隔离和中性粒细胞的表征与抗肿瘤性质

摘要

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

摘要

嗜中性粒细胞，最丰富的全白血细胞在人体循环的，起到对入侵微生物的宿主防御中起重要作用。此外，嗜中性粒细胞在肿瘤细胞的免疫监视中心作用​​。他们必须认识到肿瘤细胞，并诱导肿瘤细胞死亡或者通过涉及过氧化氢，或通过抗体依赖性细胞介导的​​细胞毒性（ADCC）的细胞接触依赖性机制的​​能力。嗜中性粒细胞具有抗肿瘤活性可以从癌症患者和荷瘤小鼠的外周血中分离出来。这些嗜中性粒细胞被称为肿瘤夹带的嗜中性粒细胞（TEN）从健康受试者或天真的小鼠表明，没有显著的肿瘤细胞毒活性的嗜中性粒细胞区分开来。与其他的白血细胞相比，嗜中性粒细胞显示出不同的浮力使得当经受密度梯度它可行，得到> 98％纯的嗜中性白细胞群体。然而，除了到正常的高密度嗜中性白细胞群体脱氮（HDN），在癌症患者中，在肿瘤的小鼠，以及下慢性炎性病症，不同的低密度中性粒细胞种群（LDN）出现在循环中。 LDN共纯化的单核组分，并且可以从使用​​正或负选择策略的单核细胞中分离出来。一旦分离嗜中性粒细胞的纯度通过流式细胞术确定的，它们可以被用于在体外和体内功能性测定法。我们描述的技术用于监测中性粒细胞的抗肿瘤活性，它们的迁移，并产生活性氧，以及监测其吞噬能力的离体的能力。我们进一步描述的技术来标记的嗜中性粒细胞在体内跟踪，并确定其在体内的抗转移能力。所有这些技术是必不可少的理解如何获得和具有抗肿瘤表征嗜中性粒细胞功能。

引言

嗜中性粒细胞被初步定性为它作为对抗入侵微生物的第一道防线的先天免疫细胞。目前已知有中性粒细胞更为深远的功能，被卷入安装适应性免疫反应对抗外来抗原^1,2，调节造血^3，4血管新生和伤口愈合^5。此外，嗜中性粒细胞可影响肿瘤的生长和转移进程凭借自己亲和抗肿瘤活性^6,7。嗜中性粒细胞的特征是多态分段核（因此称为多形核（PMN）白细胞）和含有颗粒的至少三个不同的亚类，以及分泌囊泡^8（ 图1A-C）。

嗜中性粒细胞具有较高的吞噬能力和高NADPH氧化酶的活性微生物消灭批判，并分泌一系列趋化因子在重要的牵引的附加 ​​中性粒细胞和其它免疫细胞到炎症^8,9的部位。嗜中性粒细胞的特征是大量的表面受体，包括Toll样受体（TLR）的表达，C型凝集素受体 ​​（的CLR），补体受体3（细胞CD11b / CD18）和其它粘附分子（ 例如，L-选择LFA-1，VLA-4和癌胚抗原相关细胞粘附分子3（CEACAM3 / CD66b）），趋化因子受体（ 例如，CXCR1，CXCR2，CCR1，CCR2），趋化因子受体（ 例如，PAFR，LTB ₄ R和C5aR的） ，细胞因子受体（ 例如，G-CSFR，IL-1R，IL-4R，IL-12R，IL-18R，TNFR），甲酰基肽受体（ 例如，FPR1-3），和Fc受体（ 例如，CD16（FcγRIII ），CD32（FcγRII），CD64和^{（FcγRI）10。}在小鼠中，中性粒细胞通常被认定为细胞CD11b ⁺ Ly6G ^+，而人类嗜中性粒细胞使用的CD11b，CD15，CD16和CD66b白细胞识别标志。它也被普遍接受染色的颗粒蛋白髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测组织中嗜中性粒细胞。

目前还不清楚是否嗜中性粒细胞的不同功能由同一小区或由不同的细胞亚群介导的。累积的数据表明了异种嗜中性白细胞群体表现出可塑性受促炎性刺激物和微环境^11,12的高度的存在。 Fridlender 等人 ¹³已经严重分割在癌症中的嗜中性粒细胞分成两个主要的亚群称为N1具有抗肿瘤性质和N2与亲肿瘤性质。在癌症中，以及在慢性炎症中，有一个附加的子种群粒髓源抑制细胞（G-肌源性干细胞），该抑制T细胞反应¹⁴组成。 G-肌源性干细胞被认为是其特征在于由一个细胞CD11b ⁺的Ly6C未成熟骨髓细胞^低 Ly6G ^喜表型的小鼠^15，而具有CD15 ⁺ / CD16 ^低人体¹⁶的表型。 G-肌源性干细胞表达更高水平的精氨酸酶和髓过氧化物酶，细胞因子和趋化因子比正常循环中性粒细胞，而较低的水平。他们不太吞噬和游走性，但产生较高水平的ROS ^15,17,18的。在本文中，我们将介绍一些基本的方法进行隔离中性粒细胞具有抗肿瘤特性和表征。

而中性粒细胞构成的所有白血细胞在人体循环的人口最多（45 - 70％; 1800 - 6000 /微升），在小鼠体内，正常情况下，他们是相当稀疏（10 - 15％; 300 - 500 /微升）。嗜中性粒细胞计数增加时炎症稳步偶尔在癌症，它代表的慢性炎症⁷的状态。嗜中性粒细胞多能，从普通的骨髓前体（CMP）CE开发LLS在骨髓，通过分化过程通过原粒细胞的阶段（MB），早幼粒细胞（PM），髓细胞（MC），晚幼（MM）和带细胞^（BC）8。成熟，有丝分裂后的中性粒细胞可以保持骨髓4内- 7日他们被释放到循环⁸之前。嗜中性粒细胞周转在血液通常是迅速，平均半衰期为6 - 12小时，这可能是炎症条件下延长。未刺激的嗜中性粒细胞已通过暴露于佛波醇酯佛波12不限抗肿瘤发生活性，可以通过使幼稚中性粒细胞的趋化因子IL-8（CXCL2），CCL2，CCL5和CXCL5 ^6,19或人工地获取的特征， -myristate 13-乙酸酯^{（PMA）6。}

短半衰期血中性粒细胞与低中性粒细胞数（约3 - 5×10 ^5）取血1ml的天真6实现- 8周旧鼠标，使人们艰难的探索循环中性粒细胞小鼠体外的功能。为了克服这个困难，其他来源的已被使用。例如，大量的中性粒细胞可以从骨髓²⁰或以下无菌炎症的诱导腹膜得到的（ 例如 ，腹膜内注射硫乙醇酸盐肉汤或酵母聚糖A的之后）。应当指出的是，从腹腔得到嗜中性粒细胞不施加任何抗肿瘤发生活性（未发表的观察）。

。Granot酒店等 ⁶观察到BALB / c小鼠接种原位用小鼠4T1乳腺癌细胞系开发嗜中性这恶化了与肿瘤进展^6（ 图2A），以使得20 - 40万血嗜中性粒细胞可以容易地从1毫升血液中分离3 - 第4周后，肿瘤接种。这些嗜中性粒细胞已获得抗肿瘤活性，并因此被瑰奈德肿瘤夹带中性粒细胞（TEN），以便从幼稚中性粒细胞^6（ 图2B）相区别。而高密度的中性粒细胞（HDN， 图1A）是高度抗肿瘤发生，在癌症的情况下产生的低密度中性粒细胞（LDN， 图1B）不是^21。另外，来自肿瘤携带小鼠的骨髓及脾脏高密度的中性粒细胞具有抗肿瘤活性（未发表数据）。应当指出的是，与肿瘤进展脾脏逐渐放大（脾肿大），以增加嗜中性粒细胞的数量。

应当指出的是，也被在癌症包括自发（MMTV-PyMT和MMTV-WNT1乳腺肿瘤和K-ras基因驱动的肺肿瘤）其他模型生成并注射（AT-3（MMTV-PyMT）和E0771乳腺癌TEN细胞，LLC Lewis肺癌细胞和B16-F10黑素瘤细胞）。然而，在这些TUM中性粒细胞动员的程度或模型远比4T1-接种小鼠的少，达到5 - 10×10 ⁶中性粒细胞在1ml血后3周。

研究方案

动物:5-7周龄的BALB / c小鼠自Harlan（以色​​列）购得。所有涉及的动物实验均批准了希伯来大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。人类样本:采集血液癌症患者和健康志愿者被批准哈达萨医疗中心机构审查委员会（IRB）。

1.诱导中性粒细胞在体内抗肿瘤特性使用乳腺癌小鼠模型。

注:应使用无菌溶液在层流（LAF）生物安全柜中进行的所有步骤。

1. 种子5×10 ⁵个4T1细胞在100mm组织培养板在10ml Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中含有4.5g / L的D-葡萄糖补充有10％热灭活的小牛血清（FBS），2mM的D-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U / ml青霉素G和100微克/ ml硫酸链霉素。第孵育在含5％CO ₂的3至4天的潮湿培养箱E细胞在37℃。确保细胞是50 - 在实验当天100％汇合。
2. 分离从组织培养板中的肿瘤细胞，吸出培养基，用5ml PBS洗涤细胞，吸出PBS，并添加2.5克/升胰蛋白酶溶液3毫升孵育细胞2 - 3分钟，用胰蛋白酶在37ºC。
3. 加10ml含有血清的培养基中，以中和胰蛋白酶和吸管上下，直到所有的细胞已被分离。转移的细胞悬浮到15ml锥形离心管中。
4. 离心细胞，在200×g离心5分钟，在室温。吸留200上面的细胞沉淀微升培养基中的介质。悬浮细胞中的残留量和加入10毫升的PBS。倒置管2 - 3次，以获得均匀的细胞悬浮液，并取出10微升到计数细胞在血细胞计数器。使用台盼蓝活的和死的细胞之间进行区分。
5. 离心细胞悬浮液5分钟，在200×g离心在RT。吸出PBS中并悬浮细胞于PBS中的2×10 ⁶个细胞/ ml的终浓度。确保单细胞悬浮液没有结块。
6. 注入1×10 ⁶个4T1细胞或荧光素酶表达4T1细胞在50μlPBS中原位成使用0.3毫升注射器用30G x8毫米针雌性BALB / c小鼠的左腹股沟乳腺脂肪垫。
   1. 注射前，麻醉小鼠在感应腔室接收异氟烷缓慢的流速（3 - 5％）在100％的氧。
   2. 莱鼠标在无菌手术垫，并确保头妥善安置异氟醚鼻锥内。按捏爪子确认正确的麻醉。使用对眼睛的兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。剃注射部位周围的头发和消毒用70％乙醇。
   3. 使用无菌一套手术工具，使一个小切口的水平（5毫米）的约腹股沟和腹部乳头之间imately一半的方式，暴露脂肪垫并注入1×10 ⁶个4T1细胞在50μl。关闭与应一周后取出9毫米剪辑的切口。注射萤光素酶表达细胞的允许监测肿瘤的大小和转移由生物发光成像。
      注意:此微创过程不需要任何手术后的治疗，并将注入的小鼠在2回收 - 3分钟。
   4. 监测小鼠，直到他们恢复意识，并确保他们重新获得加盟其他老鼠的公司前全意识。
7. 3后- 4周，当原发肿瘤已经达到2 cm ³的体积，牺牲小鼠慢_的 CO ₂流，并最后一口气后，立即用一25G x 5/8"针头获得血液通过心脏穿刺连接到1毫升结核菌素注射器预处理肝素。保持在针的口朝上插入时的通过朝向心脏隔膜注射器在水平位置，并缓慢和逐渐绘制血液避免过高的压力（ 图3）。

2.中性粒细胞分离

1. 隔离从血液肿瘤的小鼠的细胞毒性的中性粒细胞。
   1. 稀释1毫升血液从荷瘤小鼠进行拉伸（见协议1.11）在PBS中含有0.5％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA），以6 ml的终体积。
   2. 分级对新鲜烹制的连续蔗糖梯度稀释血液:
      1. 加入3毫升无菌过滤的蔗糖1.119克/毫升到15毫升锥形聚丙烯离心管的底部。
      2. 慢慢地，小心地，3层毫升无菌过滤的蔗糖1.077克/毫升的1.119克/毫升层的顶部。此后，在1.077克/ ml的层（ 图4A）的顶部缓慢且小心地添加6毫升稀释血液（协议2.1.1）。建议保持倾斜管和一个dding不同的组件通过缓慢，但连续流动，保持吸管的嘴朝向管的下壁，使得没有湍流形成。
   3. 离心含有对蔗糖梯度稀释血液于700×g离心30分钟，在RT下无制动管。
   4. 小心取出离心管，而不会导致任何动荡。大部分的红细胞将在管的底部。高密度的中性粒细胞（HDN）被发现，其为白色到红色环在1.119克/毫升和1.077克/ ml的层（约3 ml刻度）之间的界面，而低密度白细胞被发现在一个白色的环在1.077克/ ml的层和含BSA的PBS之间的界面（约6 ml刻度，参见图4B）。
   5. 吸出PBS + 0.5％BSA中，直至达到5mm处低密度细胞层的上方。吸取出来的低密度细胞通过缓慢吸入1毫升尖通过围绕细胞慢慢漩涡状。转移细胞为30个毫升的PBS与0.5％BSA的。
   6. 吸在相同的梯度管的上层，直至到达上方5mm高密度细胞带。吸取出来的高密度细胞，这是主要的高密度的中性粒细胞，并将细胞转移到30毫升PBS中含有0.5％BSA。
   7. 离心细胞，在400×g离心在室温10分钟。
   8. 重新悬浮细胞36毫升无菌HPLC级水30秒吸出上清液并裂解红细胞。等渗应通过加入9毫升5倍的还原浓缩的PBS补充有2.5％（重量/体积）BSA中。
   9. 离心细胞，在400×g离心在室温10分钟。
   10. 吸出上清液，并将细胞重新悬浮在PBS-BSA中。计数嗜中性粒细胞的数量在血细胞计数器，并使用台盼蓝活的和死的细胞之间进行区分。
   11. 离心细胞，在400×g离心在室温10分钟，并重新悬浮于期望的温育培养基中的嗜中性粒细胞，以最终细胞密度。使用立即中性粒细胞。
   12. 然后，再次离心分离后，悬浮在培养介质中的嗜中性粒细胞，以最终细胞密度。立即使用中性粒细胞。
2. 从分离肿瘤患者循环中性粒细胞。
   1. 混合10毫升肝素（20U / ml）的人血液与3％葡聚糖T500在盐水等体积并孵育在室温30分钟。在此孵化的红细胞沉降会。
   2. 准备一个50ml锥形聚丙烯管，用10ml蔗糖1.077克/ ml和慢慢层的富白细胞的上清液上1.077克/ ml的蔗糖层（ 图4C）的顶部。
   3. 离心在400×g离心30分钟，在RT下无制动。高密度的中性粒细胞（HDN）将出现在颗粒。低密度中性粒细胞（LDN）与单核细胞和淋巴细胞共纯化的1.077克/ ml的蔗糖层和血浆（ 图4D）之间的接口。
   4. 悬浮的嗜中性粒细胞在10毫升0。2％的NaCl持续30秒以溶解所述污染的红细胞，并通过加入10ml 1.6％NaCl中的恢复等渗性和反转一次。
   5. 离心5分钟，在160×g离心在RT，并在20ml的Hanks'平衡盐溶液洗涤三次。每次洗涤后离心机吸出上清液。
   6. 算的中性粒细胞和悬浮细胞在RPMI-1640补充有2％FBS的2×10 ⁶中性粒细胞/ ml或根据需要。

3.富集血中性粒细胞使用磁珠

1. 正选择
   1. 取从小鼠1ml血液中协议1.8所述，用肝素化的注射器中。
   2. 离心血液在15ml锥形管中，在400×g离心5分钟，在RT。
   3. 吸出上清液或维持血浆进行进一步的研究。
   4. 裂解的红细胞通过在8ml HPLC级水重悬细胞。 30秒后，通过加入2ml 5×conce的恢复等渗含ntrated PBS 2.5％BSA。计数细胞。
   5. 离心在400×g离心5分钟，在RT。
   6. 重悬含有0.5％BSA和每10 ⁸个细胞2mM EDTA的细胞沉淀在200微升PBS中。
   7. 加入50微升生物素标记的抗Ly6G抗体。拌匀在冰箱（未在冰上）孵育10分钟。
   8. 添加150微升含0.5％BSA和2mM EDTA的冷PBS。
   9. 涡流的抗生物素涂覆的磁性微珠原液。转移100μl到细胞悬浮液。拌匀在冰箱（未在冰上）孵育15分钟。
   10. 通过加入含有PBS中0.5％BSA和2mM EDTA和离心机在400×g离心在室温10分钟10毫升洗涤细胞。
   11. 吸去上清液完全，并且重悬在500微升冷PBS含有0.5％BSA和2mM EDTA中。
   12. 插入一个磁性分离柱成附连到磁性底座的磁体保持器，并用500μL冷PBS含0冲洗。5％BSA和2mM EDTA中。
   13. 应用该细胞悬浮液上柱。流过的包含未标记LyG6阴性细胞。
   14. 用含有0.5％BSA和2mM EDTA的500μl的PBS洗涤该柱。额外未标记细胞将在通过的流动。
   15. 重复洗涤步骤用含有0.5％BSA和2mM EDTA的另外500微升的PBS。
   16. 从磁体取出柱，并将其放置在一个15毫升的收集管。加含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS中1毫升，并冲洗出磁性标记的细胞牢固地推动活塞到列。流通过包含Ly6G ⁺中性粒细胞。
2. 阴性选择
   1. 按照步骤3.1.1到3.1.5备血白细胞。
   2. 重悬1×10 ⁸个细胞的1ml PBS中含有5ml的聚苯乙烯圆底管0.5％BSA和2mM EDTA中。
   3. 加入50微升正常大鼠血清。
   4. 加入50微升中性粒细胞富集Çocktail（包含特定非中性粒细胞白血细胞生物素化抗体），拌匀孵育在冰箱15分钟。
   5. 加入4毫升含有的PBS 0.5％BSA和2mM EDTA和离心机400×g离心10分钟清洗菌体。
   6. 弃去上清液并将细胞重新悬浮于1ml含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS中。
   7. 加入50微升的针对生物素和葡聚糖四聚抗体复合物。拌匀，孵育在冰箱10分钟。
   8. 涡流孔含有葡聚糖 - 包被的磁珠加入150微升细胞悬浮液中之前的管。拌匀，孵育10分钟，在冰箱中。
   9. 通过加入含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS使细胞悬浮液以2.5毫升的总体积。轻轻混匀，以获得均匀的细胞悬浮液。
   10. 插入管（无盖）到磁体，静置3分钟。
   11. 倒置磁铁与管子在一个连续运动，使得未结合的细胞中的流体将被转移到新的管中。离开磁铁和管倒2 - 3秒，然后回到直立位置。磁性标记不想要的细胞将仍然结合到原管的壁上，而该未结合的中性粒细胞会在传送流体。

中性粒细胞的细胞学4.染色

1. 重悬1×10 ⁵嗜中性粒细胞在50μlPBS中，将细胞悬液转移到薄层细胞制备适配器诸如细胞离心涂片。离心在150×g离心适配器5分钟。分离从适配器预标记的载玻片上。
2. 通过浸渍玻片在70％乙醇2分钟，固定细胞。允许从适配器（见步骤4.1）的准备工作，以在室温染色前晾干。浸载玻片5 - 6次蒸馏水。
3. 染色1 - 梅耶的苏木素液2分钟。冲洗自来水中1分钟。染色10秒，曙红Y解 。在自来水冲洗。通过漂洗中增加的乙醇浓度的幻灯片（70％，96％和100％）脱水。让载玻片风干不久并检查在光学显微镜下的幻灯片。
   注:苏木有一个深蓝色，紫色和污渍核酸，而伊红是粉红色的污渍和非特异性的蛋白质。嗜中性粒细胞的胞质颗粒仍然由酸性或碱性染料，它是原点为名称"爱是中性的"不染色。而嗜碱性粒细胞染色深蓝色HE染色和eosinophilc粒细胞鲜红色，中性粒细胞出现中性粉色（ 见图1a）。成熟嗜中性粒细胞的特征是多形核，这是在一般大2 - 5裂片'分段中性粒细胞'（ 图1A和1C）。未成熟粒细胞的特征在于通过一叶形弯曲的或环状的核（ 图1B）。

ve_title"> 5。中性粒细胞的流式细胞仪检测纯度的测定。

1. 重悬在100μlFACS缓冲液（含有0.5％BSA，2毫摩尔EDTA和0.02％NaN ₃的PBS）中1×10 ^6个细胞。对于全血样本，溶血之前需要染色（步骤3.1.1至3.1.5）。加10微升FcR阻断剂的5分钟。
2. 0.5添加荧光标记的抗体微克用特异性阮文黎-6G鼠标中性粒细胞或CD11b和CD66b的人中性粒细胞，拌匀孵育15分钟在室温。
3. 调整体积至500微升用含0.5％BSA和2mM EDTA的PBS中并通过流式细胞术分析染色。

6.按照中性粒细胞门体内

1. 在嗜中性粒细胞的体内 BrdU标记
   1. 注入100微升10毫克/毫升的溴脱氧尿苷（BrdU）标记在无菌PBS溶液腹膜内给荷瘤小鼠。
   2. 隔离血嗜中性粒细胞48小时后喷射一ccording议定书2.1。染色的BrdU标记使用的BrdU流动试剂盒中性粒细胞。
2. 嗜中性粒细胞的CFSE标记
   1. 悬浮10 ⁷嗜中性粒细胞在1ml预热的PBS。
   2. 加入2微升的5mM CFSE原液悬浮嗜中性粒细胞，以10μM的终浓度。拌匀，孵育15分钟，在37℃。在1毫升DMSO中的5mM CFSE通过溶解2.8毫克的CFSE的（羧基二乙酸酯，琥珀酰亚胺基酯 - - ）5-（和6）制备。在-20℃下分成在无菌200μl的管和储存10微升等分试样在黑暗中。
   3. 通过加入含有10％FBS的RPMI-1640等体积的中和过量的CFSE。孵育10分钟，在37℃。离心嗜中性粒细胞在400×g离心在室温10分钟。在含有10％FBS10毫升的RPMI-1640洗两次的中性粒细胞。
   4. 在PBS中的适当体积离心，在400×g离心10分钟，重悬。嗜中性粒细胞（ 例如，1×10 ⁷个细胞）现在可以静脉注射或通过心脏注射到受体小鼠注射。

7. 在体外萤光素酶测定来监测隔离中性粒细胞的抗肿瘤活性。

1. 培育荧光素酶标记的肿瘤细胞作为在协议1.1-1.5描述为4T1细胞，但悬浮胰蛋白酶解离细胞在最优化缩小血清培养基补充有2％FBS中。调整细胞密度为每毫升5×10 ⁴个细胞。
2. 种子5000荧光素酶标记的肿瘤细胞在100μl优化缩小含有0.5％FBS的白色96-平底组织培养孔板的每个孔中的血清培养基。
3. 4小时接种肿瘤细胞后，在含有0.5％FBS的50μl的最优化缩小血清培养基添加1×10 ⁵嗜中性粒细胞，并孵育O / N。准备一个中性粒细胞悬浮液以2×10 ⁶细胞/ ml的密度。对照孔应该得到50微升介质中无嗜中性粒细胞。办多次重复每个实验的设置。
4. 在第二天早上，轻轻吸出上清液，用200微升PBS洗好每个。吸出PBS，加入50微升被动裂解液。对于易分离的细胞（如AT-3细胞），不要在PBS洗，并立即吸出生长培养基后添加细胞培养裂解液。
5. 覆盖板用铝箔和孵育它在轨道摇床上以150rpm进行20分钟，在RT。
6. 将板在发光板读数器。注入以及明智的50微升荧光素酶检测解决方案，并宣读了化学发光每孔10秒。
7. 由下式计算％的肿瘤裂解:％肿瘤裂解=（1- [与嗜中性粒细胞的样品的发光] / [在介质样品的发光]）×100％。

注:为了评估中性粒细胞转移播种的贡献，中性粒细胞可在协议8.1所述被耗尽。为了有效DEPL奥迅管理中性粒细胞消耗抗体在开始后第7天的肿瘤细胞植入。

中性粒细胞在乳腺癌小鼠模型8.抗转移活性。

1. 在中性粒细胞体内枯竭。
   1. 新鲜制备12.5微克大鼠抗Ly6G抗体（嗜中性粒细胞消耗性抗体）或大鼠同种型对照抗体（IgG抗体_2a中 ，Κ）在盐水中以每只小鼠100微升的最终体积。
   2. 开始后第3天肿瘤植入每日注入12.5微克大鼠抗Ly6G抗体（100微升）腹膜内剂量。注射对照组小鼠或12.5微克（100微升）大鼠同种型对照抗体（IgG _{2A，Κ）。}
   3. 开始第14天，每天两次施用的抗体，作为嗜中性粒细胞的生产速率时，4T1肿瘤生长显着地增加。
   4. 隔日，取得血液样本（2 - 3滴）由切口侧尾静脉。采集血液进入反含有管-coagulant（肝素，柠檬酸盐或EDTA）。
   5. 使用流式细胞仪的协议中说明5中性粒细胞验证枯竭。
2. 肿瘤中和试验（改良温测定）
   1. 隔离荷瘤小鼠嗜中性粒细胞。拌1×10 ⁶个肿瘤细胞和3×10 ⁶中性粒细胞在50μl盐水（每只小鼠）。
   2. 注入细胞皮下注射到6侧翼 - 8周龄幼稚BALB / c小鼠。剃须前侧翼肿瘤植入，使肿瘤大小的精确测量。测量肿瘤大小每天在出发后第5天移植。
3. 嗜中性粒细胞过继转移
   1. 注入2×10 ⁴荧光素酶表达的肿瘤细胞在200μlPBS中至尾静脉。
   2. 嗜中性粒细胞转移应执行4小时以下肿瘤细胞注射。因此，约2小时，他们计划在开始前HDN从荷瘤小鼠（2.1协议）的净化体内转移。重悬在PBS中的中性粒细胞以2.5×10 ⁷个细胞/ ml的终浓度。
   3. 引进肿瘤细胞后4小时将小鼠在5分钟加热灯。将小鼠在阻挡器，并通过尾静脉注射5×10 ⁶ HDN（200微升）。对照小鼠注射载体（PBS）。
   4. 通过体内成像系统或通过免疫组织化学使用生物发光监视肺转移在不同时间点的形成。
4. 肺转移播种法
   1. 注入0.5 - 1×10 ⁶个亲本4T1细胞原位进入左腹股沟乳腺脂肪垫如方案1所述。
   2. 在第10天，重悬表达GFP的4T1细胞在PBS中的^5×10 5细胞/ ml的终浓度。将小鼠在5分钟加热灯。
   3. 将小鼠在阻挡器和注入1×10 ⁵表达GFP的4T1细胞（200微升）静脉内给4T1荷瘤小鼠或幼稚小​​鼠。
   4. 在接下来的一天，安乐死的小鼠和灌注用20ml的PBS肺以除去剩余的红细胞。
   5. 切除肺部GFP阳性细胞通过免疫组织化学分析。
      注:为了评估中性粒细胞转移播种的贡献，中性粒细胞可在协议8.1所述被耗尽。为有效耗尽施用嗜中性粒细胞消耗抗体开始后第7天肿瘤植入。

9.抑制T细胞增殖的中性粒细胞从荷瘤小鼠。

1. 取下一个安乐死的天真BALB / c小鼠和地点脾脏在10毫升PBS。
2. 将脾到40微米的细胞滤网即配合在培养皿填充用RPMI-1640。使用注射器的柱塞端，捣碎脾通过细胞过滤器进入培养皿。冲洗细胞过滤用5ml RPMI中。丢弃的过滤器。
3. 转移的悬浮细胞到50ml锥形管中，并离心400×g离心10分钟。
4. 弃去上清液，并且通过将细胞悬浮成36种毫升纯水进行20秒溶解红细胞，并通过添加调整到等渗4毫升PBS中浓缩x 10.替代地，通过将​​细胞悬浮溶解红细胞到5ml红细胞裂解缓冲液（ACK），并孵育5分钟，在室温。通过加入10ml的RPMI-1640培养基中和所述ACK。离心在400×g离心在室温10分钟。悬浮细胞在5ml PBS中并计数细胞。
5. 重悬在PBS中的脾细胞以4×10 ⁷个细胞/ 2毫升在15毫升管的最终密度。加入2毫升在PBS中的2.5微米的CFSE溶液。快速翻转试管孵育10分钟，在37℃偶尔混合（每2分钟），避光。
6. 猝灭过量的CFSE通过加入4毫升预温热的FBS（100％）的孵育在室温下1分钟。添加3mL的PBS和离心机在400×g离心10分钟。
7. 在400×g离心洗细胞用30ml PBS中，离心10分钟。
8. 通过40微米的细胞滤网过滤细胞，用PBS再次洗涤。
9. 将细胞重悬于RPMI-1640培养基补充有10％FBS的为2×10 ⁷个细胞/ ml的终密度。
10. 种子2×10 ⁶ /孔（200微升）在24孔组织培养板。
11. 通过加入1微克纯化的亚美尼亚仓鼠抗小鼠CD3ε抗体在500μlRPMI-1640含10％FBS刺​​激的细胞。
12. 有10％FBS添加2×10 ⁶ HDN或LDN在300微升的RPMI-1640的CFSE标记的脾细胞，并孵育3天，在37℃。掘井无嗜中性粒细胞应该得到300微升介质。在每孔总体积应为1毫升
13. 收集细胞，并将它们准备流式细胞仪。将细胞重悬于100μl的FACS缓冲液（协议5），并添加10微升FcR阻断剂的。孵育5分钟，在RT。
14. 加1＆＃956;升APC标记的抗CD8α抗体孵育15分钟，在RT。
15. 确定CD8 ^{+ T}细胞通过流式细胞术（ 图5）的CFSE荧光强度。在每次细胞分裂的CFSE强度减半。因此，细胞分裂的数量可以通过CFSE染色的强度确定。

10.中性粒细胞迁移实验

1. 种子^{5×10 5} 4T1细胞在7ml优化缩小血清培养基补充有0.5％FBS中的25cm ²组织培养烧瓶中，并培养24小时，在37℃下。
2. 转移800微升上清液到迁移板的底腔具有5微米的孔尺寸。
3. 重悬2×10 ⁵嗜中性粒细胞在400μl的最优化缩小血清培养基补充有0.5％FBS中。应用该细胞悬液，以顶室孵育2小时，在37℃。
4. 在温育结束时，除去顶部室和算已迁移至底室嗜中性粒细胞的数量。

11.监测中性粒细胞生产活性氧（ROS）。

1. 制备1.1×10 ⁶中性粒细胞/中Hank氏平衡盐溶液无酚红。板180微升含有在一个白色96-平底孔平板的每个孔2×10 ⁵嗜中性粒细胞。
2. 将板在发光板读数器。在PBS中加入20微升的500μM的鲁米诺溶液，以每孔以获得50微米的最终浓度。阅读基础化学发光1秒在5分钟的时间过程，用10秒的间隔。
3. 添加一种兴奋剂（ 例如，PMA以10nM或100nM或fMLP的浓度为10μM的浓度）。制备的Hank氏平衡盐溶液每剂的10倍浓溶液不含酚红并添加22微升到各孔中。为了控制井添加22微升的车辆。
4. Measu再在板读数器的发光。两者都做一​​个短的（每10秒，5分钟）和长（每分钟1小时）的时间过程。

结果

在最近的研究中，我们确定了一个抗转移功能，中性粒细胞^6。从荷瘤小鼠嗜中性粒细胞获得细胞毒性表型并具有杀灭肿瘤细胞⁶的能力。这是相对于那些没有显著抗肿瘤作用⁶从天真的小鼠嗜中性粒细胞。几个在协议部分中描述的技术已被用于在体外和体内 ⁶研究抗肿瘤嗜中性粒细胞的功能。

肿瘤细胞毒性的中性粒细胞可以从肿瘤?...

讨论

嗜中性粒细胞是最丰富的全白血细胞，并且是在感染和炎症的情况下，第一反应者。因此，它们是外部线索高度敏感，并且容易激活。此外，嗜中性粒细胞具有非常短的半衰期和快速周转。总之，这些特点提高一些困难与中性粒细胞，这种独特的实验策略是必需的工作。例如，有几个中性粒细胞纯化策略，每一个都有自己的优点和缺点。

在中性粒细胞工作的一个关键步骤是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12x75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11