一氧化氮和超氧化物歧化酶恩的人脸检测在完整的动脉内皮细胞层

摘要

在这篇文章中我们将介绍使用荧光染料diaminofluorescein-2双乙酸钠（DAF-2DA）和二氢乙啶（DHE）对恩面对同时检测和细胞内一氧化氮的可视化（NO）和超氧阴离子（O ₂的调整相对容易的方法^.- ）分别在新鲜分离的肥胖小鼠模型中的完整主动脉。

摘要

内皮源性一氧化氮（NO）从内皮NO合酶（eNOS）的生成是在心血管生理学的最重要的血管保护分子中的一个。功能失调性的eNOS如eNOS的解偶联导致在超氧阴离子NO生物利用度和增加而减少（O ₂ ^.-）生产，并反过来促进心血管疾病。因此，NO和O ₂ ^.-在内皮细胞水平的适当的测量是关键对心血管疾病和并发症的研究。因为NO和O ₂ ^.-的极不稳定的性质，它是难以测量NO和O ₂ ^.-直接在血管中。许多方法已被开发来测量NO和O ₂ ^.-生产。它是，然而，无论是不敏感的，或非特异性，或技术要求高，并需要特殊的设备。在这里，我们描述了一个适应为连接面同时检测和细胞内NO和O ₂的可视^.-使用细胞渗透性diaminofluorescein -2-二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢乙（DHE），分别在感应的肥胖小鼠模型中的完整主动脉的荧光染料的方法的高脂饮食喂养。相比于对照贫鼠标我们能证明降低细胞内NO和增强_的 O ₂ ^.-水平肥胖小鼠的新鲜分离完整主动脉。我们表明，该方法是对NO的直接检测和可视化和O ₂的简单的技术^.-在完整的血管，可广泛适用于（生理）病理条件下的内皮（DYS）函数的调查。

引言

血管内皮细胞通过释放血管活性因子¹保持血管功能和结构的完整性。在这些因素中，内皮衍生的一氧化氮（NO）通过内皮NO合酶（eNOS）的由L-精氨酸产生的是在心血管生理学²的最重要的和最特征的因素。否引起平滑肌松弛，抑制细胞增殖，抑制血小板聚集和炎性细胞的粘附和浸润到内皮下间隙，因此防止血管疾病发展^3。在许多生理和病理条件，包括衰老，高血压，糖尿病，高脂血症等 ，血管内皮功能障碍特征在于减少NO的生物利用度，增加_的 O ₂ ^.-生产存在，促进动脉粥样硬化²的发病机理。从近几年的研究表明，eNOS的解偶联是一种为内皮功能障碍，其中，所述的eNOS酶生成O ₂ ^.-代替否重要机制，各种上述条件^1,4下。因此，血管内皮功能的分析，特别是，内皮NO生产和O ₂ ^.-的产生是关键对心血管疾病和并发症的实验研究。

有迹象表明，已经开发了分析和测量生物样品中的NO产生无数的方式方法。由于NO的极其不稳定性质而容易被氧化为NO ₂ ^-和NO ₃ ^-中的3至6秒的半衰期，这是困难的否直接测量。因此测定的NO ₂ ^- / NO ₃ ^-中的流体样品中的被用作从细胞或组织⁵释放NO的索引。虽然过程是比较容易的，该方法是，然而，EA/ NO ₃ ^{- -}溶液中所含的由稳定_的 NO ₂的高背景sily影响。因为没有刺激可溶性鸟苷酸环化酶产生环磷酸鸟苷（cGMP）的^6，细胞的cGMP水平也被确定为估算释放NO ^7。再次，这是一种间接的估计和可能不是特定的，因为某些内皮源性因子如C型利钠肽（CNP）也可以通过微粒的鸟苷酸环化酶⁸的激活提高cGMP水平。否是从L-精氨酸与代L-瓜氨酸的生产中作为副产物^9，L-瓜氨酸生产测量因此也用作间接方法来估算的NO产生。这种方法的主要缺点是，它是放射性的，它并不能测量生物活性NO水平，因为释放被O ₂ NO能够迅速灭活^.-;此外，L-瓜氨酸可以再循环到L精氨酸^10。如化学发光检测^11，电子自旋共振^12，或电化学卟啉NO传感器¹³其他化学方法被一些研究者使用。这些方法通常是不容易在操作中，检测程序，并需要特殊的设备。也提到，许多研究应用器官浴实验孤立血管有或没有内皮评估内皮功能和间接测量内皮衍生NO介导的血管松弛。然而，这种方法，虽然它主要是接近生理状况，但是严格的说，不能测量NO的功能，它比较评估一般反映eNOS的功能的净效果，生产的内皮介导的血管舒缩反应其它内皮源性舒张因子和内皮衍生收缩因子，生产O ₂ ^.-的，和平滑肌细胞还响应到这些因素。 eNOS的功能或NO生产的具体分析，通常需要^3。

许多研究小组包括我们具有在所使用的荧光染料的方法来检测细胞内产生NO ^14-19近年来。在此方法中使用的细胞可渗透荧光指示剂diaminofluorescein -2-二乙酸酯（DAF-2DA）来测量在活体外或离体的细胞和组织的分类与NO，NOS功能。其原理是，在活细胞，DAF-2DA由胞内酯酶脱乙酰非荧光-4,5- diaminofluorescein（DAF-2），然后将其转换成由与NO反应以荧光DAF-2三唑（DAF-2T） 。从DAF-2T的荧光可在荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜¹⁴下进行观察。因此，细胞内荧光强度反映在细胞中的细胞内NO的产生或一个在完整血液vesse内皮湖与特定的荧光染料，如二氢乙（DHE）相结合，可以同时评估细胞内的NO和O ₂ ^.-代细胞或血管^14。同样，DHE也是被O ₂氧化的细胞渗透性化合物^.-在细胞内，和氧化产物，然后用核酸插层以发射明亮的红色荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜定量检测的。 DHE是用于检测_的 O ₂ ^.-从生物样品中的一个非常具体的染料，因为它检测基本上超氧自由基，通过细胞保持良好，甚至可能容忍温和定影^20。一的该荧光染料的方法的一个优点是，它检测到并直接为生血管的完整内皮层上可视NO和/或O ₂的^.- 烯面 。

在本文中，我们描述这种荧光染色法检测NO和O ₂ ^.-这是我们改编为EN人脸检测NO和O ₂ ^.-在高脂饮食（HFD）喂养引起的肥胖小鼠模型的完整的主动脉。我们表明，该方法能够成功，可靠地测量NO和O ₂ ^.-水平及肥胖新鲜分离的完好鼠标主动脉内皮细胞层的eNOS评估（DYS）函数。

研究方案

动物的工作被批准瑞士弗里堡的兽医办公室的伦理委员会。该协议是继动物护理和实验的指导方针在我们的机构。

1.建立用于隔离动脉孵化的制备

1. 构造的器官浴系统，其可以被加热到37℃，并与来自碳气体罐95％O ₂和5％CO ₂通气。
2. 根据需要与下列组合物的浓度制备尽可能多的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液:（118毫摩尔NaCl，4.7毫摩尔的KCl，2.5mM的_氯化钙 ，1.2毫_硫酸镁 ，1.2毫KH ₂ PO _4，25mM的_碳酸氢钠 ，0.026毫摩尔EDTA，和11.1毫D-葡萄糖）。
3. 保持在冰上的储备缓冲和通气用95％ _的 O ₂和5％的CO ₂的缓冲器_。
4. 开关器官浴系统上，在37℃设定温度，加入5毫升准备使用的缓冲液中向每个腔室并保持曝气用95％ _的 O ₂和5％的CO ₂的缓冲器。
5. 用Krebs-Ringer缓冲液洗室一次30分钟。
6. 添加5毫升的Krebs-Ringer缓冲液到每个腔室并覆盖所述室，以避免蒸发。

2.鼠标主动脉的分离

1. 注入将其溶于0.9％NaCl中腹膜内，在150毫克/千克的浓度牺牲小鼠戊巴比妥。
2. 仰面躺在鼠标放在手术板上。
3. 喷胸部区域的毛皮用70％乙醇消毒和水分的目的。
4. 通过在肋切开胸腔，暴露心脏和肺部，并取出肺。
5. 在胸腔用纸巾清除血液平缓。
6. 用镊子轻轻抓住心脏和切割主动脉和脊椎手术剪的血管周围脂肪组织分离胸主动脉。
7. 立即浸入wholÈ组织在冰冷的（4℃）的Krebs-Ringer缓冲液。
8. 解剖显微镜下取出心脏和主动脉弓，并保持胸主动脉段在缓冲区中。
9. 从解剖与手术剪刀​​和镊子在显微镜下秉承血管周围组织无主动脉。
10. 掌握主动脉的端部边缘与镊子，并通过用26 G×1 / 2"注射器轻轻冲洗的Krebs-Ringer缓冲液冲洗掉在血管管腔的血液。
11. 切开洗净主动脉环为3毫米长的段。
    注意:在这一步要注意不损伤内皮细胞层。

3. DHE和DAF-2DA染色

1. 传送清洗主动脉段用钳子向在37℃下填充有的Krebs-Ringer缓冲液的器官浴室通入95％O ₂和5％ _的 CO _2。
   注:轻触只用钳子主动脉环的外膜侧，不钳的Blood船只。
2. 平衡在器官浴室中的动脉30分钟。
3. 添加乙酰胆碱到器官浴中，以最终浓度为1μM，孵育动脉10分钟。
4. 制备将1ml DHE / DAF-2DA溶液（每种染料的5微米，从1000×库存稀释）用温热的预的Krebs-Ringer缓冲液中的1.5 ml离心管中。包装用铝箔的离心管中，以避免光线照射。
5. 刺激后，从器官浴转移主动脉环到DHE / DAF-2DA溶液在微量离心管在37℃下用95％ _的 O ₂和5％CO ₂充气和孵化的主动脉环30分钟。
   注意:从这个步骤中，在黑暗始终保持主动脉。
6. 转移主动脉环至新的离心管中的Krebs-Ringer缓冲液洗涤和重复洗涤1分钟内三次。
7. 转移主动脉环至4％多聚甲醛溶液固定30分钟。
8. 制备1毫升4-'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（300纳米，从1000×库存稀释）用磷酸盐缓冲盐水（PBS）在1.5ml微量离心管中缓冲。染液主动脉3分钟。
9. 转移主动脉到新的离心管，用PBS缓冲液洗涤1分钟。重复洗涤三次。
   注意:注意不要夹住主动脉环或损坏的内皮细胞层。

4. 恩面对安装

1. 加安装介质向滑动的下降。
2. 用显微剪刀纵向切开主动脉环镜下，使卷起的主动脉平并挂载恩面对与朝下于载玻片上内皮的安装介质上。不要移动主动脉来回。
3. 盖上盖玻片幻灯片和密封用指甲油的幻灯片。
4. 在轻保护空气干燥后，用幻灯片成像可怕ctly小时内或将它们存储在-20℃，接下来的几天。

5.共聚焦显微成像

1. 使用共聚焦显微镜检测荧光信号。开动机器，优化成像设置，如放大，扫描速度，分辨率，Z-堆栈。
   1. 对于这个协议，请使用200 Hz的扫描速度，分辨率为1,024×1,024像素为0.25微米的Z-步长。从DAF-2DA激发荧光用488nm的氩激光在515nm处检测，而在514毫微米从DHE激发荧光和在605nm发射检测。
2. 使用10X放大倍率为重点样本，直到DAPI信号是紫外线清晰，然后调整目标，40X的放大倍率。
3. 通过调整控制面板上的Z位置定义内皮细胞层的范围内。 DAPI染色细胞核的信号是在内皮细胞层椭圆形或圆形的点。
4. 从顶部扫描样品通过内皮信号和记录图像的整个厚度（在管腔边界内皮细胞层）。选择用于扫描每个样品至少3种不同的领域。

6.图像的分析

1. 使用软件来打开通过共聚焦显微镜扫描的数据。选择每个领域中的三个连续的图像进行分析，并评价每个样品的至少3个不同的领域。导出所选图像，并将它们保存为JPEG文件。
2. 从量化DAF-2DA，DHE和DAPI与图像处理软件染色图像。从DAPI染色图像，选择"插件"→"分析"→"细胞计数"来算DAPI阳性核的数目。
   1. 从DAF-2DA和DHE染色图像，选择"分析"→"措施"来分析信号的强度，并采取"中庸"值的相对信号强度。本然后将结果作为DAF-2DA到比DAPI阳性细胞核或DAPI DHE的比例。对于每个样品，利用每一个图像和场的平均值。
3. 由平均对照组的划分每个样品的结果，以获得倍数变化。用非配对Student t检验或ANOVA以及Dunnett或邦费罗尼后检验进行统计分析。给数据为平均值±SEM。考虑当p <0.05 ¹⁴平均值作为显著差异。

结果

肥胖是缺血性冠状动脉心脏疾病的重要危险因素，并与相关联的减少内皮NO的生物利用度，动脉粥样硬化性血管疾病²¹的一个标志。的eNOS-解偶联已被证明是血管内皮功能障碍的重要机制众多生理和病理条件，包括老化^22，动脉粥样硬化和肥胖症¹⁴下。因此，在这里我们比较瘦和肥胖小鼠显示NO代表的结果，O ₂ ^.-在主动脉水平。

讨论

NO或O ₂的检测^.-用荧光染料在培养的内皮细胞的许多研究经常被使用，也组织冰冻切片^23。在这里，我们扩展了这种方法，以完整的活的血管， 即 ， 连接面部检测NO的和O ₂ ^.-与DAF-2DA和DHE，分别，这是有效的，比较简单，和直观的内皮细胞层的水平。与在血管冷冻切片的方法相比，这种方法显示出较低的背景并且更定量的，因为在动脉的媒体?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D 1306	dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium	Vector labor. (reactolab)	H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 610M
Microscope	Nikon	SMZ800
Confocal microscope	Leica	DM6000
Image processing software	National Institute of Health (NIH)	Image J
Surgical scissors	S&T AG	SDC-11
Microsurgical scissors	F.S.T	15000-01
Forceps	S&T AG	JF-5
Coverslip round diameter 15 mm	VWR	631-1579
Tips 1 ml	VWR	RFL-1200c
Tips 200 μl	VWR	613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml	Eppendorf	30120086
Acetylcholine chloride	Sigma-aldrich	A-6625