Hemogenic内皮细胞直接诱导和血液中转录因子在人多能干细胞表达

摘要

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

摘要

在开发过程中，造血干细胞源自血管内皮细胞的一个专门的子集，hemogenic内皮细胞（HE）。建模何发展体外为内皮造血过渡和造血规范机理研究必不可少的。在这里，我们描述了用于有效诱导贺从人多能干细胞（hPSCs）由不同组的转录因子表达的方式的方法。 ETV2和GATA1或GATA2转录因子的组合被用于诱导他以泛粒细胞潜力，而GATA2和TAL1转录因子的结合允许生产的贺红系和巨核细胞潜力。加入LMO2到GATA2和TAL1组合显着加快分化，增加红系和巨核细胞的生产。这种方法提供何感应的有效且迅速的方式从hPSCs并且允许进行观测的内皮hematopoieti的在文化菜C的过渡。该协议包括hPSCs转导程序和HE的转导后分析和血液祖细胞。

引言

人多能干细胞（hPSCs）的自我更新和分化为三个胚层，包括血细胞，使它们的有价值的工具为造血发育的机理研究，血液病的模型，药物筛选的独特能力，毒性研究，以及细胞疗法的发展。因为通过内皮的造血转变^1,2血液形成从hemogenic内皮细胞（HE）的胚胎进行，HE的文化的产生是必须研究调节内皮细胞造血转变和造血规格的分子机制。目前的方法进行HE的研究是基于感应hPSCs与造血-支持基质细胞^6,7或在二维培养与细胞外的hematoendothelial分化的聚集体（EBS）通过加入造血细胞因子^3-5，和共培养矩阵和cytokines ^8,9。这些经典的差异化方法的基础上推出的作用于细胞表面和启动的分子途径，最终导致转录程序指导hematoendothelial发展激活级联外部信号。因此，hPSCs分化在这些系统的效率依赖于有效的感应这些信号，信号转导到细胞核，将得到的特定转录调节子活化。此外，他在常规分化培养物中研究需要使用细胞分选分离HE细胞的附加步骤。在这里，我们描述了一个简单的协议，直接诱导HE和血液的造血转录因子的表达。这个方法允许有效地诱导贺在培养皿中并直接观察内皮造血过渡而不使用笨重细胞分选过程的必要性，HE的隔离。

何的形成和血液从人多能干细胞可以通过超表达只是几个转录因子（TF）被有效地诱导。能够从hPSCs诱导强大的泛骨髓造血转录因子的优化组合包括ETV2和GATA1或GATA2。与此相反，GATA2和TAL1的组合诱导erythromegakaryocytopoiesis ^10。通过对这些因素的过度编程hPSCs分化hPSCs直接对VE-CAD ⁺ CD43 ^- CD73 ^- HE细胞逐渐获得 ​​由早期造血标志物CD43 ⁷表达定义的造血型。这种慢病毒为基础的方法的人多能干细胞的方法的直接编程适用于生成HE和血细胞的机理研究，内皮造血过渡研究，和造血发育和说明书的转录调控。虽然C使用，类似的结果可以用改性的mRNA ¹⁰来获得转基因的组成型表达urrent协议描述血液生产。

研究方案

1.病毒制剂和转录因子组合

1. 制备用含有编码蛋 ​​白质的DNA的供ETV2，GATA1，GATA2，TAL1和LMO2（表1）PSIN-EF1α启动慢病毒表达质粒的解决方案。
2. 测量通过记录紫外吸收用分光光度计在230nm，260nm处，和280nm用于慢病毒生产的质粒制备物的浓度和纯度。注:DNA制备展示A260 / 280和A260 / 230的值大于1.8通常被认为是良好的品质。低级A260 / 280值可以指示蛋白污染，而较低的A260 / 230值指示与盐或某些溶剂如苯酚杂质。推荐质粒浓度为1-3微克/微升。
3. 在此前公布的协议¹¹说明生产慢病毒的转导。感应HE与泛粒细胞潜力，需要共同表达ETV2和GATA1，或ETV2和GATA2的。感应HE与赤和巨核细胞潜力需要GATA2和TAL1。加入LMO2的显著改善赤型巨核细胞从hPSCs在GATA2和TAL1 ¹⁰的存在的产率。

2. hPSCs文化协议

1. 传代之前，锐边成长的多能干细胞集落紧至70-80％汇合。马克和删除传代细胞前自发分化的殖民地。
2. 稀释商用细胞外基质凝胶（ 见表 2）根据制造商的说明书和外套6孔板过夜，在4℃，或者用于至少一个使用前小时，在37℃。前传代细胞，吸出基质中，添加2毫升新鲜商业完整culturemedium（ 见表 2），并保持在平板37 _℃，5％的CO 2，直至细胞准备播种。
3. 通道hPSCs
   1. Aspira从6孔板与hPSCs之一汇合井，并添加1.5的预温热的Dispase II溶液忒介质（2毫克/毫升的DMEM / F12中，通过0.22微米的过滤器过滤灭菌）。孵育5-7分钟，在_37℃，5％的CO 2，直至菌落的边缘开始从表面抬起。
   2. 抽吸分散酶II溶液并小心两次加入，然后吸移2毫升新鲜DMEM / F12培养基洗涤菌落。然后，用5ml的血清学玻璃吸管，游离hPSCs用3ml新鲜商业完全培养基（ 见表 2）通过吸取细胞悬液上下数次。
   3. 添加0.5 ml的细胞悬液，每孔一个6孔板含有1.5 ml的商用完全培养基的（ 见表 2）。搅动板来回和从右到左几次，以确保均匀的细胞分布境的板放入培养箱时。保持细胞在_{37℃，5％CO} 2的18-24小时。
   4. 第二天换液，以新鲜的商业完全培养基（ 见表 2），并检查hPSCs形态。成功的传代导致小，良好的附着的菌落保留HPSC形态。 hPSCs必须以2.5-3毫升freshmedium每被馈送孔，每天传代每4-5天在不超过70-80％汇合更多。
      注意:如果人iPS细胞维持在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），它们需要被转移至无饲养条件和传代转导前2-3次，以确保有效的分化。

从hPSCs（0天，hPSCs的转导）3.感应Hematoendothelial Pprecursors的

1. 为了制备反应介质结合1.3商业完整无血清培养基（ 见表 2），病毒，聚凝胺，和Y27632 ROCK抑制剂（表1）:添加1.3微升10毫ROCK抑制剂以1.3毫升培养基至最终concentra灰为10μM，以及聚凝胺至终浓度6微克/毫升。
   1. 在0.5-1.0 MOI每个细胞每种病毒的最终浓度（感染复数）添加病毒浓缩物（S）的一个适当的量。保持反应介质在冰上或在4℃下，直到单细胞悬液是准备好了。
      注:在GATA1 / ETV2，GATA2 / TAL1每种病毒的相同数量的MOI和GATA2 / TAL1 / LMO2的反应混合物是最佳的诱导分化。然而，在ETV2 / GATA2转导培养倍增教学语言GATA2，相对于ETV2，提高差异化。因此，对于这些培养物，比1:为ETV2的MOI和GATA2 1 MOI 2建议（例如，如果病毒的浓缩物，估计大约^6.8×10 7个粒子/ ml，加10微升ETV2和20微升GATA2病毒浓缩物至每ETV2 / GATA2反应^0.68×10 6细胞在6孔板的35毫米孔）。
2. 在单个小区停赛制备hPSCsension。
   1. 如在第2节第4天生长在无饲养条件hPSCs下面的最后一段，观察倒置显微镜下细胞密度和形态。 hPSCs应在紧菌落边缘锋利成长没有自发分化和达到〜60-70％汇合的转导的天。
   2. 吸出培养基，加入1.5-2毫升每孔商用细胞解离试剂（ 表1）和在_{37℃，5％CO} 2的5-7分钟。
   3. 收集细胞分化成商业完全培养基等体积的（ 见表 2）与10μM的ROCK抑制剂的，计数细胞并确定存活率。离心沉淀细胞，在200×g离心5分钟，然后重悬细胞在商业完全培养基用10μM的ROCK抑制剂的每毫升^3.4-5×10 6个细胞的浓度。
      注:细胞活力是成功的病毒转导和随后分化的关键。通常情况下，转导前细胞存活率超过90％。
3. 加入200微升细胞悬浮液，含有0.68-1×10 ^6个细胞 ，成1.3 3.1制备的反应介质的溶液中。
4. 吸在从2.2制备的过夜涂覆6孔板的基质溶液，将反应混合物转移6孔板的一个孔和均匀分布的细胞。在_{37℃，5％CO} 2的24小时。 24小时后，至少80％的细胞应附到基质。

从hPSCs 4.感应Hematoendothelial前体（1-7天）

1. 后24小时转导，除去含病毒的培养基，并与商业的不完整的细胞培养基洗涤附着的细胞（见表1），然后每商业不完全细胞培养介质中含有孔加入3毫升的造血细胞因子:SCF 100纳克/毫升，TPO 50纳克/毫升，20的bFGF纳克/毫升（以下称为3F-介质）。
2. 替换总培养基用新鲜3F-介质上天2,3和4天以去除死细胞和碎片。 4天后，当浮动造血细胞不断涌现，更换一半3F-媒体隔日在保持总量以4ml。
   注:PSIN-EF1α启动慢病毒表达质粒掺入嘌呤霉素抗性基因，从而允许阳性筛选转导细胞。在1μg/ ml的嘌呤霉素的可在第一1-2天的分化被加入到培养基，以消除任何残余的未分化hPSCs。
3. 观察第4天的细胞形态在倒置显微镜下:紧细胞簇与典型的内皮形态的开始出现（ 图2A，3A）。圆形的血细胞似乎从第5天到分化的第7天，而一些地区可能保留hPSCs形态。如下所述分析HE和造血细胞分化。
   注:成功hematoendothelial不同iation导致产生松散地附着到底层平面的内皮细胞显示为折射圆形细胞的血细胞。这些细胞增殖活跃地形成小聚集体，并最终分离和浮子（图2A和3A）。现场的血细胞可以从基于其反射光，并扩大培养条件的能力死者和垂死的细胞在视觉上区分开来。

5.分化Hemogenic内皮细胞（HE）阶段的分析。

1. 用显微镜观察细胞的内皮形态检测何的天3和4分化之间的形成。有没有漂浮的血细胞的培养在这个阶段的分化。何的存在可以通过免疫荧光染色确认，用VE-钙粘蛋白，CD73，CD226和CD43的抗体流式细胞仪分析。
   1. 要在第3天评估流式细胞仪分析使用细胞HE形成4日从一个实验。通过将培养物与商业细胞解离试剂收集细胞（ 见表 1）5-10分钟，在_37℃，5％的CO 2，然后用高达每染色反应^1×10 5个细胞（流式细胞术中所述染色步骤^12）。
      注:VE-钙粘蛋白⁺ HE细胞获得的早期造血标志物CD226表达，但缺乏CD73和CD43 ⁶的表达。与此相反，非何细胞表达CD73（ 图2B，3B）。
2. 免疫荧光染色HPSC源性何。
   1. 洗涤细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）的附单层，然后固定细胞在4％多聚甲醛为30〜60分钟，在室温下进行。
   2. 洗涤细胞再次用PBS清洗，然后透化使用在PBS中的0.1％的Triton X-100进行20分钟，在室温下进行。
   3. 在PBS 2洗涤细胞三次，然后在孵育封闭缓冲液由PBS中，用10％胎牛血清（FBS），30至120分钟。
   4. 制备染色溶液，同时含有初级抗体（1:1000稀释）的小鼠抗人CD43和兔抗人VE-钙粘蛋白在PBS有5％FBS，（ 表1）。
   5. 从细胞吸出封闭缓冲液并添加每染色缓冲孔1ml与添加的初级抗体;孵育3小时，在室温下，或过夜，在4℃。
   6. 加入2毫升的PBS有5％FBS洗涤细胞三次。
   7. 制备第二染色缓冲液，含有二抗以1:500在PBS中稀释有5％FBS:驴抗兔缀合绿色荧光染料，和抗小鼠缀合红色荧光染料（见表1）。加入1毫升每二次染色缓冲井和在室温下孵育1小时。
   8. 无血清洗涤三次，用PBS。染色细胞300nM的DAPI工作液中的dh2 O 10-15分钟。
   9. 用PBS洗涤细胞两次，加2-3毫升的PBS成很好地与着色细胞。观察荧光绿，红，蓝镜过滤器。

诱导造血前体6.分析

1. 维持分化培养物，直到漂浮细胞显著扩大，达10-14天，更换一半3F-介质，如在3.1中描述，每两天。
2. 分离并收集由用市售细胞解离试剂处理的细胞分化的细胞的单层（见表1）在37 5-10分钟 _℃，5％的CO 2。
3. 执行流式细胞仪使用抗VE钙粘蛋白，CD43和CD45抗体，以评估造血培养^12。需要注意的是一个大级分的细胞，至多ETV2和GATA2转导的细胞的40％，共表达VE-CAD和CD43。以下抗体可用于检测以下电子特定细胞谱系xpansion或诱发血液祖细胞分化:CD235a（红细胞），CD41a（巨核细胞），CD32（所有类型的骨髓细胞），CD66b（中性粒细胞）和CD163（巨噬细胞）。
4. 使用根据制造商的说明市售克隆培养基（ 表1）进行的CFC-测定。
   1. 转移^1-2×10 4个细胞于3ml商业克隆培养基（ 见表 3）以评估集落形成细胞和类型的造血集落的数目。最佳接种密度允许单个菌落分别增长相互不重叠的鉴定和分离。接种密度可根据分化效率实验之间有所不同，但应不超过每毫升克隆形成商业介质的^1×10 4个细胞。
   2. 混合细胞克隆商业中由温和的震荡，而传输3毫升悬浮液中，以两张35毫米超低附着菜CFC的试验，1.5毫升悬浮液中每道菜。均匀分布介质和孵育在_{37℃，5％CO} 2的14天。避免干扰的菜;观察第7天及测定第10天的集落形成。
   3. 根据自己的第14天的形态识别和计数造血集落。

结果

HE和从hPSCs通过转录因子过度表达血诱导的示意图示于图1。ETV2与GATA1或GATA2组合诱导泛骨髓造血，而一个GATA2，TAL1 +/- LMO2组合诱导主要赤型巨核造血。这两个TF组合直接诱发HE细胞随后转变为血液祖细胞与造血细胞分化的一个独特的光谱。从多能状态血液hPSCs分化产生，他对平均4天。圆形血细胞首次出现由分化第5天。随后，无数的漂浮的血细胞出现，并扩大在文化。为了?...

讨论

对于hPSCs通过转录因子的过表达造血分化的上述方法，表示了快速和有效的方法为HE和髓系和erytho-magakaryocytic祖细胞的产生由hESCs和iPS细胞，由此允许生产多达30百万血细胞从百万多能干细胞^10。这种方法在多个人类胚胎干细胞和iPS细胞系¹⁰表现出一致的差异。在分化ETV2和GATA2，GATA1因素以及GATA2和TAL1因素，细胞形成的血液产生内皮细胞，他和经历的内皮细胞造血转变。何的形成天3和...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region