Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Resumo

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Resumo

Os neutrófilos, o mais abundante de todas as células brancas do sangue na circulação humana, desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores. Além disso, os neutrófilos desempenham um papel central na vigilância imunológica de células de tumor. Eles têm a capacidade de reconhecer as células tumorais e induzir a morte da célula do tumor quer através de um mecanismo dependente do contacto da célula que envolve peróxido de hidrogénio ou através de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Os neutrófilos com actividade anti-tumor pode ser isolado a partir de sangue periférico de doentes de cancro e de ratinhos portadores de tumor. Estes neutrófilos são denominados neutrófilos arrastado-tumorais (RTE) para distingui-los dos neutrófilos de indivíduos saudáveis ​​ou camundongos ingênuos que mostram nenhuma atividade citotóxica significativa tumor. Comparado com outras células brancas do sangue, os neutrófilos mostram flutuabilidade diferente tornando viável para obter a> 98% da população de neutrófilos puro quando submetido a um gradiente de densidade. No entanto, para alémpara a população de neutrófilos de alta densidade normal (HDN), em doentes com cancro, em ratinhos portadores de tumor, bem como em condições inflamatórias crónicas, as populações de neutrófilos baixa densidade distintas (LDN) aparecem na circulação. LDN co-purificar com a fracção de células mononucleares e pode ser separado a partir de células mononucleares usando tanto estratégias de selecção positiva ou negativa. Uma vez que a pureza dos neutrófilos isolados é determinada por citometria de fluxo, que pode ser utilizado in vitro e in vivo em ensaios funcionais. Nós descrevem técnicas para a monitorização da actividade anti-tumoral de neutrófilos, a sua capacidade para migrar e para a produção de espécies reactivas de oxigénio, bem como a monitorização da sua capacidade fagocítica ex vivo. Nós descrevemos mais técnicas para rotular os neutrófilos para rastreamento in vivo, e para determinar a sua capacidade anti-metastático in vivo. Todas estas técnicas são essenciais para a compreensão de como obter e caracterizar os neutrófilos com anti-tumoralfunção.

Introdução

Os neutrófilos foram inicialmente caracterizadas como sendo as células imunes inatos que servem como primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Hoje sabe-se que os neutrófilos funções têm maior alcance, estar envolvido na montagem de resposta imune adaptativa contra antígenos estranhos ^1,2, que regula a hematopoiese ^{3, 4} angiogênese e cicatrização de feridas ^5. Além disso, os neutrófilos podem afectar o crescimento do tumor metastático e a progressão em virtude das suas pro- e anti-tumorais actividades ^6,7. Os neutrófilos são caracterizados por um núcleo segmentado polimórfica (daqui denominado polimorfonucleares (PMN)) e contêm pelo menos três subclasses distintas de grânulos, bem como vesículas secretoras ⁸ (Figura 1A-C).

Os neutrófilos possuem elevada capacidade fagocítica e actividade da NADPH-oxidase alta crítica para a eliminação microbiana, e secretam uma vasta gama de quimiocinas importantes para atração de neutrófilos adicionais e outras células do sistema imunológico para o local da inflamação ^8,9. Os neutrófilos são caracterizados pela expressão de uma grande quantidade de receptores da superfície, incluindo os receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectina do tipo C Receptores (CLRs), complementar do receptor 3 (CD11b / CD18) e outras moléculas de adesão (por exemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e carcinoembrionário molécula relacionada com antigénio-adesão celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimioquinas (por exemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), quimioatractivas receptores (por exemplo, PAFR, _LTB4 R e C5aR) , receptores de citocinas (por exemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptídicos dos receptores (por exemplo, FPR1-3), e receptores de Fc (por exemplo, CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII), e CD64 (FcyRI) ^10. Em ratinhos, os neutrófilos são geralmente identificados como CD11b ⁺ Ly6G ^+, enquanto que os neutrófilos humanos são identificadas utilizando os marcadores de leucócitos CD11b, CD15, CD16 e CD66b. É também geralmente aceite para corar para a mieloperoxidase proteínas dos grânulos (MPO) e elastase de neutrófilos (NE) para a detecção de neutrófilos em tecidos.

Ainda não é claro se as diversas funções dos neutrófilos são mediadas pela mesma célula ou por sub-populações de células distintas. Acumulando dados sugerem a presença de uma população heterogénea de neutrófilos que exibe um elevado grau de plasticidade afectado por estímulos pró-inflamatórios e o microambiente ^11,12. Fridlender et al. ¹³ ter grosseiramente divididos os neutrófilos no cancro em duas sub-populações principais denominado N1 com propriedades anti-tumorais e N2 com propriedades pró-tumorais. No cancro, bem como na inflamação crónica, há uma sub-população adicional constituído por células granulocíticas derivado supressoras mielóides (L-MDSCs) que suprimem as respostas de células T ^14. L-MDSCs são consideradas ser células mielóides imaturas caracterizadas por uma CD11b ⁺ Ly6C^baixo Ly6G fenótipo ^oi em camundongos ^15, ao ter um CD15 ⁺ / CD16 ^baixo fenótipo em humanos ^16. L-MDSCs expressar níveis mais elevados de arginase e mieloperoxidase, enquanto os níveis mais baixos de citocinas e quimiocinas que os neutrófilos circulantes normais. Eles são menos fagocíticas e migratório, mas produzem maiores níveis de ROS ^15,17,18. No presente artigo vamos descrever algumas metodologias básicas para isolamento e caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais.

Enquanto neutrófilos constituem a maior população de todas as células brancas do sangue na circulação humana (45 - 70%; 1800 - 6000 / mL), em ratos, sob condições normais, que são bastante escassos (10 - 15%; 300-500 / ul ). A contagem de neutrófilos aumenta de forma constante sobre a inflamação e, ocasionalmente, no cancro, o que representa um estado de inflamação crônica ^7. Os neutrófilos desenvolver a partir de precursor comum mielóide multipotentes (CMP) cells na medula óssea, por meio de um processo de diferenciação que passam as fases de mieloblastos (MB), promielócitos (PM), (MC) mielócitos, metamielócitos (mm) e as células de banda (BC) ^8. Os neutrófilos maduros, pós-mitóticas podem permanecer dentro da medula óssea para 4-7 dias antes de serem liberados para a circulação ^8. Volume de neutrófilos no sangue é geralmente rápida, com uma semi-vida média de 6-12 horas, que pode ser prolongado, sob condições inflamatórias. Neutrófilos não estimulados têm limitado actividade anti-tumorigénica, uma característica que pode ser adquirido por exposição dos neutrófilos sem tratamento prévio para as quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 ^6,19 ou artificialmente, expondo-as ao forbol de éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) ^6.

A meia-vida curta de neutrófilos do sangue em conjunto com o baixo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ obtido a partir de 1 ml de sangue de um naïve 6-8 week rato velho, tornaramdifícil explorar a função de neutrófilos circulantes rato in vitro. Para superar esta dificuldade, outras fontes têm sido usadas. Por exemplo, um grande número de neutrófilos podem ser obtidas da medula óssea ou do peritoneu ²⁰ após a indução da inflamação estéril (por exemplo, após injecção intraperitoneal de tioglicolato ou Zimosan A). Deve notar-se que os neutrófilos obtidos a partir da cavidade peritoneal não exercem qualquer actividade anti-tumorigénico (observação não publicada).

. Granot et al ⁶ observaram que os ratos BALB / c inoculados ortotopicamente com o rato linha celular de carcinoma da mama 4T1 desenvolver neutrofilia que agrava com a progressão do tumor ⁶ (Figura 2A), de tal modo que 20-40.000.000 neutrófilos do sangue pode ser facilmente isolado a partir de 1 ml de sangue 3 - 4 semanas pós-inoculação do tumor. Estes neutrófilos ter adquirido as actividades anti-tumorais, e tem sido nesse sentido coineutrófilos NED arrastado-tumorais (RTE), a fim de distingui-los dos neutrófilos ingênuos ⁶ (Figura 2B). Enquanto os neutrófilos de alta densidade (HDN, Figura 1A) são altamente anti-tumorigénica, neutrófilos baixa densidade (LDN, Figura 1B) geradas no contexto de cancro não são ^21. Além disso, os neutrófilos de alta densidade a partir da medula óssea e baço de ratinhos portadores de tumor têm uma actividade anti-tumoral (dados não publicados). Deve notar-se que, com a progressão do tumor torna-se gradualmente alargada baço (esplenomegalia), com quantidades crescentes de neutrófilos.

Deve-se notar que RT também são gerados em outros modelos de cancro, incluindo ambos os tumores mamários (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 e K-ras tumores pulmonares motrizes) espontâneos e injectado (AT-3 de ratinho (MMTV-PyMT) e carcinoma da mama E0771 células, LLC Lewis células de carcinoma de pulmão e células de melanoma B16-F10). No entanto, a extensão da mobilização de neutrófilos nestes tumou modelos é muito menos do que de ratos 4T1-inoculadas, atingindo 5-10 x 10 ⁶ neutrófilos em 1 ml de sangue após 3 semanas.

Protocolo

Animais: 5-7 semanas de idade BALB / c ratos são comprados na Harlan (Israel). Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Cuidado e Uso de Animais Comitê Institucional da Universidade Hebraica (IACUC). Amostras humanas: Recolha de sangue de pacientes com câncer e voluntários saudáveis ​​foi aprovado pela Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Indução de neutrófilos com propriedades anti-tumorais in vivo utilizando um modelo de cancro da mama do rato.

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas utilizando soluções estéreis em um fluxo de ar laminar gabinete (LAF) Bio-Segurança.

1. Semente de 5 x 10 ⁵ células 4T1 em 100 milímetros placa de cultura de tecido em 10 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 2 mM de D- glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina. Incubar the as células a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de _CO2 durante 3 a 4 dias. Assegurar que as pilhas são de 50 - 100% confluente no dia da experiência.
2. Para retirar as células tumorais a partir da placa de cultura de tecido, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 5 ml de PBS, aspiração do PBS e adicionar 3 ml de uma solução de tripsina a 2,5 g / L. Incubar as células a 2-3 minutos com tripsina a 37 ° C.
3. Adicionar 10 ml de meio contendo soro para neutralizar a tripsina e pipeta cima e para baixo até que todas as células foram removidas. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL cónico.
4. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min à TA. Aspirar o meio deixando 200 ul de meio acima do sedimento celular. Ressuspender as células no volume residual e adicionar 10 ml de PBS. Inverta o tubo 2-3 vezes para obter uma suspensão celular homogênea e retirar 10 ml para contar as células em um hemocitómetro. Use azul tripano para distinguir entre as células vivas e mortas.
5. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 200 xg à temperatura ambiente. Aspirar o PBS e ressuspender as células em PBS a uma concentração final de 2 x 10 ⁶ células / ml. Assegure-se que a suspensão de célula única não tem qualquer aglomeração.
6. Injectam-se 1 x 10 ⁶ células 4T1 4T1 ou células em 50 ul de PBS ortotopicamente na almofada de gordura mamaria inguinal esquerda de ratinhos fêmea BALB / c, utilizando uma seringa de 0,3 ml com uma agulha de 30G x 8 milímetros que expressam a luciferase.
   1. Antes da injecção, anestesiar os ratos em uma câmara de indução que recebem um caudal lento de isoflurano (3-5%) em 100% de oxigénio.
   2. Coloque o mouse sobre um bloco cirúrgico estéril e verifique se a cabeça está devidamente colocado no interior do cone do nariz isoflurano. Confirme anestesia adequada por beliscar a pata. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. Raspar o cabelo em torno do local da injecção e desinfectar com etanol 70%.
   3. Use um conjunto estéril de instrumentos cirúrgicos para fazer uma pequena incisão horizontal (5 mm) aproxa meio caminho entre o madamente inguinal e os mamilos abdominais, expor a almofada de gordura e injectar 1 x 10 ⁶ células 4T1 em 50 ul. Feche as incisões com clips nove milímetros que devem ser removidos uma semana depois. A injecção de células que expressam luciferase permite a monitorização do tamanho do tumor e metástases por imagem de bioluminescência.
      NOTA: Este procedimento minimamente invasivo não requer nenhum tratamento pós-cirúrgico e os camundongos injetados recuperar dentro de 2-3 min.
   4. Monitorar os ratos até que recupere a consciência, e certifique-se que recupere a consciência plena antes de ingressar na companhia de outros ratos.
7. Depois de 3 - 4 semanas, quando o tumor primário tenha atingido um volume de 2 ^cm3, sacrificar os ratinhos por um lento fluxo de CO _2, e imediatamente após o último ar, obter o sangue por punção cardíaca, usando uma 25G x 5/8 "agulha ligada a uma seringa de tuberculina de 1 ml de pré-tratadas com heparina. Mantenha a boca da agulha para cima ao inserir oseringa na posição horizontal através do diafragma para o coração, e lentamente e gradualmente tirar o sangue evitando um excesso de pressão (Figura 3).

2. Neutrophil Isolamento

1. Isolamento de neutrófilos citotóxicas a partir de sangue de ratinhos portadores de tumor.
   1. Dilui-se 1 ml de sangue retirado de um rato portador de tumor (ver Protocolo 1,11) em PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) a um volume final de 6 ml.
   2. Fracionamento de sangue diluído em um gradiente de sacarose descontínuo preparada na hora:
      1. Adicionar 3 ml de estéril-filtrada sacarose 1,119 g / ml a parte inferior de uma de 15 ml de polipropileno cónico do tubo de centrifugação.
      2. Devagar e com cuidado, a camada de 3 mL de estéril-filtrada sacarose 1,077 g / ml no topo do g / ml camada de 1.119. Em seguida, adiciona-se lentamente e com cuidado os 6 ml de sangue diluído (protocolo 2.1.1) na parte superior do 1,077 g / ml camada (Figura 4A). Recomenda-se para segurar o tubo inclinado e umdding os diferentes componentes através de um fluxo lento, mas contínuo, mantendo a boca da pipeta na direcção da parede inferior do tubo, de tal modo que não é formada turbulência.
   3. Centrifuga-se o tubo contendo o sangue diluído no gradiente de sacarose a 700 xg durante 30 min à TA sem travão.
   4. Cuidadosamente remover o tubo da centrífuga sem provocar qualquer turbulência. A maioria dos eritrócitos será na parte inferior do tubo. Neutrófilos de alta densidade (HDN) encontram-se como um anel branco-a-vermelho na interface entre a 1,119 g / ml e as camadas de 1,077 g / ml (cerca de 3 ml a marca), enquanto os leucócitos de baixa densidade são encontrados em um anel branco no interface entre a 1.077g / ml e a camada de BSA-PBS contendo (em torno da marca de 6 ml, ver Figura 4B).
   5. Aspirar o PBS + BSA a 0,5%, até atingir 5 mm acima da camada de células de baixa densidade. Pipeta as células de baixa densidade por sucção lenta numa ponta 1 ml através lentamente roda em torno das células.Transferir as células em 30 ml de PBS com 0,5% de BSA.
   6. Aspirar a camada superior do mesmo tubo de gradiente até atingir 5 mm acima da banda de células de alta densidade. Pipetar as células de alta densidade, que são principalmente os neutrófilos de alta densidade, e transferir as células em 30 ml de PBS contendo 0,5% de BSA.
   7. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   8. Aspirar o sobrenadante e lisar eritrócitos por ressuspensão das células em 36 ml de água de qualidade para HPLC estéril durante 30 segundos. A isotonicidade deverá ser restaurada através da adição de 9 ml de um concentrado 5x PBS suplementado com 2,5% (w / v) de BSA.
   9. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS-BSA. Contar o número de neutrófilos em um hemocitómetro e utilizar azul de tripano para distinguir entre células vivas e mortas.
   11. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente e ressuspender os neutrófilos no meio de incubação desejado para a densidade celular final. Usoos neutrófilos imediatamente.
   12. Então, depois de outra centrifugação, ressuspender as neutrófilos no meio de incubação a densidade celular final. Use os neutrófilos imediatamente.
2. Isolamento de neutrófilos em circulação de pacientes com cancro.
   1. Misturar 10 ml de heparina (20 U / ml) de sangue humano com um volume igual de Dextrano T500 a 3% em solução salina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Durante esta incubação, os eritrócitos irá sedimentar.
   2. Preparar um tubo cónico de polipropileno de 50 ml com 10 ml de sacarose 1,077 g / ml e camada lentamente o sobrenadante rico em leucócitos no topo do 1,077 g / ml de camada de sacarose (Figura 4C).
   3. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente sem travão. Os neutrófilos de alta densidade (HDN) aparece no sedimento. Neutrófilos baixa densidade (LDN) co-purifica com monócitos e linfócitos na interface entre a 1,077 g / ml de camada de sacarose e de plasma (Figura 4D).
   4. Volte a suspender as neutrófilos em 10 ml 0.2% de NaCl durante 30 segundos para lisar os eritrócitos contaminantes, e restaurar a isotonicidade pela adição de 10 ml de 1,6% de NaCl e inverter uma vez.
   5. Centrifugar 5 min a 160 xg à temperatura ambiente, e lava-se três vezes em 20 ml de solução salina equilibrada de Hanks. Centrifugar após cada lavagem e aspirar o sobrenadante.
   6. Contagem de neutrófilos e ressuspender as células em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 2% a 2 x 10 ⁶ / ml neutrófilos ou como desejado.

3. O enriquecimento de sangue neutrófilos utilizando pérolas magnéticas

1. A selecção positiva
   1. Tomar 1 ml de sangue a partir de um rato conforme descrito no protocolo de 1,8, com uma seringa heparinizada.
   2. Centrifuga-se o sangue num tubo de 15 ml a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Aspirar o sobrenadante ou manter o plasma do sangue para estudos posteriores.
   4. Lisar as eritrócitos por ressuspensão das células em 8 ml de água de grau HPLC. Após 30 seg restaurar isotonicidade, adicionando 2 ml de 5x concentrated PBS contendo 2,5% de BSA. Contar as células.
   5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   6. Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de PBS contendo BSA a 0,5% e 2 mM de EDTA a 10 por ⁸ células.
   7. Adicionar 50 ul de anticorpo anti-Ly6G biotinilado. Misturar bem e incubar durante 10 min no refrigerador (não em gelo).
   8. Adicionar 150 ul de PBS frio contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
   9. Vortex a solução revestido anti-biotina estoque microbead magnético. Transferir 100 uL de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 15 min no refrigerador (não em gelo).
   10. Lave as células por adição de 10 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
   11. Aspirar o sobrenadante completamente, e ressuspender em 500 ul de PBS frio contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
   12. Inserir uma coluna de separação magnética em um suporte magnético que está ligado a um suporte magnético, e lave-o com 500 mL PBS frio contendo 0.BSA a 5% e 2 mM de EDTA.
   13. Aplicar a suspensão de células na coluna. O flow-through contém células LyG6-negativo não marcados.
   14. Lava-se a coluna com 500 ul de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. As células não marcadas adicionais estarão no fluxo de passagem.
   15. Repetir o passo de lavagem com mais 500 ul de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
   16. Remova a coluna do ímã e coloque-o em um tubo de coleta de 15 ml. Adicionar 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e lavar as células magneticamente marcadas por firmemente empurrando o êmbolo para dentro da coluna. O fluxo através contém neutrófilos Ly6G ^+.
2. Selecção negativa
   1. Prepare leucócitos do sangue acordo com os passos 3.1.1 a 3.1.5.
   2. Ressuspender 1 x 10 ⁸ células em 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, num tubo de fundo redondo de 5 ml de poliestireno.
   3. Adicionar 50 uL de soro normal de rato.
   4. Adicionar 50 ul de neutrófilos c enriquecimentoocktail (contendo anticorpos biotinilados específicos para as células brancas do sangue não de neutrófilos), misturar bem e incubar durante 15 min no microondas.
   5. Lavam-se as células pela adição de 4 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
   6. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
   7. Adicionar 50 ul de complexos de anticorpos tetraméricos dirigidos contra biotina e dextrano. Misturar bem e incubar durante 10 min no microondas.
   8. Vortex bem o tubo contendo as esferas magnéticas revestidas com dextrano antes da adição de 150 ul de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 10 min no microondas.
   9. Trazer a suspensão de células para um volume total de 2,5 ml por adição de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. Misture com cuidado para obter uma suspensão de células homogênea.
   10. Insira o tubo (sem a tampa) para dentro do ímã, e deixe repousar por 3 min.
   11. Inverter o ímã com o tubo em um contínuomovimento de tal modo que as células não ligadas no fluido vai ser transferido para um novo tubo. Deixe o ímã e tubo invertido para 2-3 sec, em seguida, retornar à posição vertical. As células indesejadas magneticamente marcadas permanecerá ligada à parede do tubo original, enquanto que os neutrófilos não ligadas será no líquido transferido.

4. citológica Coloração de neutrófilos

1. Ressuspender 1x10 ⁵ neutrófilos em 50 ul de PBS e transferir a suspensão de células a um adaptador de célula de preparação em camada fina, tal como um Cytospin. Centrifugar a placa a 150 xg durante 5 min. Separa-se a lâmina de vidro pré-marcado a partir do adaptador.
2. Fix células mediante imersão das lâminas de vidro em etanol a 70% durante 2 minutos. Permitir que os preparativos do adaptador (veja o passo 4.1) para secar à temperatura ambiente antes da coloração. Mergulhar as lâminas 5-6 vezes em água destilada.
3. Manchar 1-2 min em solução de hematoxilina de Mayer. Enxágüe 1 min em água da torneira. Manchar 10 seg em solução Eosina Y . Lavar em água da torneira. Desidratar por lavagem das lâminas em concentrações crescentes de etanol (70%, 96% e 100%). Deixe a lâminas de vidro ar seco em breve e inspecionar as lâminas com um microscópio de luz.
   NOTA: Hematoxilina tem uma cor e manchas azul-violeta profundo ácidos nucleicos, enquanto eosina é rosa e manchas proteínas não especificamente. Os grânulos citoplasmáticos de neutrófilos permanecem sem mácula por corantes ácidas ou básicas, que é a origem do nome "amar ser neutro '. Considerando basophilic granulócitos mancha azul escuro com hematoxilina e eosina e eosinophilc granulócitos vermelho brilhante, neutrófilos aparecem rosa neutro (ver Figura 1A). Neutrófilos maduros são caracterizados por um núcleo polimorfonucleares, que é, em geral, grandes, com 2-5 lóbulos neutrófilos segmentados '' (Figura 1A e 1C). Neutrófilos imaturos são caracterizados por um núcleo ou curvada em forma de anel uma lóbulos (Figura 1B).

ve_title "> 5. Determinação da pureza dos neutrófilos por citometria de fluxo.

1. Ressuspender 1x10 ⁶ células em 100 ul de tampão FACS (PBS contendo BSA a 0,5%, EDTA a 2 mM e 0,02% _{de NaN3).} Para amostras de sangue total, a hemólise é necessário antes da coloração (passos 3.1.1 a 3.1.5). Adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR durante 5 min.
2. Adicionar 0,5 ug de anticorpo fluorescente marcado com especificidade para Ly-6G para neutrófilos de rato ou de CD11b e CD66b para os neutrófilos humanos, misturar bem e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
3. Ajustar o volume para 500 mL com PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM e analisar a coloração por citometria de fluxo.

6. Siga os neutrófilos Gate in vivo

1. Na rotulagem BrdU vivo de neutrófilos
   1. Injectar 100 ul de uma solução a 10 mg / ml de bromodesoxiuridina (BrdU) em PBS estéril por via intraperitoneal a ratinhos portadores de tumor.
   2. Isolar neutrófilos no sangue 48 horas após a injecção de umegundo Protocol 2.1. Neutrófilos utilizando um kit de mancha fluxo BrdU marcado com BrdU.
2. CFSE rotulagem de neutrófilos
   1. Ressuspender 10 ⁷ neutrófilos em 1 mL de PBS pré-aquecido.
   2. Adicionar 2 mL de uma solução estoque 5 mM CFSE para os neutrófilos suspensos a uma concentração final de 10 uM. Misturar bem e incubar durante 15 min a 37 ° C. CFSE 5 mM é preparada por dissolução de 2,8 mg de CFSE (5- (e 6 -) - carboxifluoresceína diacetato, éster de succinimidilo) em 1 ml de DMSO. Divida em 10 mL alíquotas em tubos estéreis e 200 ul loja no escuro a -20 ° C.
   3. Neutralizar o excesso de CFSE por adição de um volume igual de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C. Centrifugar os neutrófilos a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Lavar os neutrófilos duas vezes em 10 ml de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS.
   4. Centrifugar a 400 xg durante 10 min e ressuspender em um volume apropriado de PBS. Os neutrófilos (por exemplo, 1 x 10 ⁷ Células) pode agora ser injectado por via intravenosa ou por via de injecção cardíaca de ratinhos receptores.

7. In vitro ensaio de luciferase para monitorar a atividade anti-tumoral de Isolado neutrófilos.

1. Cultivar as células tumorais marcadas com luciferase como descrito para as células 4T1 em Protocolo 1,1-1,5, mas ressuspender as células dissociadas com tripsina em meio de soro reduzido optimizado suplementado com 2% de FBS. Ajustar a densidade de células de 5 x 10 ⁴ culas por ml.
2. Semente 5000 células tumorais marcadas com luciferase em 100? L de meio de soro reduzido optimizado contendo FBS a 0,5% em cada cavidade de um branco de fundo plano de 96 de cultura de tecidos bem placa.
3. 4 horas depois de semear as células tumorais, adicionar 1 x 10 ⁵ neutrófilos em 50 ul de meio de soro reduzido optimizadas contendo 0,5% de FBS, e incubar O / N. Prepara-se uma suspensão de células de neutrófilos, com uma densidade de 2 x 10 ⁶ células / ml. Os poços de controlo deve obter 50 � de meio sem neutrófilos. Fazmúltiplas repetições de cada configuração experimental.
4. Na manhã seguinte, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e lava-se cada poço com 200 ul de PBS. Aspirar o PBS e adicionar 50 ul de tampão de lise passivo. Para as células facilmente destacando (tais como AT-3 células), não lavar em PBS e adicionar o tampão de lise de cultura celular imediatamente após a aspiração do meio de crescimento.
5. Cobrir a placa com folha de alumínio e incuba-se que num agitador orbital a 150 rpm durante 20 min à temperatura ambiente.
6. Colocar a placa num leitor de placas de luminescência. Injectar bem-wise 50 ul solução de ensaio de luciferase, e leia a quimiluminescência de 10 segundos por poço.
7. Calcula-se a lise do tumor% pela seguinte fórmula:% de lise do tumor = (1- [luminescência das amostras com neutrófilos] / [luminescência das amostras em forma]) x 100%.

NOTA: Para avaliar a contribuição de neutrófilos para semeadura metastático, os neutrófilos pode estar esgotada, conforme descrito no protocolo 8.1. Para depl eficazEtion administrar anticorpos que destroem o neutrófilo, começando no dia 7 enxerto pós-tumor.

Atividade 8. Anti-metastático de neutrófilos em um cancro da mama Modelo rato.

1. A depleção in vivo de neutrófilos.
   1. Recentemente preparar 12,5 ug de anticorpo anti-rato Ly6G (neutrófilos anticorpo esgotar) ou de anticorpo de rato de controlo de isotipo (IgG _2a, Κ) em solução salina a um volume final de 100 ul por rato.
   2. Começando no dia 3 enxerto pós-tumor injetar uma dose diária intraperitoneal de 12,5 mcg rato anticorpo anti-Ly6G (100 mL). Injetar camundongos de controle com ou 12,5 g (100 ul) de anticorpo de controlo de isotipo de rato _(2a IgG, Κ).
   3. Começando no dia 14, os anticorpos administrar duas vezes por dia, conforme a taxa de produção de neutrófilos aumenta dramaticamente quando o tumor cresce 4T1.
   4. A cada dois dias, obter uma amostra de sangue (2-3 gotas) por entalhar a cauda-veia lateral. Recolher o sangue em um anti-coagulant contendo tubo (heparina, citrato ou EDTA).
   5. Verifique a depleção de neutrófilos por citometria de fluxo, como descrito no Protocolo nº 5.
2. Teste de Neutralização do tumor (Ensaio de modificação Winn)
   1. Isolar os neutrófilos a partir de murganhos portadores de tumor. Misturar 1 x 10 ⁶ células tumorais e 3 x 10 ⁶ neutrófilos em 50 ul de soro fisiológico (por ratinho).
   2. Injectar as células subcutaneamente para o flanco de 6 - 8 semanas de idade sem tratamento prévio com ratos BALB / c. Raspar o flanco antes do enxerto tumor para permitir medições precisas do tamanho do tumor. Meça o tamanho do tumor de partida diária no dia 5 pós-enxerto.
3. Neutrófilos transferência adoptiva
   1. Injectar 2 x ⁴ 10 células de tumor que expressam luciferase em 200 ul de PBS na veia da cauda.
   2. Neutrófilos transferência deve ser feita 4 horas a seguir à injecção de células tumorais. Assim, começam a purificação de HDN de ratinhos portadores de tumor (protocolo 2.1) cerca de 2 horas antes da sua prevista emtransferência vivo. Ressuspender neutrófilos em PBS a uma concentração final de 2,5 x 10 ⁷ células / ml.
   3. 4 horas após a introdução das células de tumor os murganhos colocar sob uma lâmpada de aquecimento durante 5 min. Colocar os ratos num limitador e injectar 5 x 10 ⁶ HDN (200 ul) via veia da cauda. Os ratinhos de controlo são injectados com veículo (PBS).
   4. Monitorar a formação de metástases pulmonares em vários pontos de tempo, utilizando um sistema de imagem em bioluminescência vivo ou por imuno-histoquímica.
4. Lung ensaio semeadura metastático
   1. Injectar 0,5-1 x 10 ⁶ células 4T1 parentais ortotopicamente na almofada de gordura mamária inguinal esquerda, conforme descrito no Protocolo 1.
   2. No dia 10, ressuspender-4T1 expressando GFP células em PBS a uma concentração final de 5 x 10 ⁵ células / mL. Colocar os ratos sob uma lâmpada de aquecimento durante 5 min.
   3. Colocar os ratos num limitador e injectar 1x10 ^5-4T1 expressando GFP células (200 ul) por via intravenosa a 4T1 ratinhos portadores de tumor ou ratinhos naive.
   4. No dia seguinte, sacrificar os ratinhos e perfundir os pulmões com 20 ml de PBS para remover os glóbulos vermelhos restantes.
   5. Extirpar os pulmões para análise de células GFP positivas por imuno-histoquímica.
      NOTA: Para avaliar a contribuição de neutrófilos para semeadura metastático, os neutrófilos pode estar esgotada, conforme descrito no protocolo 8.1. Para esgotamento eficaz administrar anticorpos que destroem o neutrófilo, começando no dia 7 enxerto pós-tumor.

9. Supressão da proliferação de células T por Neutrófilos de Ratinhos portadores de tumor.

1. Remover o baço de um ratinho BALB naïve / c mouse e lugar sacrificados em 10 ml de PBS.
2. Inserir o baço para um filtro de células de 40 um que é apto numa placa de petri cheia com meio RPMI-1640. Usando a extremidade do êmbolo da seringa, triturar o baço através das células filtro no prato de petri. Lavar o filtro de células com 5 ml RPMI. Descarte o filtro.
3. Transferir as células ressuspensas para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
4. Descartar o sobrenadante, e lisar os eritrócitos por suspensão das células em 36 ml de água pura durante 20 segundos, e se ajustar a isotonicidade pela adição de 4 ml de PBS concentrado x 10. Alternativamente, lisar os eritrócitos por suspensão das células em 5 ml de eritrócitos tampão de lise (ACK), e incuba-se 5 minutos à TA. Neutralizar o ACK através da adição de 10 ml de meio RPMI-1640. Centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Volte a suspender as células em 5 ml PBS e contar as células.
5. Ressuspender as esplenócitos em PBS para uma densidade final de 4 x 10 ⁷ células / ml em 2 15 ml de tubo. Adicionar 2 ml de uma solução CFSE 2,5 uM em PBS. Inverter rapidamente o tubo e incubar durante 10 min a 37 ° C com mistura ocasional (2 min cada), protegida da luz.
6. Extingue-se o excesso de CFSE por adição de 4 ml de FBS a pré-aquecido (100%) e incubar durante 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 3 ml de PBS e centrifugar a 400 xg durante 10min.
7. Lavam-se as células com 30 ml de PBS, e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
8. Filtrar as células através de um coador de células de 40 ^ m e lavar novamente com PBS.
9. Ressuspender as células em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10% para uma densidade final de 2 x 10 ⁷ células / ml.
10. Semente de 2 x 10 ⁶ / poço (200 ul) numa placa de cultura de tecidos de 24 poços.
11. Estimular as células por adição de 1 ug de anticorpo purificado de hamster arménio anti-ratinho CD3ε em 500 ul de RPMI-1640 com 10% de FBS.
12. Adicionar 2 x 10 ⁶ HDN ou LDN em 300 ul de meio RPMI-1640 com FBS a 10% para os esplenócitos CFSE marcados, e incubar durante 3 dias a 37 ° C. Wells sem neutrófilos deve obter 300 � de meio. O volume total em cada poço deverá ser de 1 ml.
13. Recolher as células e prepará-los para citometria de fluxo. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS (Protocolo 5), e adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR. Incubar durante 5 min à TA.
14. Adicionar 1 &# 956; l de anticorpo anti-CD8a de APC-conjugado e incuba-se durante 15 min à TA.
15. Determinar a intensidade de fluorescência CFSE em células T CD8 ⁺ por citometria de fluxo (Figura 5). A intensidade CFSE é reduzido pela metade a cada divisão celular. Assim, o número de divisões de células pode ser determinada pela intensidade de coloração com CFSE.

10. Ensaio de migração de neutrófilos

1. Semente de 5x10 ⁵ células 4T1 em 7 ml de meio de soro reduzido optimizadas suplementado com 0,5% de FBS num frasco de cultura de tecido ² 25 centímetros e incubar 24 horas a 37 ° C.
2. Transferir 800 uL do sobrenadante para a câmara de fundo de uma placa de migração com um tamanho de poro de 5 um.
3. Ressuspender 2 x 10 ⁵ neutrófilos em 400 ul de meio de soro reduzido optimizado, suplementado com 0,5% de FBS. Aplicar a suspensão de células na câmara de topo e incubar durante 2 horas a 37 ° C.
4. No final da incubação, remover a câmara de topo econtar o número de neutrófilos que migraram para a câmara inferior.

11. Monitoramento de neutrófilos produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS).

1. Prepare a 1,1 x 10 ⁶ neutrófilos / ml em solução salina equilibrada de Hank sem vermelho de fenol. Placa de 180 ul contendo 2 x 10 ⁵ neutrófilos em cada poço de uma placa branca de fundo liso de 96.
2. Colocar a placa num leitor de placas de luminescência. Adicionar 20 ul de uma solução 500 uM luminol em PBS a cada poço para se obter uma concentração final de 50 uM. Leia a quimioluminescência basal para 1s em um curso de tempo de 5 minutos com intervalos de 10 segundos.
3. Adicionar um estimulante (por exemplo, PMA, a uma concentração de 10 nM ou 100 nM ou fMLP a uma concentração de 10 uM). Prepara-se uma solução 10x concentrado de cada agente em solução salina equilibrada de Hank sem vermelho de fenol e adicionar 22 uL aos respectivos poços. Adicionar aos poços de controlo de veículo de 22 ul.
4. Measure a quimioluminescência no leitor de placas. Fazer ambos a uma curta (a cada 10 segundos durante 5 min) e um longo (a cada minuto durante 1 hr) curso de tempo.

Resultados

Em um estudo recente, identificamos uma função anti-metastático para os neutrófilos ^6. Os neutrófilos de ratinhos portadores de tumores adquirem um fenótipo citotóxico e têm a capacidade de matar células tumorais ^6. Isto está em contraste com os neutrófilos a partir de ratinhos ingénuos que não têm efeito anti-tumoral significativa ^6. Várias das técnicas descritas na secção Protocolo têm sido utilizados para estudar a função dos neutrófilos anti-tumoral in vitro...

Discussão

Os neutrófilos são a mais abundante de todas as células brancas do sangue e são os primeiros socorros em casos de infecção e inflamação. Como tal, eles são muito sensíveis a estímulos externos e são facilmente activado. Além disso, os neutrófilos tem uma meia-vida muito curta e um volume de negócios rápida. Juntas, essas características levantam várias dificuldades em trabalhar com neutrófilos, de tal forma que estratégias experimentais originais são necessários. Por exemplo, existem várias estrat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12x75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11