Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

Résumé

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Résumé

Au cours du développement, les cellules hématopoïétiques proviennent de un sous-ensemble spécialisé de cellules endothéliales, l'endothélium hemogenic (HE). Modélisation HE développement in vitro est essentiel pour des études mécanistiques de la transition de l'endothélium hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Ici, nous décrivons un procédé efficace pour l'induction de IL partir de cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs) au moyen de la surexpression de différents ensembles de facteurs de transcription. La combinaison de ETV2 et GATA1 ou GATA2 TF est utilisé pour induire un potentiel SE pan-myéloïde, tandis qu'une combinaison de GATA2 et des facteurs de transcription TAL1 permet la production de IL avec érythroïde et mégacaryocytaire potentiel. L'ajout de LMO2 à GATA2 et la combinaison TAL1 accélère sensiblement la différenciation érythroïde et augmente et les cellules mégacaryocytaires production. Cette méthode offre un moyen efficace et rapide de SE l'induction de hPSCs et permet l'observation de l'endothélium hematopoietic transition dans une boîte de culture. Le protocole comprend des procédures hPSCs de transduction et l'analyse post-transduction de SE et des progéniteurs sanguins.

Introduction

La capacité unique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) d'auto-renouvellement et de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, y compris le sang, faire un outil précieux pour les études mécanistiques de développement hématopoïétique, la modélisation des maladies du sang, le dépistage des drogues, Les études de toxicité et le développement de thérapies cellulaires. Parce que la formation du sang dans l'embryon produit à partir de l'endothélium hemogenic (HE) à travers une transition hématopoïétique endothéliale ^1,2, la génération de SE dans les cultures serait essentiel d'étudier les mécanismes moléculaires régulant l'endothélium à la transition hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Les méthodes actuelles pour les études de SE sont basés sur l'induction de la différenciation dans les agrégats hematoendothelial (EBS) avec l'ajout de cytokines hématopoïétiques ^3-5, et de co-culture avec des cellules hPSCs stromales ^{hématopoïèse-6,7} de soutien ou dans des cultures en deux dimensions avec extracellulaire et c matricesytokines ^8,9. Ces méthodes classiques de différenciation sont basées sur l'introduction de signaux externes agissant à la surface de la cellule et d'initier des cascades de voies moléculaires qui conduisent finalement à l'activation du programme de transcription orienter le développement hematoendothelial. Ainsi, l'efficacité de hPSCs différenciations dans ces systèmes repose sur une induction efficace de ces signaux, la transduction du signal vers le noyau, et l'activation résultant de régulateurs transcriptionnels spécifiques. En outre, l'étude de SE dans les cultures de différenciation classiques nécessite l'étape supplémentaire consistant à isoler des cellules SE en utilisant le tri de cellules. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l'induction directe de SE et de sang par la surexpression de facteurs de transcription hématopoïétiques. Cette méthode permet l'induction efficace de SE dans un plat et l'observation directe de l'endothélium à la transition hématopoïétique, sans la nécessité pour l'isolation des SE en utilisant une procédure de tri cellulaire encombrant.

Formation de SE et de sang à partir de cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement induites par la surexpression seulement quelques facteurs de transcription (FT). La combinaison optimale de TFS capables d'induire robuste hématopoïèse pan-myéloïde de hPSCs comprend ETV2 et GATA1 ou GATA2. En revanche, la combinaison de GATA2 et TAL1 induit erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmation hPSCs par la surexpression de ces facteurs différencie hPSCs directement à la VE-cad ⁺ CD43 ^- CD73 ^- HE cellules qui acquièrent progressivement le phénotype hématopoïétique défini par l'expression du début hématopoïétiques CD43 marqueur ^7. Cette méthode basée lentivirus pour la programmation directe de pluripotentes méthode des cellules souches humaines est applicable pour la génération de SE et de cellules sanguines pour des études mécanistes, des études de l'endothélium à la transition hématopoïétique, et la régulation transcriptionnelle du développement hématopoïétique et la spécification. Bien que le cprotocole de dusyst décrit la production de sang en utilisant une expression constitutive des transgènes, des résultats similaires pourraient être obtenus en utilisant l'ARNm modifié ^10.

Protocole

1. préparations de virus et facteur de transcription Combinaisons

1. Préparer des solutions avec pSIN EF1-lentiviral plasmide d'expression contenant l'ADN codant pour la protéine de ETV2, GATA1, GATA2, LMO2 et TAL1 (tableau 1).
2. Mesurer la concentration et la pureté des préparations de plasmides utilisés pour la production lentiviral enregistrement par absorption UV avec un spectrophotomètre à 230 nm, 260 nm et 280 nm. Note: préparations d'ADN démontrant A260 / 280 et A260 / 230 des valeurs supérieures à 1,8 sont généralement considérés comme de bonne qualité. A260 / 280 valeurs inférieures peuvent indiquer une contamination de la protéine, tandis que la baisse A260 / 230 valeurs indiquent les impuretés avec des sels ou un peu de solvant tel que le phénol. Concentration de plasmide recommandée est de 1-3 pg / pl.
3. Produire lentivirus pour transductions comme décrit dans les protocoles précédemment publiés ^11. Induction de SE avec un potentiel pan-myéloïde nécessite co-expression de ETV2 et GATA1 ou ETV2 et GATA2.Induction de SE avec un potentiel erythro- et mégacaryocytes nécessite GATA2 et TAL1. L'addition de LMO2 améliore de manière significative le rendement en cellules érythro-mégacaryocytaire de hPSCs en présence de ¹⁰ GATA2 et TAL1.

2. hPSCs Protocole Culture

1. Cultiver des cellules souches pluripotentes en colonies serrées avec des arêtes vives à 70-80% de confluence avant repiquage. Mark et retirer spontanément différenciées colonies avant passage de cellules.
2. Diluer gel commercial de la matrice extracellulaire (voir le tableau 2) selon les instructions du fabricant et des plaques à 6 puits couche pendant une nuit à 4 ° C ou pendant au moins 1 heure à 37 ° C avant utilisation. Avant de passage de cellules, aspirer la matrice, ajouter 2 ml de milieu de culture commerciale complète frais (voir le tableau 2) et de garder les plaques à 37 ° C, _5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules sont prêtes pour l'ensemencement.
3. HPSCs Passage
   1. Aspirate moyen d'un puits de confluence d'une plaque à 6 puits avec hPSCs et ajouter 1,5 ml de solution dispase II préchauffé (2 mg / ml dans du DMEM / F12, stérilisé par filtration à travers des filtres de 0,22 um). Incuber pendant 5-7 minutes à 37 ° C, 5% CO ₂ jusqu'à ce que les bords des colonies commencent à se soulever de la surface.
   2. Aspirer solution Dispase II et se laver soigneusement les colonies à deux reprises par l'ajout puis aspirer 2 ml de milieu DMEM / F12 frais. Puis, en utilisant un 5 ml sérologique pipette en verre, dissocier hPSCs avec 3 ml de milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) par pipetage suspension cellulaire monter et descendre plusieurs fois.
   3. Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 6 puits contenant 1,5 ml de milieu de culture complet commerciale (voir le tableau 2). Agiter la plaque arrière et de droite à gauche à plusieurs reprises pour assurer une répartition uniforme des cellules où situer la plaque dans l'incubateur. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% CO ₂ pour une8-24 h.
   4. La prochaine moyen de changement de jour dans un milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) et d'examiner hPSCs morphologie. Résultats de passages réussis dans de petites colonies, bien attachés retenue HPSC morphologie. hPSCs doivent être nourris avec 2,5-3 ml par puits freshmedium sur une base quotidienne et un passage tous les 4-5 jours à pas plus de 70-80% de confluence.
      REMARQUE: si hiPSCs ont été maintenues sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), ils doivent être transférés à des conditions exemptes d'alimentation et des passages 2-3 fois avant transduction pour assurer la différenciation efficace.

3. Induction de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (jour 0, la transduction du hPSCs)

1. Pour préparer le milieu de réaction combiner 1,3 ml de milieu sans sérum complète commerciale (voir le tableau 2), le virus, polybrène, et l'inhibiteur de ROCK Y27632 (tableau 1): ajouter 1,3 pi d'inhibiteur de ROCK 10 mM à 1,3 ml de milieu à une concentration finaletion de 10 uM, et de polybrène à une concentration finale de 6 ug / ml.
   1. Ajouter une quantité appropriée de concentré (s) virale à une concentration finale de 0,5 à 1,0 MOI (multiplicité d'infection) de chaque virus par cellule. Garder milieu réactionnel sur de la glace ou à 4 ° C jusqu'à ce que la suspension cellulaire unique est prêt.
      REMARQUE: La même quantité de virus pour chaque MOI dans la GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, et des mélanges de GATA2 / TAL1 / de réaction de LMO2 est optimale pour l'induction de la différenciation. Cultures Toutefois, dans ETV2 / GATA2 transduites doublement MOI pour GATA2, par rapport à ETV2, améliore la différenciation. Par conséquent, pour ces cultures, le ratio 1: 2 pour MOI de ETV2 et une MOI de GATA2 est recommandée (par exemple, si le concentré viral est estimé à environ 6,8 x 10 ⁷ particules / ml, ajouter 10 ul de ETV2 et 20 ul de GATA2 concentrés viraux à 0,68 x 10 ⁶ cellules par une seule réaction ETV2 / GATA2 dans un 35 mm et d'une plaque de 6 puits).
2. Préparer hPSCs en une seule susp cellulaireension.
   1. Cultivez hPSCs dans des conditions exemptes de cellules nourricières, comme décrit dans la section 2. Le jour 4 suivant le dernier passage, observer la densité cellulaire et de morphologie sous un microscope inversé. hPSCs doivent croître en colonies serrées avec des arêtes vives, sans différenciation spontanée et atteindre ~ 60-70% de confluence le jour de la transduction.
   2. Aspirer le milieu, ajouter 1,5-2 ml de réactif commerciale de dissociation cellulaire (tableau 1) par puits et incuber à 37 ° C avec 5% _de CO 2 pendant 5-7 min.
   3. Recueillir des cellules dans des volumes égaux de milieu complet commerciale (voir le tableau 2) avec 10 uM de l'inhibiteur de ROCK, compter les cellules et de déterminer la viabilité. Pellet cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les cellules dans un milieu complet commerciale avec 10 uM de l'inhibiteur de ROCK à une concentration de 3.4-5 x 10 ⁶ cellules par ml.
      NOTE: La viabilité des cellules est essentiel pour la transduction virale réussie et la différenciation ultérieure.Généralement, la viabilité des cellules avant la transduction doit être supérieure à 90%.
3. Ajouter 200 ul de la suspension cellulaire, contenant 0.68-1 x10 ⁶ cellules, dans 1,3 ml du milieu de réaction préparé en 3.1.
4. Aspirer la solution de la matrice de la plaque de 6 puits revêtu nuit préparé en 2.2., Transférer le mélange de réaction à un puits d'une plaque à 6 puits et distribuer les cellules uniformément. Incuber à 37 ° C avec _5% de CO2 pendant 24 heures. Après 24 h au moins 80% des cellules doit être fixé à la matrice.

4. Induction de Hematoendothelial précurseurs de hPSCs (Jour 1-7)

1. 24 heures après la transduction, éliminer le milieu contenant le virus et laver les cellules attachées avec un milieu de culture cellulaire incomplète commerciale (voir le tableau 1), puis ajoutez 3 ml par puits de milieu de culture cellulaire incomplète commerciale contenant des cytokines hématopoïétiques: EFC 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml de bFGF, 20 ng / ml (ci-après dénommé 3F-moyen).
2. Remplacer milieu total avec des produits frais 3F-moyen les jours 2, 3 et 4 jours pour éliminer les cellules mortes et les débris. Après le jour 4, lorsque les cellules hématopoïétiques flottantes apparaissent, remplacer la moitié de la 3F-support tous les jours tout en conservant le volume total à 4 ml.
   NOTE: pSIN-EF1 plasmides d'expression lentiviral incorporent gène de résistance à la puromycine permettant ainsi une sélection positive des cellules transduites. Le 1 ug / ml de puromycine peut être ajouté au milieu au cours des 1-2 premiers jours de différenciation pour éliminer les résiduels des hPSCs indifférenciées.
3. Observez la morphologie des cellules le jour 4 sous un microscope inversé: grappes serrées de cellules ayant une morphologie typique endothéliale commencent à apparaître (Figures 2A, 3A). Globules ronde apparaît du jour 5 au jour 7 de la différenciation, tandis que certaines régions peuvent conserver hPSCs morphologie. Analyser HE et différenciation hématopoïétique tel que décrit ci-dessous.
   REMARQUE: différente hematoendothelial réussieiation se traduit par la production de cellules sanguines qui apparaissent comme des cellules rondes réfractiles attaché de manière lâche aux cellules endotheliales planes sous-jacents. Ces cellules prolifèrent activement à former de petits agrégats, et finalement se détacher et flotteur (Figures 2A et 3A). Cellules sanguines vivantes peuvent être distingués visuellement des cellules mortes et mourantes en fonction de leur capacité à réfléchir la lumière et se développer dans des conditions de culture.

5. Analyse des Hemogenic endothélium (HE) stade de différenciation.

1. Détecter la formation de SE entre les jours 3 et 4 de différenciation par l'observation microscopique des cellules ayant une morphologie endothéliale. Il n'y a pas de globules flottants dans la culture à ce stade de différenciation. La présence de SE peut être confirmée par coloration immunofluorescence et de débit analyse cytométrique en utilisant des anticorps VE-cadhérine, CD73, CD226 et CD43.
   1. Pour évaluer la formation HE par les cellules de l'utilisation de l'analyse de cytométrie en flux au jour 3et quatre jours d'une expérience. Recueillir les cellules par incubation de cultures avec commercial réactif de dissociation cellulaire (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO ₂ et ensuite utiliser jusqu'à 1 x 10 ⁵ cellules par réaction de coloration (cytométrie de flux procédure de coloration décrit dans ^12).
      REMARQUE: VE-cadhérine ⁺ HE cellules acquièrent expression de début hématopoïétique marqueur CD226, mais manque l'expression de CD73 et CD43 ^6. En revanche, les cellules ES non-expriment CD73 (figures 2B, 3B).
2. Immunofluorescence pour HE HPSC dérivés.
   1. Laver la monocouche attachée de cellules avec un tampon phosphate salin (PBS) et fixer ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde 4% entre 30 et 60 min à température ambiante.
   2. Laver les cellules à nouveau avec du PBS puis perméabilisent utilisant 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.
   3. Laver les cellules dans du PBS à deux trois fois, puis incuber àun tampon de blocage consistant en PBS avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de 30 à 120 min.
   4. Préparer la solution de coloration, contenant à la fois des anticorps primaires (1: 1000 dilution) de souris CD43 anti-humain de lapin et anti-VE-cadhérine humaines dans du PBS avec 5% de FBS, (tableau 1).
   5. Aspirer le tampon de blocage à partir des cellules et ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration avec les anticorps primaires a été ajoutée; incuber 3 heures à température ambiante, ou une nuit à 4 ° C.
   6. Laver les cellules trois fois en ajoutant 2 ml de PBS avec 5% de FBS.
   7. Préparer un deuxième tampon de coloration, contenant des anticorps secondaires à dilution 1: 500 dans du PBS avec 5% de FBS: âne anti-lapin conjugué à un colorant fluorescent vert, et anti-souris conjugué à un colorant fluorescent rouge (Tableau 1). Ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration secondaire et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
   8. Laver trois fois avec du PBS sans sérum. Cellules tache avec une solution 300 nM DAPI travail en DH2 O pendant 10-15 min.
   9. Laver les cellules avec du PBS deux fois et ajouter 2-3 ml de PBS dans le puits avec des cellules colorées. Observer la fluorescence avec des filtres de microscope vert, rouge et bleu.

6. Analyse des précurseurs hématopoïétiques induits

1. Maintenir des cultures de cellules flottantes jusqu'à ce que la différenciation se dilatent de manière significative, jusqu'à 10-14 jours, en changeant la moitié de la 3F-moyen, tel que décrit au paragraphe 3.1, tous les deux jours.
2. Dissociation de différenciation et de recueillir des monocouches de cellules par traitement de cellules avec un réactif de dissociation cellulaire du commerce (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO _2.
3. Effectuer cytométrie de flux utilisant des anticorps anti-VE-cadhérine, anticorps CD43 et CD45 pour évaluer l'hématopoïèse dans les cultures ^12. Notez qu'une fraction importante de cellules, jusqu'à 40% des cellules ETV2 et GATA2 transduites, co-exprime VE-CAD et CD43. Les anticorps suivants peuvent être utilisés pour détecter des lignées cellulaires spécifiques suivantes eXpansion ou la différenciation des progéniteurs sanguins induites: CD235a (cellules érythroïdes), CD41a (mégacaryocytes), CD32 (tous les types de cellules myéloïdes), CD66b (neutrophiles) et CD163 (macrophages).
4. Effectuer CFC-dosage clonogénique en utilisant un milieu commercial (Tableau 1) selon les instructions du fabricant.
   1. Transfert 1-2 x 10 ⁴ cellules dans 3 ml de milieu donogene commerciale (voir tableau 3) pour évaluer le nombre de cellules et de types de colonies hématopoïétiques formant colonie. Densité d'ensemencement optimale permet l'identification et l'isolement de colonies uniques qui se développent indépendamment les uns des autres et ne se chevauchent pas. La densité de semis peut varier entre les expériences en fonction de l'efficacité de différenciation, mais ne devrait pas dépasser 1 x 10 ⁴ cellules par 1 ml de milieu donogene commerciale.
   2. Mélanger cellules dans un milieu donogene commerciale par tourbillonnement doux, et transférer 3 ml de suspension à deux 35 mm des plats ultra-faible attachementpour le dosage de CFC, 1,5 ml de suspension à chaque plat. Distribuer uniformément milieu et incuber à 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 14 jours. Éviter de perturber les plats; observer la formation de colonies sur les jours 7 et 10 de dosage.
   3. Identifier et compter les colonies hématopoïétiques selon leurs morphologies sur 14 jours.

Résultats

Le schéma de SE et l'induction de sang de hPSCs par la surexpression de facteurs de transcription est montré dans la figure 1. ETV2 avec GATA1 ou GATA2 combinaison induit hématopoïèse pan-myéloïde, tandis qu'un GATA2, TAL1 +/- combinaison LMO2 induit hématopoïèse principalement érythro-mégacaryocytaire. Les deux combinaisons de TF directement induites cellules ES qui ont transformé ensuite en progéniteurs sanguins avec un spectre distinct de la différenciation hé...

Discussion

La méthode décrite ci-dessus pour la différenciation hématopoïétique de hPSCs par la surexpression de TFS, représente une approche rapide et efficace pour la génération de SE et myéloïdes et erytho-magakaryocytic progéniteurs de CSEh et CSPi, permettant ainsi la production de jusqu'à 30 millions de cellules de sang de un million de cellules souches pluripotentes ^10. Cette méthode présentait différenciation cohérente dans de multiples lignées de CSEh et CISP ^10. Au cours de la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region