인 캡쳐 시스템 (CCS)의 광범위한 인간 응용이 제한되어왔다. 이제 이러한 CliniMACS 프로디지 같은 2 세대 셀 농축 장치의 개발자동화 덜 노동 집약적 인 시스템을 이용하여 바이러스 - 특이 T 세포를 생성 할 수 있도록 연구자. 이 장치는 자기 임상 등급의 제품을 생성하기 위해, 자기 활성화 세포 분류 기술을 이용하여 표지 된 세포로부터 세포를 분리한다 표지, 폐쇄 시스템으로 설계되며, 벤치 탑에 액세스하여 조작 할 수있다. 우리는이 새로운 자동화 된 세포 농축 장치의 동작은 CMV 혈청 양성 공여자로부터 얻은 정상 성분 채집 생성물로부터 수득 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 제조하는 것이 입증. 이러한 고립 된 T 세포는 다음 직접 기관 및 연방 정부의 규제 감독하에 환자에 주입 할 수있다. 적혈구의 제거를 비롯한 모든 생물 처리 단계는, T 세포, 항원 특이 적 T 세포를, 정제, 분리 및 세정의 자극은 완전 자동화된다. 이와 같은 장치는 애플리케이션에 대한 인간 T 세포 GMP (전용 우수 제조 밖에 제조 할 수있는 가능성을 높이기) 대신 시설은 직원이 여러 제품을 생산하는 자동화 된 프로토콜을 감독 할 수 혈액 은행 시설에서 생산 될 수있다.

서문

조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 1 이식편 대 종양 효과를 향상시키고, 기회 감염 (2)에 내성을 제공하는 T 세포 대체 요법과 결합 될 수있다. 주입을위한 항원 특이 기증자 유래 T 세포의 생성은 역사적으로 숙련 된 인력 및 GMP를 준수합니다 전문 시설의 사용을 요구하고있다. 이러한 T 세포의 전달 기회 감염 3 해상도뿐만 아니라 하부 암 (4)의 처리 결과이다. 최근 연구자들은 증명 그 천 단지 몇 바이러스 특이 적 T 세포의 대체 전송 (~ 1 × 10 4-2.5 × 105 세포 / kg받는 체중) 성공적 동종 조혈 모세포 5-9 후 편의적 CMV 감염을 치료할 수있다. 관련된 숙련 제조 요건 GMP 시설 제한된 수 및 셀 생산과 관련된 높은 비용 그러나 restr을 갖는다T 세포 치료 (10)를 약속에 icted 환자 액세스 할 수 있습니다. 항원 특이 적 T 세포를 분리하는 한 가지 방법은 CD45 및 IFN-γ을 인식하는 이중 특이 시약을 사용 CCS에 기초한다. 도시 된 바와 같이,이 방법은 자동화 된 세포 농축 CCS 장치 (도 1B)를 이용한 임상 등급 CMV 특이 T 세포를 생성하는데 사용될 수있다.

CMV 특정 T 세포는 CMV 혈청 검사 양성인 기증자로부터 백혈구 성분 채집 총 핵 세포 (TNC)와 CMV pp65 유래의 항원에서 중복 펩티드를 배양에 의해 생성됩니다. 인간 백혈구 항원 (HLA)의 맥락에서 디스플레이 이들 펩타이드, IFN-γ를 분비하는 TNC 내의 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 활성화. 이러한 T 세포는 "캡쳐"및 자기 적으로 분리 될 수있다. 제 세대 셀 농축 장치의 운전 (도 1a)는 복수의 착수 GMP 조건 하에서 세포 배양에서 숙련 된 사람이 필요하고, 직원의 코디"캡처 된"생성물을 생성하는 데 필요한 TEPS.

절차는 일반적으로 연속 운전의 12 시간에 10를 요구, 따라서 직원은 가능성이 GMP 시설에서 2 교대에 걸쳐 작업을 할 필요가있다. 이러한 제약은 이제 (도 1b에 도시 된) 제 2 세대의 장치에 의해 구현되어 없어진다. 이 장치는 1 세대 디바이스와 유사한 자기 농축을 수행하고 있지만, unbreached CCS 접근법의 다른 측면을 자동화한다. 이로 인해 공정의 대부분의 직원에 의해 자동으로 달성 될 수 GMP 팀의 부담을 감소시킨다. 장치는 밀폐 시스템으로서 동작하기 때문에, 항원 특이 적 T 세포를 포착하고 측량기를 시작하기 전에 백혈구 성분 채집 분리 및 재료의 제조에 포함 된 단계를 제외한 벤치 탑에서 처리 될 수있다. 전체 계측 및이 제 2 세대 세포 농축 장치의 기능의 세부 사항은 펍 된11 졌으.

여기서는 자동 세포 농축 CCS 시스템을 이용하여 정상 성분 채집 생성물로부터 CMV pp65 유래 특이 T 세포를 풍부하게하는 단계를 설명한다. 일단 격리 이들 CMV 특이 T 세포는 즉시 환자에 주입 될 수있다.

프로토콜

무균 조건에서 재료 1. 준비 (재료 및 장비 표 참조)

  1. 0.5 %의 최종 농도로 인간 혈청 알부민 (HSA)가 보충 된 PBS / EDTA 완충액을 제조 3 L (W / V).
  2. 임상 등급 0.9 %의 염화나트륨 수용액 1 L 가방 및 GMP 급 세포 배양액 2 L을 준비한다.
  3. 멸균 8 ml의 CMV pp65 유래의 한 유리 병을 재구성하여 CMV 특정 펩타이드 항원 칵테일의 60 nmol의를 준비합니다.
  4. 루어 / 스파이크 인터 커넥터를 사용하여 50 ml의 볼륨 동결 가방에 거대 세포 바이러스 pp65 유래 펩티드 칵테일을 전송하고 튜브 세트에 칵테일 이후의 유통을 방지하기 위해 집게를 잠금으로 고정. 멸균 조건에서 열기 세포 농축 튜브 세트 (TS 500).
  5. 멸균 튜브 용접기를 사용하여,이 시간에 펩티드 칵테일 가방 클램프를 열지 마십시오 튜브 세트의 밸브 2 TS (500)에 대한 튜브 연결에 펩티드 칵테일 냉동 가방을 연결합니다.
  6. 제거 1 × 10 9 T셀룰러 출발 생성물로부터 NC 및 50 ㎖의 전체 부피로 2.5 % HSA를 함유하는 PBS / EDTA 완충액에서 중단. 150 ㎖ 전송 가방에 휴대 제품을 주입.

2. 준비 및 사용 자동화의 세포 농축 시스템 (재료 및 장비 표 참조)

  1. 셀 농축 시스템 (그림 1B)에 전환하고 프로그램 "CCS_IFN-γ 심화"를 선택합니다. 절차를 통해 운전자를 안내 지침과 함께 스크린 이미지를 나타내는 사용자 인터페이스를 관찰한다.
  2. 매개 변수 "운영자"와 "튜브 세트 P / N 번호"를 입력합니다. 다음으로, 대화 형 모니터 화면에 표시되는 지시 사항에 따라 튜브 세트 (500) 자동화 된 세포 농축에 장치를 설치합니다.
  3. 장치에 중간 버퍼를 연결하는 화면에 표시 단계별 지침을 따른다. 기록 카탈로그 번호와 connectin 전에 시약의 로트 번호악기에 들어.
  4. 튜브 세트의 최종 점검 한 후, 펩티드 칵테일 가방의 클램프를 엽니 다. 매체 가방을 열고 튜브 세트의 자동 프라이밍을 시작합니다.
  5. 프라이밍 공정이 완료된 후, 멸균 튜브 용접기의 도움으로 저장 주머니 (200 mL) 중의 염화나트륨 완충액으로 HSA (2.5 %)을 보완. 멸균 튜브 용접기를 사용하여 "응용 프로그램 가방"로 시작하는 휴대 제품을 전송합니다.
  6. 어댑터를 통해 각각의 튜브에 CCS (IFNγ) 시약을 연결합니다. 농축 과정을하기 전에 세포 물질의 일부​​를 수집하기 원하는 시간을 입력합니다. 검토 및 모든 데이터의 정확성을 확인 / 입력 파라미터. 프로세스를 시작합니다.
  7. 자동화 된 세포 농축 과정을 시작하기 전에, 품질 관리 가방 (QCB는, 원래의 분수 (오라)는 PBS / EDTA 버퍼로 희석하여 100 ㎖ 실 내용에서 약 1.3 ml에 포함)를 제거합니다. , QCB 인감 무게, 4 ° C에서 저장.
  8. enrichme 시작NT 과정. 프로세스의 끝에서, 표적 세포는 저류 백에서 용출 완충제 대략 부피로 용출 될 것이다.
  9. 비 대상 휴대 가방 (NTCB, 부정적인 부분 = NEG)와 대상 휴대 가방 (TCB, 긍정적 인 부분 = POS)를 밀봉하고 각 가방의 무게. 가중치는 나중에 세포 수의 계산에 사용한다.
  10. 즉시 농축 과정을 거친 후 유동 세포 계측법 분석을위한 분수 당 두 개의 분취 량을 수집하고, 4 ° C에서 샘플의 나머지를 저장합니다. 세포 수의 결정과 농축 성능 분석 (표 1)에 대한 다른 샘플 나누어지는 하나의 샘플 나누어지는을 사용합니다.
  11. 셀 농축 장비에서 설정 한 튜브를 제거합니다. 장래의 사용을 위해 USB 드라이브에 로그 파일을 전송.
    참고 : 모든 시약은 무균 상태에서 준비를해야합니다. 바이오 안전성 II 형 후드의 사용을 적극 권장합니다. 건강한에서 분리 된 정상 상태의 성분 채집 세포 제품 (비는-동원)를 사용하여CMV 혈청 검사 양성인 공여자가 CMV 항원 특이 T 세포를 풍부하게합니다. 만 FDA는 HSA를 사용해야 라이센스. 셀 제조 버퍼 감소 순도와 표적 세포의 수율 감소를 초래할 것이다 낮거나 높은 주변 온도로 +25 ° C로 19 ℃에서 보관한다.

3. 세포 수의 결정

  1. 표 1과 같이. 세포 수에 대한 QCB, NTCB 및 TCB의 분취 량을 4 ℃에서 10 분 동안 어둠 속에서 각각 나누어지는 (역가 1시 11분)에 CD45-VoBlue를 추가하고 품어.
  2. 원래 분획 및 음 분획 양 분획 450 ㎕의 새로 제조 된 적혈구 세포 용해 액에 1.5 ml의 신선하게 제조 된 적혈구 세포 용해 용액 (1X)를 첨가하고, RT에서 15 분 동안 모든 분획을 배양한다.
  3. (100 μg의 / ㎖로 희석 한 100) 직전에 분석, 1 μg / ML의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가한다. 세포 수 및 VI를 결정하기 위해 자동 세포 계수기를 사용하여능력. 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 카운터 장치 권장 소프트웨어를 사용합니다. 원래의 음과 양의 분수에 대한 백혈구의 절대 수를 결정합니다.
    주 : 세포 수 분석 취한 시료 1 ㎖ 당 가능한 백혈구 세포 수는 세포 분석기 권장 소프트웨어를 이용하여 결정된다.
  4. 그림 2 (지역 5, 가능한 백혈구)와 같이 영역을 설정합니다. 세포 수를 결정하기 위해 다음과 같은 게이팅 전략을 사용한다. 원래의 분수에서 가능한 백혈구는 그림 2에 표시됩니다.
  5. 다음과 같이 표시 영역 (그림 2, 1-6) 계층은 다음과 같습니다
    1 : 타임 게이트 → 2 : 단일 세포 → 3 : CD45 + 세포 → 4 : 백혈구 (파편 제외) 5 → : 실행 가능한 백혈구 → 6 : 실행 가능한 림프구
  6. 음과 양의 분수에 대한 세포 수를 결정하기 위해 동일한 단계를 반복합니다. 전체 분획물의 세포 수를 계산샘플 분획 (표 2)의 전체 부피의 희석 인자를 고려하여.

분리 성능 4. 시험

  1. 사전 냉장 PBS / EDTA 버퍼 / 0.5 % AB 혈청 QCB, NTCB 및 TCB 분획 세포의 분취 액을 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 대기음.
  2. 포함 된 100 μL 항체, 형광 염색 혼합물에 재현 탁 세포 : CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-를 PerCP, CD20-를 PerCP, CD45-VioBlue 및 안티 IFNγ-PE (역가 1:11)과 4 ℃에서 10 분 동안 어둠 속에서 부화.
  3. 1 ml의 신선하게 제조 된 적혈구 세포 용해 용액 (1X)를 첨가하고, RT에서 15 분 동안 배양한다. 4 ℃에서 5 분 300 XG에 원심 분리기와 뜨는을 대기음. PBS / EDTA 버퍼 / 0.5 % AB 혈청의 적절한 부피로 세포를 재현 탁.
  4. 100 diluti 1 μg의 / ㎖ 직전 분석 (1의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가) 100 μg의 / ㎖의에. 샘플의 순도를 평가하기 위해 유세포 분석을 수행한다.
  5. CCS 농축 처리 후의 긍정적 분획에 도시 된 CD3 + T 세포를 결정하기위한 실행 가능한 백혈구 게이팅 전략 CD3 + T 세포를 계산하는 다음 게이팅 전략을 사용한다. 다음과 같이 표시 영역 (도 3a 및도 3b, 1-6)는 계층 적으로 연결되어있다 :
    1 : 타임 게이트 → 2 : 단일 세포 → 3 : CD45 + 세포 → 4 : 세포 (파편 제외) 5 → : 실행 가능한 백혈구 → 6 : 실행 가능한 CD3 + 세포 인구
  6. CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ +와 CD8 + IFN-γ + CCS 농축 공정 후 T 세포 (표 2)의 주파수를 결정합니다.
  7. F 아래 도시 CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + CD8 + 및 IFN-γ + T 세포의 빈도를 판별 게이팅 전략을 사용또는 CCS 처리 후 원본과 농축 (캡처) 긍정적 인 부분. 다음과 같이 표시된 영역은 계층 적으로 연결되어 이름이 지정됩니다 :
    1 : 타임 게이트 → 2 : 단일 세포 → 3 : CD45 + 세포 → 4 : 세포 (파편 제외) 5 → : 실행 가능한 백혈구 → 6 : 실행 가능한 CD3 + 세포 → 7 : CD4 + 세포 → 7A : CD4 + IFN-γ + 세포 (상자) → 8 : CD8 + 세포 → 8A : CD8 + IFN-γ + 세포 (박스)

주 : 링크 계층의 제 6 표시 영역 (1-6)도 3과 동일하며, 2 영역 최후로도 4 (6-8a)에 나타낸다.

결과

이 연구에서, 자동화 된 세포 농축 CCS 시스템 CMV pp65 유래 특이 T 세포의 자동화 제조에 사용 하였다. CMV 특이 T 세포는 세 성분 채집 셀 제품에서 농축 하였다. 정상 상태의 성분 채집 제품은 10 총 10 핵 세포 (TNC)를 CMV 혈청 검사 양성인 기증자에서 2 시간에 걸쳐 수확 생성되었습니다. 10 9 TNC는 다음의 CMV pp65 유래 유래 펩티드 (60 nmol의) 4 시간 및 T 세포는 자동화 된 세포 농축 장치의...

토론

T 세포 대체 요법은 B 세포 악성 종양을 치료하기 위해 4 실행 가능한 옵션으로 떠오르고있다. 그 치료 가능성은 복제 성 노화 2 부족 표적 항원 특이 T 세포의 수를 주입에 의존한다. 이것은 현재의 양호한 제조 방법을 준수하여 확장 T 세포로부터 항원 특이 T 세포의 순수 인구를 선별함으로써 달성 될 수있다. 두 정렬 절차는 널리 즉, 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)을 정렬 사?...

공개

MD 앤더슨 암 센터 박사 쿠퍼 모두 ZIOPHARM 종양학, Inc. 및 Intrexon 회사에 재무 적 이해 관계를 가지고있다. 2015년 5월 7일에서 박사 쿠퍼는 ZIOPHARM 종양학의 최고 경영자 (CEO)로 임명되었다. 쿠퍼 박사는 지금 MD 앤더슨에서 방문 과학자입니다. 쿠퍼 박사가 설립 그는 인공 뉴 클레아와 Sangamo 생명 과학으로 특허를 보유 InCellerate, 주식을 소유하고있다. 그는 Targazyme, 주식 회사 (이전에 미국의 줄기 세포, 주식 회사), GE 헬스 케어, FERRING 제약, 운명 치료학, 얀센 제약, 브리스톨 - 마이어스 스 퀴브 (BMS)와 참조합니다. 그는 Cellectis의 과학 자문위원회에 있습니다. 그는있는 Miltenyi Biotec은에서 사례금을 받는다.

감사의 말

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children's Foundation.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bagMiltenyi Biotec GmbH700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500Miltenyi Biotec GmbH130-097-182
5 L waste bagMiltenyi Biotec GmbH110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)Miltenyi Biotec GmbH279-01
Albumin (Human) 25% Grifols58516-5216-2
Luer/Spike InterconnectorMiltenyi Biotec GmbH130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L)Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65Miltenyi Biotec GmbH170-076-109
Water for injectionsHospira, inc, Lake Forest, ILNDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm MilliporeSLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bagMiltenyi Biotec GmbH170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material)Miltenyi Biotec GmbH130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec GmbH200-074-400
60 ml Syringes, sterileBD, Laagstraat, Temse, Belgium309653
CMV sero positive apheresis productKey Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry MaterialsManufacturerCatalog number
AB Serum, GemCellGemini Bio-Products, West Sacramento, USA100-512
CD3-FITCMiltenyi Biotec GmbH130-080-401
CD4-APCMiltenyi Biotec GmbH130-098-033
CD8-APC-Vio770Miltenyi Biotec GmbH130-098-065
CD14-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-072
CD20-PerCPMiltenyi Biotec GmbH130-098-077
CD45-VioBlueMiltenyi Biotec GmbH130-098-136
aIFN-γ-PE, humanMiltenyi Biotec GmbH130-097-940
CD3-PEMiltenyi Biotec GmbH130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml)Miltenyi Biotec GmbH130-093-233
EquipmentManufacturerCatalog Number
CliniMACS Prodigy Device Miltenyi Biotec GmbH200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec GmbH130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R Eppendorf AG22331
Cellometer K2Nexelom Bioscience, Lawrence, MALB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIBTerumo Medical Corp., Elkton, MA7811

참고문헌

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