ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

要約

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

要約

開発中に、造血細胞は、内皮細胞、造血内皮（HE）の専門サブセットから生じます。 in vitroでのモデルHE開発は、内皮、造血転移の機構研究および造血仕様のために不可欠です。ここでは、転写因子の異なるセットの過剰発現を介して、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）から彼を効率的に誘導するための方法を説明します。 GATA2およびTAL1転写因子の組み合わせは赤血球と巨核球電位とHEの製造を可能にしながらETV2 GATA1およびGATA2またはTFの組み合わせが、汎骨髄電位HEを誘導するために使用されます。 GATA2およびTAL1の組み合わせにLMO2の添加は、実質的に分化を促進し、赤血球および巨核球細胞の生産を増加させます。この方法では、hPSCsからHE誘導の効率的かつ迅速な手段を提供し、内皮hematopoietiの観察を可能にします培養皿のC推移。プロトコルはhPSCsの導入手順およびHEの形質導入後の分析や血液前駆細胞を含んでいます。

概要

自己再生および血液を含む三胚葉の細胞に分化するために、造血開発の機構研究のためにそれらの貴重なツールを作る、血液疾患のモデリング、薬物スクリーニングにヒト多能性幹細胞（hPSCs）のユニークな能力、毒性試験、および細胞の治療法の開発。内皮造血移行^1,2を通じて造血内皮（HE）から胚進行中の血液形成するので、培養液中で彼の世代は、造血移行および造血仕様に内皮を制御する分子メカニズムを研究するために不可欠であろう。 HEの研究のための現在の方法は、造血サイトカイン^3-5、および造血支持する間質細胞^6,7または細胞外の2次元文化のあるhPSCsの共培養を加えた集合体でhematoendothelial分化（したEB）の誘導に基づいています行列やCytokines ^8,9。これらの古典的な分化方法は、細胞表面で作用し、最終的にhematoendothelial発展を導く転写プログラムの活性化につながる分子経路のカスケードを開始する外部信号の導入に基づいています。したがって、これらのシステムでhPSCsの分化の効率は、それらの信号の効果的な誘導、核へのシグナル伝達、および特定の転写調節因子の結果として生じる活性化に依存しています。また、従来の分化培養では、彼の研究は、細胞選別を使用して、HE細胞を単離する追加の工程を必要とします。ここでは、造血転写因子の過剰発現によるHEと血液の直接誘導するための単純なプロトコルを記述します。この方法は、面倒なセルソーティングの手順を使用して、HEを単離を必要とせずに、皿および造血への遷移内皮の直接観察では、彼を効率的に誘導することができます。

ヒト多能性幹細胞からのHE及び血液の形成を効率的にわずか数の転写因子（TFS）を過剰発現させることによって誘導することができます。 hPSCsから堅牢な汎骨髄造血を誘導することができるTFの最適な組み合わせは、ETV2およびGATA1またはGATA2が含まれています。対照的に、GATA2およびTAL1の組み合わせがerythromegakaryocytopoiesis ^{10を誘導します} 。 CD73 ^{- -}徐々に初期造血マーカーCD43 ⁷の式で定義された造血表現型を獲得HE細胞これらの因子の過剰発現を通じてhPSCsのプログラミングは、インクルードは⁺ CD43-CAD VEに直接hPSCsを区別します。ヒト多能性幹細胞法の直接のプログラミングのためのこのレンチウイルスベースの方法は、機構研究、造血への遷移内皮の研究、および造血開発と仕様の転写調節のために、彼と血液細胞の生成に適用されます。 Cが、urrentプロトコルは、導入遺伝子の構成的発現を使用して、血液の生産を記載し、同様の結果が変更されたmRNAの^{10を使用して}得ることができました。

プロトコル

1.ウイルス調製物および転写因子の組み合わせ

1. ETV2、GATA1、GATA2、TAL1およびLMO2のためのタンパク質をコードするDNA（ 表1）を含む PSIN-EF1αレンチウイルス発現プラスミドを含む溶液を準備します。
2. 230ナノメートル、260ナノメートル、および280 nmで分光光度計を用いてUV吸収を記録することにより、レンチウイルス産生のために用いられたプラスミド調製物の濃度および純度を測定します。注：1.8よりも大きなDNA調製実証A260 / 280およびA260 / 230の値は、一般的に良い品質と考えられています。下部A260 / 230の値は、フェノールのような塩またはいくつかの溶媒を用いて不純物を示しながら、低いA260 / 280の値は、タンパク質汚染を示すことができます。推奨プラスミド濃度は、1〜3μgの/μlです。
3. 以前に発表されたプロトコル¹¹で説明したように形質導入のためのレンチウイルスを生成します。汎骨髄可能性を秘めたHEの誘導はETV2およびGATA1、またはETV2およびGATA2の共発現を必要とします。赤血球および巨核球ポテンシャルのHEの誘導はGATA2およびTAL1が必要です。 LMO2の添加は大幅にGATA2とTAL1 ¹⁰の存在下でhPSCsからエリスロ巨核球細胞の歩留まりを向上させることができます。

2. hPSCs培養プロトコル

1. 継代培養前に70〜80％の密集度にシャープなエッジとの緊密なコロニーで多能性幹細胞を増殖させます。マークと削除は、自発的に細胞を継代する前にコロニーを分化しました。
2. 使用前に4℃で、または少なくとも1時間37℃で一晩、製造者の指示及び被覆6ウェルプレートによれば（ 表2参照 ）は、市販の細胞外マトリックスゲルを希釈します。細胞を継代する前に、行列を吸引、新鮮な商業完全culturemediumの2ミリリットルを追加します（ 表2を参照）、37でプレートを保ちます _℃、5％CO 2の細胞が播種のための準備が整うまで。
3. パッセージhPSCs
   1. ASPIRAテhPSCsで6ウェルプレートの1コンフルエントウェルから培地および（0.22μmのフィルターで濾過滅菌したDMEM / F12中2 mg / mlの）予め温めておいたディスパーゼII溶液1.5mlを追加します。コロニーの縁部が表面から持ち上げ始めるまで37℃、5％CO ₂で5~7分間インキュベートします。
   2. 吸引しディスパーゼII溶液を、注意深く追加し、新鮮なDMEM / F12培地2mlを吸引することにより、二回コロニーを洗います。次いで、5 mlの血清ガラスピペットを使用して、細胞懸濁液を上下に数回ピペッティングすることにより（ 表2参照）新鮮な商業完全培地3mLでhPSCsを解離させます。
   3. （ 表2参照 ）は、市販の完全培地1.5 mlを含有する6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を0.5mlを加えます。インキュベーターにプレートを位置づける際に均一な細胞分布を確保するために、前後および左右に数回にプレートを攪拌。 1 37℃、5％CO ₂で細胞を維持します8-24時間。
   4. 新鮮な商業完全培養培地への次の日変化媒体（ 表2を参照）、hPSCs形態を調べます。 HPSCの形態を保持し、小さな、よく付着したコロニーで成功継代結果。 hPSCsは、日常的によくミリリットルfreshmediumあたり2.5〜3で供給され、これ以上の70〜80％以下のコンフルエンスで4-5日毎に継代する必要があります。
      注：hiPSCsは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）で維持した場合は、無フィーダー条件に転送する必要があり、効率的な分化を確実にするために導入する前に2〜3回継代しました。

hPSCsからHematoendothelial Pprecursorsの3誘導（0日目、hPSCsの形質導入）

1. 反応媒体は、市販の完全無血清培地の1.3ミリリットルを組み合わせる調製するためには、ウイルス、ポリブレン、およびY27632 ROCK阻害剤（ 表1）（表2参照 ）：最終concentraに1.3 mlの培地に10mMのROCK阻害剤の1.3μlを添加します10μMの化、および最終濃度6 / mlのポリブレンへ。
   1. 細胞当たり各ウイルスの0.5〜1.0 MOI（感染の多重度）の最終濃度でウイルスの濃縮物（複数可）の適切な量を加えます。単一細胞懸濁液の準備ができるまで氷上または4℃で反応媒体を保管してください。
      注：GATA1 / ETV2、GATA2 / TAL1の各ウイルスにMOIの同じ量、およびGATA2 / TAL1 / LMO2反応混合物は、分化の誘導に最適です。しかし、ETV2に対する相対GATA2のためにMOIを倍増ETV2 / GATA2形質導入された培養液で、差別化を強化します。したがって、これらの培養のために、比1：ETV2のMOIとGATA2の1 MOIのための2を推奨します（例えば、ウイルス濃縮物は、約6.8×10 ⁷粒子/ mlと推定されている場合にETV210μlのとGATA2ウイルス濃縮物の20μlを添加6ウェルプレートの35mmのウェル中の1 ETV2 / GATA2の反応当たり0.68×10 ^6細胞 ）。
2. 単一細胞SUSPにhPSCsを準備ension。
   1. 4日目のセクション2で説明したように最後の通路以下の無フィーダー条件でhPSCsを育て、倒立顕微鏡下で細胞密度および形態を観察します。 hPSCsは、自発的な分化とシャープなエッジとの緊密なコロニーに成長し、伝達の日に〜60〜70％の密集度に到達する必要があります。
   2. 培地を吸引、ウェルあたり市販の細胞解離試薬（ 表1）の1.5〜2ミリリットルを追加し、5-7分間_、5％CO 2で37℃でインキュベートします。
   3. 商業完全培地の等容量に細胞を収集し、細胞をカウントし、生存率を測定、ROCK阻害剤の10μMと（ 表2参照）。その後、ペレット5分間200×gで遠心分離によって細胞とは、1mlあたり3.4から5×10 ⁶細胞の濃度にROCK阻害剤の10μMと商業完全培地中で細胞を再懸濁します。
      注：細胞の生存率は、成功したウイルス形質導入およびその後の分化に重要です。一般的に、導入前の細胞の生存率は90％を超えている必要があります。
3. 3.1で調製した反応媒体の1.3ミリリットルに、0.68から1×10 ^{6個の細胞}を含む、200μlの細胞懸濁液を追加します。
4. 、2.2で調製した一晩コーティングした6ウェルプレートのマトリックス溶液を吸引し、6ウェルプレートの1ウェルに、反応混合物を転送し、細胞を均一に分配します。 24時間、5％CO ₂で37℃でインキュベートします。 24時間後、細胞の少なくとも80％がマトリックスに付着する必要があります。

hPSCsからHematoendothelial前駆体の4誘導（日1-7）

1. 24時間の形質導入後、ウイルス含有培地を除去し、商用の不完全な細胞培養培地で付着した細胞を洗浄した（表1を参照）、造血サイトカインを含有する市販の不完全な細胞培養培地のウェルあたり3 mlを加え：SCF 100ng / mlの、TPOを50 ng / mlで、bFGFを（以下、3F媒体と呼ぶ）20 ng / mlで。
2. 死細胞および破片を除去するために、日2、3、4日目に新鮮な3F-培地で培地全体を交換してください。浮動造血細胞が出現しているときに4 mlの総容量を維持しつつ、4日後、一日おきに3F-培地の半分を交換してください。
   注：PSIN-EF1αレンチウイルス発現プラスミドにより形質導入された細胞の正の選択を可能にピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んでいます。ピューロマイシンを1μg/ mlの任意の残留未分化hPSCsを除去するために、分化の最初の1~2日の間に培地に添加することができます。
3. 倒立顕微鏡下で4日目の細胞形態を守ってください。典型的な内皮形態を有する細胞のタイトなクラスタが現れ始める（ 図2A、3A）。一部の地域ではhPSCsの形態を保持することができる一方でラウンド血液細胞は、分化の7日目に、5日目から表示されます。以下に説明するように、彼と造血分化を分析します。
   注：成功hematoendothelial異なりますiationは緩く、基礎となるフラット内皮細胞に付着したとして屈折丸い細胞を表示された血液細胞の産生をもたらします。これらの細胞は、積極的に小さな凝集体を形成し増殖し、最終的に切り離し、フロート（ 図2Aおよび3A）。生血液細胞は、光を反射し、培養条件に拡張する能力に基づいて、死んだと死細胞から視覚的に区別することができます。

5.分化の造血内皮（HE）ステージの分析。

1. 内皮形態を有する細胞の顕微鏡観察により分化の3日目と4の間にHEの形成を検出します。分化のこの段階での文化には、浮遊血球はありません。 HEの存在は、免疫染色によって確認し、VE-カドヘリン、CD73、CD226、およびCD43抗体を用いたフローサイトメトリー分析することができます。
   1. 3日目にフローサイトメトリー分析用細胞によるHE形成を評価するために一つの実験から4日目。 37℃で5〜10分間（ 表1参照）の商業的細胞解離試薬と培養液をインキュベートすることによって細胞を集め、5％CO _2、次いで（に記載の染色手順フローサイトメトリー染色反応あたり1×10 ^{5個の細胞}まで使用^12）。
      注：VEカドヘリン⁺ HE細胞は初期造血マーカーCD226の発現を獲得するが、CD73とCD43 ⁶の発現を欠きます。対照的に、非HE細胞は、CD73（ 図2B、3B）を発現します 。
2. HPSC由来のHEのための免疫蛍光染色。
   1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞の付着した単層を洗浄した後、室温で30〜60分間の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
   2. PBSで再び細胞を洗浄し、次いで、室温で20分間PBS中0.1％トリトンX-100を用いて透過性。
   3. 3回、PBS 2で細胞を洗浄し、その後でインキュベート30〜120分間、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むPBSからなるブロッキング緩衝液。
   4. 一次抗体の両方を含む、染色溶液を調製する（1：1,000希釈）、マウス抗ヒトCD43およびウサギ抗ヒトVE-カドヘリンをPBS中の5％FBS、（ 表1）を用いて。
   5. 細胞からブロッキング緩衝液を吸引除去して、コメントを追加一次抗体で染色バッファーのウェルあたり1ミリリットルを追加します。室温で3時間、または一晩4℃でインキュベートします。
   6. 5％FBSを含む2mlのPBSを加えることによって、細胞を3回洗浄します。
   7. 5％FBSを含むPBS中で500倍に希釈：ロバ緑色蛍光色素と結合した抗ウサギ、および赤色蛍光色素（ 表1）と結合した抗マウス1で二次抗体を含有する、第二の染色緩衝液を準備します。二次染色バッファーウェルあたり1 mlを加え、室温で1時間インキュベートします。
   8. 血清を含まないPBSで3回洗浄します。 dHで300 nmのDAPI作業溶液で染色細胞10〜15分間2 O。
   9. PBSで2回細胞を洗浄し、染色された細胞をウェルにPBSを2〜3mlのを追加します。緑、赤、青の顕微鏡フィルターで蛍光を観察します。

誘導性造血前駆細胞の6分析

1. 3.1で説明したように、浮遊細胞は、3F-培地の半分を変更し、10〜14日まで、大幅に拡大されるまで2日ごとに、分化培養を維持します。
2. 37℃で5〜10分間（ 表1参照）解離および商業細胞解離試薬で細胞を処理することにより、細胞の単層を分化収集 °C、5％CO _2。
3. 文化¹²で造血を評価するために、抗VEカドヘリン、CD43およびCD45抗体を用いたフローサイトメトリーを実行します。アップETV2とGATA2形質導入した細胞の40％への細胞の大部分は、同時発現するが、VE-CADこととCD43に注意してください。以下の抗体は、E以下の特定の細胞系統を検出するために使用され得ますxpansionまたは誘導された血液前駆細胞の分化：CD235a（赤血球細胞）、CD41a（巨核球）、CD32（骨髄細胞のすべてのタイプ）、CD66b（好中球）およびCD163（マクロファージ）。
4. 製造業者の指示に従ってコマーシャルクローン原性培地（ 表1）を用いて、CFCアッセイを行います。
   1. 商業クローン原性培地3ml中に^1〜2×10 4個の細胞を移すコロニー形成細胞及び造血コロニーの種類の数を評価する（ 表3参照）。最適な播種密度は、互いに別々に成長し、重複しない単一コロニーの同定および単離を可能にします。播種密度は、分化効率に応じて実験間で異なるが、商業クローン原性培地1mlあたり1×10 ^{4個の細胞}を超えてはなりません。
   2. 穏やかにボルテックスにより商業クローン原性培地中の細胞を混合し、2つの35ミリメートルの超低接着ディッシュにサスペンションの3ミリリットルを転送CFCアッセイのため、各皿にサスペンションの1.5ミリリットル。均一媒体を配布し、14日間、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。料理を邪魔しないでください。 7日目、アッセイの10日目にコロニー形成を観察します。
   3. 14日目に、その形態に応じて、造血コロニーを同定し、カウントします。

結果

転写因子の過剰発現によってhPSCsからHE及び血液誘導の概略図は、GATA1またはGATA2組合せで、図1 ETV2に示されている、TAL1 +/- LMO2の組み合わせは主にエリスロ-巨核球造血を誘導GATA2ながら、汎骨髄造血を誘導します。どちらのTFの組み合わせは直接、その後造血分化の明確なスペクトルと血液前駆細胞に変換HE細胞を誘導しました。血液への多能性状態からhPSCsの分化は、彼は平均4日?...

ディスカッション

TFの過剰発現によるhPSCsの造血分化のための上記の方法、それによってより最大30万血液細胞の産生を可能にする、ヒトES細胞やiPS細胞から彼と骨髄とerytho-magakaryocytic前駆細胞の生成のための迅速かつ効率的なアプローチを表し、 1個の百万多能性幹細胞^10。この方法は、複数のhESCと性IPSCライン¹⁰で一貫性のある分化を示しました。 ETV2とGATA2、GATA1の要因だけでなく、GATA2およ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region