Anti-tümör özelliklere sahip izole edilmesi ve nötrofil Karakterizasyonu

Özet

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Özet

Nötrofiller insan dolaşımda bulunan tüm beyaz kan hücreleri en çok bulunan, mikroorganizmalara karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, nötrofiller, tümör hücrelerinin immün gözetim merkezi bir rol oynar. Bunlar ya hidrojen peroksit ya da antikor-bağımlı hücre-aracılı sitotoksisite (ADCC) yoluyla kapsayan bir hücre teması-bağımlı mekanizma yoluyla tümör hücre ölümünü tümör hücrelerini tanıyan ve indükleme yeteneğine sahiptir. Anti-tümör aktivitesi olan nötrofiller, kanser hastalarının ve tümör taşıyan farelerin periferal kanından izole edilebilir. Bu nötrofiller önemli bir tümör sitotoksik aktivite gösteren sağlıklı bireylerden veya naif farelerin nötrofillerden ayırmak için, tümör tutulan nötrofilleri (TEN) olarak adlandırılır. Diğer beyaz kan hücreleri ile karşılaştırıldığında, nötrofiller, bir yoğunluk gradyanına tabi tutulduğunda bu mümkün a>% 98 saf nötrofil popülasyonu elde etmek için olan farklı kaldırma kuvveti göstermektedir. Bununla birlikte, ek olarakNormal yüksek yoğunluklu nötrofil nüfus (HDN) için, kanser hastalarında tümör-taşıyan farelerde, hem de kronik iltihaplı koşullar altında, belirgin bir düşük yoğunluklu nötrofil popülasyonları (LDN) dolaşım görünür. LDN mononükleer fraksiyonu ile birlikte arındırmak ve pozitif ya da negatif seçim stratejileri kullanılarak, tek çekirdekli hücrelerden ayrılabilir. Yalıtılmış nötrofiller saflığı akış sitometrisi ile belirlendikten sonra, bunlar, in vitro ve in vivo fonksiyonel deneylerde kullanılabilir. Biz, nötrofil, anti-tümör aktivitesini izlemek için yeteneklerini geçirmek için ve reaktif oksijen türlerini üretmek için, yanı sıra fagositik kapasitesi ex vivo olarak izleme teknikleri tarif eder. Biz ayrıca in vivo izlenmesi için nötrofilleri etiketlemek için teknikleri açıklar, ve in vivo olarak anti-metastatik kapasitesini belirlemek için. Bütün bu teknikler elde etmek ve anti-tümör ile karakterize nötrofilleri nasıl anlamak için gereklidirişlevi.

Giriş

Nötrofiller başlangıçta işgal mikroorganizmalara karşı ilk savunma hattı olarak hizmet doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olarak karakterize edildi. Bugün, nötrofiller daha fazla işlevleri geniş kapsamlı olduğu bilinmektedir, yabancı antijenlere karşı ^1,2 adaptif immün yanıtları montaj hematopoezisi ^3, anjiyogenez ⁴ düzenleyen ve ⁵ yara iyileşme müdahil olma. Buna ek olarak, nötrofiller bunların pro- ve anti-tümör faaliyetleri ^6,7 sayesinde, tümör büyümesi ve metastaz ilerlemesini etkileyebilir. Nötrofiller, bir polimorfik segmentli çekirdeği ile karakterize edilir (bu nedenle polimorfonükleer (PMN) lökositlerin olarak da adlandırılır) ve en az üç granül ayrı alt sınıfları gibi salgı vezikülleri ⁸ (Şekil 1A-C) ihtiva ederler.

Nötrofiller, yüksek fagositik kapasitesi ve mikrobiyal ortadan kaldırılması için kritik yükseğe NADPH oksidaz aktiviteye sahip olan, ve en önemli kemokinlerin geniş salgılayanEk nötrofil ve inflamasyon ^8,9 sitesine diğer bağışıklık hücrelerinin çekiş. Nötrofiller Toll benzeri reseptörler (TLR), dahil olmak üzere, yüzey reseptörleri büyük miktarda ekspresyonu ile karakterize edilir, C-tipi lektin Reseptörler (CLRs), reseptörü 3 (CD11b / CD18) ve diğer yapışma molekülleri (örneğin, L-selektin güzelleştirmek LFA-1, VLA-4 ve karsinoembriyonik antijen-ilişkili hücre adezyon molekülü 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokin reseptörleri (örneğin, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemo-çekici reseptörleri (örneğin, PAFR, _LTB4 R ve C5aR) , sitokin reseptörleri (örneğin, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR) reseptörleri (örneğin, FPR1-3) peptit formil ve Fc reseptörleri (örneğin, CD16 (FcyRIII İnsan nötrofil CD11b, CD15, CD16 ve CD66b lökosit işaretlerini kullanarak tanımlanır ise), CD32 (FcyRII) ve CD64 (FcyRI) ^10. farelerde, nötrofiller genellikle, CD11b ⁺ Ly6G ⁺ olarak tanımlanır. Ayrıca, genel olarak doku içinde nötrofillerin tespiti için granül proteinleri miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (KD) için leke kabul edilmektedir.

Bu nötrofillerin farklı fonksiyonları aynı hücre ya da farklı hücre alt popülasyonları aracılık olup olmadığını hala belirsiz. Toplanan veriler pro-enflamatuar uyarıcı ve ^mikro-11,12 etkilenen plastisite yüksek derecede gösteren heterojen bir nötrofil nüfusu varlığı açısından göstermektedir. Fridlender ve ark., ¹³ fena halde yanlısı tümör özelliklere sahip, anti-tümör özellikleri ve N2 N1 olarak adlandırılan iki ana alt popülasyonları içine kanserinde nötrofillerin ayırdık. Kanserde, hem de kronik inflamasyon, T hücresi tepkilerini ¹⁴ bastırmak granülositik miyeloid kökenli bastırıcı hücreler (G-MDSCs) arasında oluşan ek bir alt-nüfusu vardır. G-MDSCs bir CD11b ⁺ LY6C ile karakterize edilen olgunlaşmamış miyeloid hücreler olduğu düşünülmektedirFarelerde ^{15 düşük} Ly6G ^merhaba fenotip, insan ¹⁶ bir CD15 ⁺ / CD16 ^düşük fenotip yerken. G-MDSCs normal dolaşım nötrofil daha sitokinler ve kemokinlerin ise daha düşük düzeylerde arginaz ve miyeloperoksidaz yüksek seviyeleri ifade etmedi. Onlar daha az fagositer ve göçmen ama ROS ^15,17,18 yüksek seviyelerde üretir. Mevcut yazıda anti-tümör özelliklere sahip nötrofillerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bazı temel metodolojileri anlatacağız.

Nötrofiller insan dolaşımda tüm beyaz kan hücrelerinin büyük nüfusa teşkil ederken (45-70%; 1,800 - 6,000 / ul) -; 300-500 / ul% 15, farelerde, normal şartlar altında, 10 (yerine seyrek ). inflamasyon üzerine ve bazen kronik inflamasyon ⁷ bir devleti temsil kanser, istikrarlı nötrofil sayısı artar. Nötrofiller multipotent ortak miyeloid öncüsü (CMP) ce gelişirmiyeloblast aşamalarını (MB) promiyelositlerin (PM), miyelositler (MC), metamyelocytes (MM) ve bant hücreleri (BC) geçen bir farklılaşma sürecinde kemik iliğinde LLS, ^8. Onlar dolaşıma ⁸ yayınlanmadan önce 7 gün - olgun, post-mitotik nötrofil 4 kemik iliği içinde kalabilir. Inflamatuar koşullarda uzatılabilir 12 saat, - kanda nötrofil cirosu 6 ortalama yarılanma ömrü genellikle hızlıdır. Uyarılmamış nötrofil forbol ester forbol 12 onları teşhir ederek, anti-tümörijenik aktivite, kemokinler, IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 ve CXCL5 ^6,19 veya yapay naif nötrofillerin açığa elde edilebilir bir özellik, sınırlı -myristate 13-asetat (PMA) ^6.

nötrofil sayısının düşük birlikte kan nötrofillerinin kısa yarı ömrü (~ 3-5 10 ⁵ x) naif 6 1 ml kandan elde - 8 hafta eski fare, bunu yaptıkzordur, in vitro olarak farenin nötrofil dolaşım fonksiyonunu keşfetmek için. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, diğer kaynaklar kullanılmaktadır. Örneğin, nötrofillerin büyük çoğunluğunun (tiyoglikolat suyu veya zimosan bir intraperitoneal enjeksiyondan sonra gibi), kemik iliği ²⁰ veya steril enflamasyonun indüksiyonu, aşağıdaki periton elde edilebilir. Bu periton boşluğuna elde edilen nötrofiller herhangi bir anti-tümörijenik aktiviteye (yayınlanmamış gözlem) uygulamayın olmadığını belirtmek gerekir.

. 40 milyon kan nötrofilleri de kolayca 1 mi kanından izole edilebilir - Granot ark ⁶ BALB / c fareleri, 20 olacak şekilde, tümör ilerlemesi ⁶ (Şekil 2A) ile birlikte ağırlaştırmaktadır nötrofili geliştirmek Fare 4T1 meme karsinomu hücre soyu ile aşılanır ortotopikal görülmektedir 3-4 hafta sonrası tümör aşılama. Bu nötrofiller anti-tümör aktiviteleri edindikleri ve buna göre coi olmuşturamacıyla tanımlanmış tümör tutulan nötrofiller (TEN), saf nötrofil ⁶ (Şekil 2B) ayırt etmek için. Yüksek yoğunluklu nötrofiller (HDN, Şekil 1A) yüksek bir anti-tümör oluşturucu birlikte, kanser bağlamında üretilen düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN, Şekil 1B) ²¹ değildir. Aynı zamanda, tümör taşıyan farelerin kemik iliği ve dalak yüksek yoğunluklu nötrofil, anti-tümör aktivitesi (yayınlanmamış veriler) sahiptir. Nötrofil artan miktarları ile, tümör progresyonu ile dalak, giderek büyüyen (splenomegali) haline unutulmamalıdır.

TEN spontan (MMTV PyMT ve MMTV Wnt1 meme tümörleri ve K-ras tahrik akciğer tümörlerinin) her iki dahil olmak üzere, diğer kanser modellerinde oluşturulur ve AT-3 (MMTV PyMT) ve E0771 meme karsinomu (enjekte edilir unutulmamalıdır Hücreler, LLC Lewis akciğer karsinoma hücreleri ve B16-F10 melanoma hücreleri) içerir. Bu tum nötrofil seferberlik Ancak, kapsamı3 hafta sonra 1 ml kanda 10 x 10 ⁶ nötrofilleri - ya da modeller 5 ulaşan 4T1-aşılanmış farelerde çok daha azdır.

Protokol

Hayvanlar: 5-7 haftalık BALB / c fareleri, Harlan (İsrail) satın alınır. Hayvanlarla ilgili tüm deneyler İbrani Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. İnsan örnekler: kanser hastaları ve sağlıklı gönüllülerin kan toplama Hadassah Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından onaylanmıştır.

Bir göğüs kanseri fare modeli kullanılarak in vivo anti-tümör özellikleri olan nötrofillerin 1. indüksiyonu.

NOT: Tüm adımlar laminar hava akımı (LAF) Biyo-Güvenlik kabinesinde steril çözümleri kullanılarak yapılmalıdır.

1. 10 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı ml (DMEM)% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile desteklenmiş 4.5 g / L D-glikoz ihtiva eden, 2 mM D- 100 mm doku kültürü plakası Tohum ⁵ x 10 5 4T1 hücreleri glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin sülfat. Th inkübe3-4 gün için% 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C 'de E hücresi. Deney gününde,% 100 konfluent - hücreleri 50 olduğundan emin olun.
2. Doku kültür plakalarında tümör hücreleri ayırmak için, 5 mi, PBS ile yıkama hücreleri, kültür ortamı aspire PBS aspire ve 2.5 g / L tripsin çözeltisi 3 ml. 37 ºC tripsin ile 3 dakika - Hücreler 2 inkübe edin.
3. Tüm hücreler müstakil edilene kadar yukarı ve aşağı tripsin ve pipet nötralize etmek için 10 mi, serum-içeren ortam ekleyin. 15 ml konik santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Hücre peleti üzerinde 200 ul ortam terk orta aspire. Kalıntı hacme hücrelerin yeniden süspanse edin ve 10 ml PBS ilave edin. Homojen bir hücre süspansiyonu elde ve bir hemasitometre hücreleri saymak için 10 ul almak için 3 kez - tüpü 2 ters çevirin. Canlı ve ölü hücreleri arasında ayrım yapmak için tripan mavisi kullanarak.
5. Oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. PBS aspire ve 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tek hücre süspansiyonu hiçbir topaklanma olduğundan emin olun.
6. Enjekte 1 x 10 ⁶ 4T1 hücreleri veya lusiferaz sentezleyen ortotopikal 30G x 8 mm iğne ile 0.3 ml şırınga kullanılarak dişi BALB / c farelerinin sol inguinal ve memenin yağlı pedine 50 ul PBS içinde 4T1 hücreleri.
   1. % 100 oksijen - (% 5 3) enjeksiyonu öncesi, izofluran yavaş akış hızı alan bir indüksiyon odasında fareler uyutmak.
   2. Steril cerrahi pad üzerinde fare Lay ve kafa düzgün izofluran burun konisi içine yerleştirildiğinden emin olun. Pençe kısma doğru anestezi onaylayın. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. Enjeksiyon yeri çevresinde saç Tıraş ve% 70 EtOH ile dezenfekte edin.
   3. Küçük bir yatay kesi yapmak için cerrahi araçlar steril seti kullanın (5 mm) yaklkasık ve karın meme arasındaki imately yarım, yağ yastığı ortaya çıkarmak ve 50 ul 1 x 10 ⁶ 4T1 hücreleri enjekte edilir. Bir hafta sonra kaldırılması gerektiğini 9 mm klipleri ile kesiler kapatın. Lusiferaz sentezleyen hücrelerin enjeksiyonu biyoluminesans görüntüleme tümör boyutu ve metastaz izlenmesine olanak sağlar.
      Not: Bu minimal invaziv prosedür herhangi ameliyat sonrası tedavi gerektirmez ve enjekte edilen fareler 2 içinde iyileşir - 3 dk.
   4. Onlar bilinci yeniden kadar fareler Monitör ve diğer farelerin şirket katılmadan önce tam bilincini kazanmak emin olun.
7. 3 Sonra - 4 hafta, primer tümör 2 cm ³ hacme ulaştığında, yavaş CO ₂ akışı ile fareler kurban ve hemen son nefesini sonra, bir 25G x 5/8 'iğne kullanılarak kalp ponksiyonu ile kan almak Heparin ile önceden işleme tabi tutulmuş, 1 ml tüberkülin şırıngaya bağlanır. Takarken yukarı iğne ağzını tutunaşırı basınç (Şekil 3) kaçınarak kan çizmek yavaş ve kademeli kalbe doğru diyafram üzerinden yatay konumda şırınga ve.

2. Nötrofil İzolasyon

1. Tümör taşıyan farelerin kanından sitotoksik nötrofillerin izolasyonu.
   1. Bir tümör taşıyan fareden hazırlanan 1 ml'lik kan seyreltin PBS 6 ml 'lik bir nihai hacme, büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) (ağ / hac)% 0.5 (protokol 1.11 bakınız).
   2. Taze hazırlanmış süreksiz sükroz gradyanı üzerinde seyreltilmiş kan fraksiyonlama:
      1. 15 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpünün tabanına steril filtrelenmiş sakroz 1.119 g / ml arasında 3 ml ekleyin.
      2. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, 1.119 g / ml tabakanın üzerine steril filtre edildi sakroz 1.077 g / ml tabakası 3 mi. Daha sonra, 1.077 g / ml tabakanın (Şekil 4A) üzerine yavaş ve dikkatli bir şekilde seyreltilmiş kan (Protokol 2.1.1) 6 ml ekleyin. Bu eğik tüp tutmak için tavsiye ve birborunun alt duvarına doğru pipet ağız tutmak, yavaş ama sürekli bir akışla farklı bileşenleri dding, herhangi bir türbülans oluşturacak şekilde.
   3. Fren RT'de 30 dakika boyunca 700 xg'de sükroz gradyanı üzerinde seyreltilmiş kan içeren tüp santrifüjleyin.
   4. Dikkatle herhangi bir türbülans neden olmadan santrifüj tüp kaldırmak. Eritrositlerin çoğu tüpün alt kısmında olacak. Düşük yoğunluklu lökositler bulunurlar iken yüksek yoğunluklu nötrofil (HDN), 1.119 g / ml (3 mi işareti civarında) 1.077 g / ml tabakalar arasındaki ara yüzeyde bir beyaz-kırmızı halka olarak bulunur 1.077g / ml tabaka ve BSA içeren PBS arasındaki arayüzde, beyaz bir halka (6 mi işareti etrafında, Şekil 4B).
   5. Düşük yoğunluklu hücre katmanının üstüne 5 mm ulaşıncaya kadar PBS +% 0.5 BSA aspire. Yavaş yavaş hücreleri etrafında dönen yoluyla 1 ml ucu içine yavaş emilerek düşük yoğunluklu hücreleri pipetle.% 0.5 BSA içeren PBS içinde 30 ml hücre transfer edin.
   6. Yüksek yoğunluklu hücre bandının üstünde 5 mm ulaşıncaya kadar aynı degrade tüp üst katman aspire. Çoğunlukla, yüksek yoğunluklu nötrofillerdir yüksek yoğunluklu hücreleri üzerinden Pipet, ve% 0.5 BSA ihtiva eden PBS içinde 30 ml hücre transfer edin.
   7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
   8. 30 saniye için 36 ml steril HPLC dereceli su içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla süpernatan ve lize eritrositleri aspire. İzotonisite 5x 9 ml ekleyerek restore edilmelidir PBS% 2.5 (ağırlık / hacim) BSA ile takviye edilmiş konsantre edildi.
   9. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
   10. Süpernatanı havalandırın, ve PBS-BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre içinde nötrofillerin sayısını ve canlı ve ölü hücreleri arasında ayrım yapmak için tripan mavisi kullanın.
   11. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de hücreleri santrifüj ve nihai hücre yoğunluğu istenen inkübasyon ortamı içinde nötrofillerin tekrar süspansiyon. KullanımHemen nötrofiller bulunmaktadır.
   12. Daha sonra, bir santrifüj işleminden sonra, nihai hücre yoğunluğu kuluçka ortamı içinde nötrofillerin tekrar süspansiyon. Hemen nötrofil kullanın.
2. Kanser hastalarından nötrofillerin dolaşımdaki izolasyonu.
   1. Salin içinde% 3 Dekstran T500 bir eşit hacmi ile Heparinli (20 U / ml) insan kanı 10 ml karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Bu kuluçka sırasında eritrosit tortu olacaktır.
   2. 10 mi sukroz 1.077 g / ml ile 50 ml konik polipropilen tüpü hazırlayın yavaş yavaş 1,077 g / ml sükroz katman (Şekil 4C) üstüne lökosit bakımından zengin süpernatant tabakası.
   3. Fren RT'de 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. yüksek yoğunluklu nötrofil (HDN) pelet görünecektir. Düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) 1.077 g / ml sükroz tabaka ve plazma (Şekil 4D) arasındaki arayüzde monositler ve lenfositler ile birlikte saflaştırılması.
   4. 10 ml 0 nötrofilleri yeniden süspanse edin.30 saniye için% 2 NaCl kirletici, eritrositleri lizise uğratmak ve% 1.6 NaCl, 10 ml ilave edilerek izotonikliğe geri ve bir kez ters çevirin.
   5. Santrifüj 5, oda sıcaklığında 160 xg'de dakika, ve 20 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra Santrifüj ve süpernatant aspire.
   6. Nötrofilleri sayın ve ml veya arzu edildiği gibi, 2 x 10 ⁶ nötrofil /% 2 FBS ile takviye edilmiş RPMI-1640 içinde tekrar süspansiyon hücreleri.

Manyetik Boncuk Kullanarak Kan Nötrofiller 3. zenginleştirilmesi

1. Pozitif seçim
   1. Heparinize şırınga ile, Protokol 1.8 de tarif edildiği gibi bir fareden kan 1 ml alın.
   2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de 15 ml konik bir tüp içinde kan santrifüjleyin.
   3. Süpernatantı aspire veya ileri çalışmalar için kan plazması tutun.
   4. Lyse 8 mi, HPLC-dereceli su içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla eritrositler. 30 saniye sonra 5x conce 2 ml ekleyerek izotonikliğe gerintrated PBS% 2.5 BSA ihtiva eden. Hücreleri saymak.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
   6. % 0.5 BSA ve 10 ⁸ hücre başına 2 mM EDTA ihtiva eden 200 ul PBS içinde hücre pelletini.
   7. Biyotinile anti-Ly6G antikorun 50 ul ekle. İyice karıştırın ve (değil buz üzerinde) buzdolabında 10 dakika inkübe edilir.
   8. Gibi soğuk PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden 150 ul ekle.
   9. Vortex anti-biyotin kaplı manyetik microbead stok solüsyonu. Hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. İyice karıştırın ve (değil buz üzerinde) buzdolabında 15 dakika inkübe edilir.
   10. 10 ml PBS, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA, ve santrifüj ihtiva eden ekleyerek hücreleri yıkanır.
   11. % 0.5 BSA, 2 mM EDTA ihtiva eden 500 ul soğuk PBS aspire tamamen süpernatan ve süspansiyon haline getirin.
   12. Manyetik bir stand bağlı bir mıknatıs tutucu içine bir manyetik ayırma sütun takın ve 500 ul soğuk PBS 0 içeren ile durulayın.% 5 BSA ve 2 mM EDTA.
   13. Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. akış etiketsiz LyG6-negatif hücreleri içerir.
   14. 500 ul PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden ile kolon yıkayın. Ek etiketlenmemiş hücreler boyunca akış olacaktır.
   15. Başka bir 500 ul PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden yıkama adımı tekrar edin.
   16. Mıknatıstan sütun çıkarın ve 15 ml toplama tüpü üzerine yerleştirin. PBS% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml ekleyin ve iyice sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri yıkayın. akış yoluyla Ly6G ⁺ nötrofilleri içerir.
2. Negatif seçim
   1. Adımlar 3.1.5 için 3.1.1 uyarınca kan lökositleri hazırlayın.
   2. Süspanse 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpü içinde% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml PBS içinde 1 x 10 ⁸ hücreleri.
   3. 50 ul normal sıçan serumu ekleyin.
   4. Nötrofil zenginleştirme c 50 ul ekleyinocktail (non-nötrofil, beyaz kan hücreleri için spesifik olan biyotinlenmiş antikorlar ihtiva eden), iyice karıştırın ve buzdolabında 15 dakika inkübe edilir.
   5. 4 eklenerek ml PBS, 10 dakika boyunca% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ve santrifüj 400 xg içeren hücreleri yıkanır.
   6. Süpernatant atılır ve 1 ml PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden hücrelerin tekrar süspansiyon.
   7. Biotin ve dekstran karşı tetramerik antikor komplekslerinin 50 ul ekle. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika inkübe edilir.
   8. Hücre süspansiyonu 150 ul ilave edilmeden önce dekstran-kaplı manyetik boncuklar içeren vorteks de tüpü. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika kuluçkaya yatmaktadır.
   9. PBS,% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA ihtiva eden eklenerek 2.5 ml'lik toplam hacme kadar hücre süspansiyonu getirin. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için yavaşça karıştırın.
   10. Mıknatıs içine (kapağın olmadan) tüp takın ve 3 dakika boyunca bekletin.
   11. Sürekli birinde tüp ile mıknatıs ters çevirinHareket sıvısında bağlanmamış hücreler yeni bir tüpe aktarılır şekilde. 2 ters mıknatıs ve tüp bırakın - 3 saniye sonra dik konuma getirin. Bağlanmamış nötrofil transfer sıvısı içinde olacak ise manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin, istenmeyen orijinal tüpün duvarına bağlanmış kalır.

Nötrofiller 4. Sitolojik Boyama

1. 50 ul PBS içinde 1x10 ⁵ nötrofilleri yeniden süspanse edin ve bir Cytospin gibi ince tabakalı hücre hazırlama adaptörüne hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 150 x g'de adaptörü santrifüj. Adaptörden önceden etiketlenmiş cam slayt ayırın.
2. 2 dakika boyunca% 70 etanol içinde cam slaytlar daldırma hücreleri saptamak. Adaptörü (adım 4.1) den hazırlıklar boyamadan önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Distile su içinde 6 kez - slaytlar 5 batırın.
3. Mayer'in Hematoksilin çözeltisi içinde 2 dk - 1 Leke. Musluk suyunda 1 dakika durulayın. Eosin Y çözeltisi içinde 10 sn Leke . Tap suda yıkayın. Etanol artan konsantrasyonlarda slaytlar (% 70,% 96 ve% 100) durulama ile kurutmak. Kısa bir süre cam slaytlar hava kurumasını bekleyin ve bir ışık mikroskobu altında slaytlar inceleyin.
   NOT: eozin pembe ve spesifik olmayan proteinler leke oysa Hematoxylin, derin mavi-mor renk ve leke nükleik asitler vardır. nötrofil sitoplazmik granüller 'nötr olmaya sevgi dolu' adı kökenli olan asidik veya bazik boyalarla tarafından lekesiz kalır. Hematoksilen ve eozin ve eosinophilc ile bazofilik granülositler leke koyu mavi parlak kırmızı granülositler Oysa, nötrofiller nötr pembe (Şekil 1A bakınız) görünür. 5 loblar 'segmentli nötrofil' (Şekil 1 A ve 1 C) - olgun nötrofiller 2 büyük genel olarak, bir polimorf çekirdeği ile karakterize edilir. Olgunlaşmamış nötrofiller bir loblu kavisli veya halka şeklinde bir çekirdeğe (Şekil 1B) ile karakterize edilir.

ve_title "> 5. Akış Sitometrisi ile Nötrofiller Saflık Tayini.

1. FACS tampon maddesi içinde 100 ul (PBS,% 0.5 BSA, 2 mM EDTA ve% 0.02 _NaN3 ihtiva eden) içinde 1x10 ⁶ tekrar süspansiyon hücreleri. Boyama (3.1.5 için 3.1.1 adımları) önce tam kan örnekleri için, hemoliz gereklidir. 5 dakika boyunca FcR bloke edici ayıracı 10 ul ekle.
2. İnsan nötrofil fare nötrofiller ya da CD11b ve CD66b için Ly-6G bir spesifikliği olan flüoresan etiketli antikorun 0.5 ug ekleyin karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
3. PBS% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA içeren 500 ul ses seviyesini ayarlama ve flow sitometri boyama analiz.

In vivo 6. Takip Nötrofil Kapı

1. Nötrofillerin in vivo BrdU etiketleme
   1. Tümör taşıyan farelere intraperitonal olarak, steril PBS içinde 10 mg / ml bromodeoksiüridin (BrdU) çözeltisi 100 ul enjekte edilir.
   2. Kan nötrofillerinin 48 saat enjeksiyon sonrası a yalıtmakProtokole 2.1 şeklinizi ona göre. Leke, bir BrdU akış kiti kullanılarak nötrofiller BrdU-etiketli.
2. Nötrofil CFSE markalama
   1. Önceden ısıtılmış 1 ml PBS, 10 ⁷ nötrofilleri yeniden süspanse edin.
   2. 10 uM'lik nihai bir konsantrasyona kadar süspanse nötrofiller için 5 mM CFSE stok çözeltisi 2 ul ekle. İyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir. 1 mi DMSO içinde 5 mM CFSE 2.8 CFSE mg (Carboxyfluorescein diasetat, süksinimidil ester, -) - 5- (ve 6) eritilmesi ile hazırlanır. -20 ° C'de karanlıkta, steril 200 ul tüpleri ve deposunda 10 ul alikotları bölünür.
   3. % 10 FBS ihtiva eden RPMI-1640 içinde eşit hacmi eklenerek aşırı CFSE nötralize. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin nötrofillerin. % 10 FBS ihtiva eden RPMI-1640, 10 ml iki kez nötrofilleri yıkayın.
   4. PBS, uygun bir hacim içinde, 10 dakika ve tekrar süspansiyon boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Nötrofiller (örneğin, 1 x 10 ⁷ Hücreleri) hemen damar içinden veya alıcı farelere kardiyak enjeksiyon yoluyla enjekte edilebilir.

7. In vitro Lüsiferaz Tahlili İzole Nötrofiller Anti-tümör Aktivite Monitör.

1. Protokol 1.1-1.5 bölgesindeki 4T1 hücreleri için tarif edildiği şekilde lusiferaz etiketli tümör hücrelerini yetiştirmek ancak% 2 FBS ile takviye edilmiş optimum düşük serum ortamı içinde tripsin ayrışmış hücreler tekrar süspansiyon. Ml başına 5 x 10 ⁴ hücrelere hücre yoğunluğu ayarlayın.
2. 100 ul Tohum 5000 lusiferaz etiketli tümör hücreleri, beyaz bir 96 düz-tabanlı doku kültürü çukurlu bir levhanın her çukuruna% 0.5 FBS ihtiva eden, düşük serum ortamı optimize edilmiştir.
3. 4 saat tümör hücrelerini tohumlama sonra,% 0.5 FBS içeren azaltılmış serum orta optimize 50 ul 1 x 10 ⁵ nötrofilleri ekleyin ve / N O kuluçkaya yatmaktadır. 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunluğa sahip bir nötrofil hücre süspansiyonu hazırlanır. Kontrol kuyuları nötrofiller olmadan 50 ul orta almalısınız. DoHer bir deneysel ortamda çok sayıda tekrarlanır.
4. Ertesi sabah hafifçe süpernatant aspire ve 200 ul PBS ile her iyi yıkayın. PBS aspire ve pasif lizis tamponu 50 ul ekle. (Örneğin, AT-3 hücreleri gibi) kolayca ayırma hücreler için, PBS içinde yıkama yoktur ve büyüme ortamı aspire hemen sonra hücre kültürü lisis tamponu ilave edin.
5. Alüminyum folyo ile plaka Kapak ve oda sıcaklığında 20 dakika süre ile 150 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
6. Bir parlaklık plaka okuyucu plaka koyun. İyi bilge 50 ul lusiferaz tahlil çözümü enjekte ve oyuk başına 10 saniye boyunca kemilüminesansını okuyun.
7. Aşağıdaki formül ile% tümör lizis hesaplayın:% tümör lizis = (1- [nötrofiller örneklerinin ışıldama] / [ortam içinde numune lüminesan]) x% 100.

NOT: protokolde 8.1 anlatıldığı gibi metastatik tohumlama nötrofillerin katkısını değerlendirmek için, nötrofiller tükenmiş olabilir. Etkili depl içinetion gün 7 sonrası tümör engraftment başlayan nötrofil tüketen antikorlar yönetmek.

Bir göğüs kanseri Fare Modeli Nötrofiller 8. Anti-Metastatik Etkinliği.

1. Nötrofillerin tükenmesi in vivo olarak.
   1. Taze fare başına 100 ul nihai bir hacimde serum fizyolojik içinde sıçan anti-Ly6G antikoru 12.5 ug (nötrofil antikor) veya sıçan izotip kontrol antikoru (IgG _2a, Κ) hazırlanması.
   2. 3. gün sonrası tümör melezleme başlayarak günlük olarak 12.5 ug fare anti-Ly6G antikoru (100 ul) bir karın içi dozu enjekte edilir. Kontrol ile fareler veya 12.5 ug (100 ul) fare izotip kontrol antikoru (IgG _2a, Κ) enjekte edilir.
   3. 4T1 Tümör büyüdükçe nötrofil üretim hızı önemli ölçüde arttıkça 14. günde başlayarak, günde iki kez antikorlar yönetmek.
   4. Lateral kuyruk ven nicking ile - (3 damla 2) Her gün, bir kan örneği almak. Bir anti-içine kan toplayın-coagulant içeren tüp (heparin, sitrat ya da EDTA).
   5. Protokol 5'te tarif edildiği gibi akış sitometrisi kullanılarak, nötrofil tükenmesi kontrol edin.
2. Tümör Nötralizasyon Testi (Winn Assay Modifiye)
   1. Tümör taşıyan farelerin nötrofillerin izole edin. 1 x 10 ⁶ tümör hücreleri ve 3 x 10 ⁶ nötrofilleri (fare başına) 50 ul tuzlu su içinde karıştırın.
   2. 8 haftalık yerli Balb / c fareleri, - deri altından 6 kanadını hücreleri enjekte edilir. Tümör büyüklüğü doğru ölçümler sağlamak için tümör engraftment öncesinde kanadını tıraş. Gün 5 post-engraftment tümör boyutu, günlük başlangıç ​​ölçün.
3. Nötrofil Evlatlık Transferi
   1. Kuyruk damarından 200 ul PBS içinde 2 x 10 ⁴ lusiferaz sentezleyen tümör hücreleri enjekte edilir.
   2. Nötrofil transferi tümör hücre enjeksiyonu takiben 4 saat yapılmalıdır. Bu nedenle, yaklaşık 2 saat planlanan onların önce tümör taşıyan farelere (protokol 2.1) den HDN arıtılmasını başlatmakin vivo aktarımı. 2.5 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir son konsantrasyonda PBS içinde nötrofillerin yeniden süspanse edin.
   3. Tümör hücrelerini tanıtan sonra 4 saat, 5 dakika için bir ısı lambası altında fareler yerleştirin. Bir süzgeç fareler yerleştirin ve kuyruk damarından 5 x 10 ⁶ HDN (200 ul) enjekte edilir. Kontrol fareleri araç (PBS) enjekte edilmiştir.
   4. In vivo görüntüleme sisteminde veya imünohistokimya ile bir biyoışıldama kullanarak çeşitli zaman noktalarında akciğer metastazı oluşumunu izlemek.
4. Akciğer metastatik tohumlama deneyi
   1. Protokolde 1'de açıklandığı gibi orthotopically sol inguinal meme yağ yastığı içine 1 x 10 ⁶ ebeveyn 4T1 hücreleri - 0.5 enjekte edilir.
   2. 10. günde, 5 x 10 ⁵ hücre / ml'lik bir son konsantrasyonda PBS GFP-ifade eden 4T1 hücreleri tekrar süspansiyon. 5 dakika için bir ısı lambası altında fareler yerleştirin.
   3. Bir süzgeç fareler yerleştirin ve 4T damar 1x10 ⁵ GFP eksprese eden 4T1 hücreleri (200 ul) enjekte1, tümör taşıyan farelere ya da saf fareler.
   4. Ertesi gün, fareler euthanize ve kalan eritrositlerde çıkarmak için 20 mi, PBS ile akciğerlere serpmek.
   5. Immünohistokimyasal olarak GFP pozitif hücrelerin analizi için akciğerleri tüketim.
      NOT: protokolde 8.1 anlatıldığı gibi metastatik tohumlama nötrofillerin katkısını değerlendirmek için, nötrofiller tükenmiş olabilir. Etkili tükenmesi için gün 7 sonrası tümör engraftment başlayan nötrofil tüketen antikorlar yönetmek.

Tümör taşıyan fareler ile Nötrofiller, T hücresi çoğalması 9. bastırılması.

1. 10 ml PBS içinde ötenazi saf, BALB / c fare ve yerden dalak çıkarın.
2. RPMI-1640 ile dolu bir petri üzerinde uygun bir 40 mikron hücre süzgecinden üzerine dalak yerleştirin. Hücreler petri içine süzgeç yoluyla şırınga pistonu ucunu kullanarak, dalak ezin. 5 ml RPMI hücre süzgeç durulayın. Süzgeç atın.
3. 10 dakika boyunca 50 ml'lik konik bir tüp ve santrifüj 400 x g'de içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın.
4. Süpernatant atılır ve 20 sn için, saf su 36 ml süspansiyona, eritrositleri lizise uğratmak ve ekleyerek izotoniklik ayarlama 4 ml PBS x 10. Alternatif olarak, eritrosit 5 ml süspansiyona, eritrositleri lizise uğratmak konsantre edildi tampon (ACK) parçalama ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. RPMI-1640 ortamında 10 ml ilave edilerek nötralize ACK. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. 5 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve hücreleri saymak.
5. 15 ml bir tüp içinde 4 x 10 ⁷ hücre / 2 ml bir nihai yoğunluğa kadar PBS içinde yeniden süspanse splenositlerin. PBS içinde 2.5 uM CFSE çözeltisi 2 ml ilave edilir. Hızlı bir şekilde tüp ters ve ışıktan korunan ara sıra karıştırma ile 37 ° C (her 2 dakika) 10 dakika boyunca inkübe edin.
6. Önceden ısıtılmış FBS (% 100) 4 ml ekleyerek aşırı CFSE söndürün ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. 10 boyunca 400 x g'de PBS ve santrifüj 3 ml ilave edilirMin.
7. 10 dakika boyunca 400 x g'de 30 mi, PBS ile hücrelerden ve santrifüj yıkayın.
8. 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri Filtre ve PBS ile tekrar yıkayın.
9. 2 x 10 ⁷ hücre / ml bir nihai yoğunluk için% 10 FBS ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
10. Tohum, 2 x 10 ⁶ / çukur (200 ul), 24 oyuklu doku kültürü plakası.
11. % 10 FBS ile 500 | il RPMI-1640 içinde saflaştırılmış, Ermeni hamster anti-fare CD3ε antikoru 1 ug ekleyerek hücreleri uyarır.
12. CFSE, etiketli splenositlere 10% FBS ile 300 ul RPMI-1640 içinde 2 x 10 ⁶ HDN ya LDN ekleyin ve 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe edilir. Nötrofiller olmadan Wells 300 ul ortam almalısınız. Her oyuktaki toplam hacim 1 mi olmalıdır.
13. Hücreleri toplamak ve flow sitometri için onları hazırlamak. 100 ul FACS tamponu (Protokol 5) hücrelerin tekrar ve FcR Engelleme Reaktif 10 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
14. Ekle 1-956. APC-konjuge anti-CD8α antikorunun L ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
15. Akış sitometrisi (Şekil 5) tarafından CD8 ⁺ T hücreleri üzerinde CFSE floresans yoğunluğunu belirler. KAKE yoğunluğu her hücre bölünmesi üzerine yarıya düşer. Böylece, hücre bölünmesini CFSE boyama yoğunluğu ile tespit edilebilir.

10. Nötrofil Göç Deneyi

1. Düşük serum ortamı 25 cm ² doku kültürü şişesi içinde% 0.5 FBS ile takviye edilmiş ve 37 ° C'de 24 saat inkübe optimize 7 ml tohum 5x10 ⁵ 4T1 hücreleri.
2. 5 um'lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir geçiş levhasının alt bölmeye süpernatan 800 ul aktarın.
3. Süspanse% 0.5 FBS ile takviye edilmiş optimum düşük serum ortamında 400 ul 2 x 10 ⁵ nötrofiller bulunmaktadır. Üst bölmeye hücre süspansiyonunu 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
4. İnkübasyonun sonunda, üst bölmenin kaldırıpAlt bölmeye giden nötrofillerin sayısı.

Reaktif oksijen türlerinin 11. İzleme Nötrofil Üretimi (ROS).

1. Fenol kırmızısı olmaksızın Hank dengeli tuz çözeltisi içinde 1.1 x 10 ⁶ nötrofil / ml hazırlayın. Plaka, beyaz bir 96 düz-tabanlı bir kuyu tabakasına her çukuruna 2 x 10 ⁵ nötrofilleri ihtiva eden 180 ul.
2. Bir parlaklık plaka okuyucu plaka koyun. 50 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğa, PBS içinde 500 uM luminol çözeltisinin 20 ul ekle. 10 saniyelik aralıklarla, 5 dakikalık bir zaman akışı içinde 1 sn içinde taban kemilüminesans okuyun.
3. (10 uM arasında bir konsantrasyonda 10 nM veya 100 nM ya da fMLP bir konsantrasyonda, örneğin, PMA) bir uyarıcı ekleme. Fenol kırmızısı olmaksızın Hank dengeli tuz çözeltisi içinde, her maddenin bir 10x konsantre çözelti hazırlamak ve ilgili kuyucuklara 22 ul ekle. Kontrol etmek için kuyu 22 ul aracı ekleyin.
4. Measuplaka okuyucu kemilüminesans yeniden. Kısa (5 dakika boyunca her 10 sn) ve uzun bir süre ders (1 saat için her dakika) hem de yapın.

Sonuçlar

Yeni bir çalışmada nötrofiller ⁶ için bir anti-metastatik fonksiyonu belirledi. Tümör taşıyan farelerin nötrofiller bir sitotoksik fenotipi edinebilir ve tümör hücrelerini ⁶ öldürme kapasitesine sahiptir. Bu, önemli bir anti-tümör etkisi ⁶ sahip naif farelerin nötrofillerin aksine bulunmaktadır. Protokol bölümünde tarif edilen tekniklerin çeşitli in vitro ve in vivo ^6, anti-tümör nötrofil işlevini incelemek için kullanılmıştı...

Tartışmalar

Nötrofiller tüm beyaz kan hücrelerinin en bol ve enfeksiyon ve inflamasyon durumlarında ilk müdahale vardır. Gibi, onlar dış uyaranlara karşı oldukça duyarlıdır ve kolayca aktive edilir. Buna ek olarak, nötrofiller, çok kısa bir yarı-ömre ve hızlı bir dönüşüm vardır. Birlikte, bu özellikler benzersiz deneysel stratejiler gerekli şekilde nötrofil, çalışan birkaç zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birkaç nötrofil arıtma stratejileri kendi artıları ve eksileri ile her vardır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12x75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11