Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Resumo

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O ₂ ^.- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Resumo

óxido nítrico derivado do endotélio (NO) produzido a partir de NO endotelial (eNOS-sintetase) é um dos mais importantes moléculas vasoprotetores na fisiologia cardiovascular. Disfuncional eNOS tais como desacoplamento da eNOS conduz à diminuição da biodisponibilidade do NO e aumento no anião superóxido _(O2 ^.-) produção, e por sua vez promove a doenças cardiovasculares. Portanto, a medida apropriada de NO e O ₂ ^.- níveis nas células endoteliais são fundamentais para a pesquisa sobre doenças cardiovasculares e complicações. Devido à natureza extremamente lábil de NO e _O2 ^.-, é difícil de medir NO e _O2 ^.- directamente num vaso sanguíneo. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir NO e O ₂ ^.- produção. É, no entanto, seja insensível, ou não específica, ou tecnicamente exigente e requer equipamento especial. Aqui nós descrevemos uma adaptaçãoo método de fluorescência de corante para a detecção simultânea PT rosto e visualização de intracelular NO e _O2 ^.- usando a célula permeável diaminofluorescein 2-diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE), respectivamente, em aortas intactas de um modelo de rato de obesidade induzida pela alimentação rica em gordura com a dieta. Pudemos demonstrar diminuição intracelular NO e O reforçada ₂ ^.- níveis nas aortas intactas recentemente isolados de rato obesidade, em comparação com o mouse magra controle. Nós demonstramos que este método é uma técnica fácil para detecção direta e visualização de NO e O ₂ ^.- nos vasos sanguíneos intactos e podem ser amplamente aplicada para investigação da função endotelial (dis) em (fisio) condições patológicas.

Introdução

As células endoteliais vasculares manter a integridade funcional e estrutural vascular pela liberação de fatores vasoativos ^1. Entre estes factores, o óxido nítrico derivado do endotélio (NO) produzido a partir de L-arginina através de NO endotelial (eNOS-sintase) é o factor mais importante e mais bem caracterizado na fisiologia cardiovascular ^2. NO provoca relaxamento do músculo liso e inibe a proliferação celular, inibe a agregação plaquetária e aderência de células inflamatórias e infiltração no espaço subendotelial, por conseguinte, proteger contra o desenvolvimento de doenças vasculares ^3. Sob muitas condições fisiológicas e patológicas, incluindo envelhecimento, hipertensão, diabetes, hiperlipidemia, etc, disfunção endotelial caracterizada pela diminuição da biodisponibilidade do NO e aumentou a produção _{de O2} ^.- está presente e promove a patogénese da aterosclerose ^2. Estudos realizados em anos recentes demonstram que o desacoplamento da eNOS é ummecanismo importante para a disfunção endotelial, em que a enzima eNOS gera _O2 ^.-, em vez de NO, de acordo com as várias condições acima mencionadas ^1,4. Portanto, a análise da função endotelial, em particular, a produção de NO endotelial e O ₂ ^.- geração é crucial para a pesquisa experimental sobre as doenças cardiovasculares e as complicações.

Há várias abordagens metodológicas que têm sido desenvolvidos para analisar e medir a produção de NO em amostras biológicas. Devido à natureza extremamente lábil de NO que é facilmente oxidado a NO ₂ ^- e NO ₃ ^- com uma semi-vida de 3 a 6 segundos, é difícil de medir directamente NO. Portanto, a determinação de NO ₂ ^- / _NO3 ^- nas amostras de fluido foi utilizada como um índice de NO libertado a partir de células ou tecidos ^5. Embora o procedimento é relativamente fácil, o método é, no entanto, eAsily afectados pela alta fundo do NO estável ₂ ^- / _NO3 ^- contido na solução. Porque NO estimula a guanilato ciclase solúvel para produzir monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) ^6, o nível de cGMP celular também foi determinada para estimar a libertação de NO ^7. Mais uma vez, esta é uma estimativa indirecta e não pode ser específico, uma vez que alguns factores derivados do endotélio tais como a-peptídeo natriurético tipo C (CNP) também pode aumentar os níveis de cGMP por meio de activação de ciclase de guanilato em partículas ^8. O NO é produzido a partir de L-arginina com a geração de L-citrulina como um sub-produto ^9, a medição da produção de L-citrulina é, por conseguinte, também utilizada como um método indirecto para estimar a produção de NO. As principais desvantagens deste método são que ele é radioativo e não medir os níveis de NO bioativos, pois NÃO Autorização poderia ser rapidamente inactivado pelo O ₂ ^.-; Além disso, a L-citrulina pode ser reciclado para L-arginina ^10. Outros métodos químicos, tais como detecção de quimiluminescência ^11, elétron de spin ressonância ^12, ou porfirínico eletroquímico NO sensor de ¹³ são utilizados por vários investigadores. Estes métodos geralmente não são fáceis em funcionamento, procedimentos de detecção e requer equipamento especial. É também de referir que muitos estudos aplicar experiências banho de órgãos com os vasos sanguíneos isolados com ou sem o endotélio para avaliar a função endotelial e indiretamente Medida mediada relaxamentos vasculares derivados do endotélio. No entanto, este método, embora seja principalmente perto de situação fisiológica, mas estritamente a dizer, não mede NO função, em vez avalia respostas vasomotores mediada pelo endotélio em geral que refletem efeitos líquidos da função eNOS, a produção de outra relaxante derivado do endotélio factores e factores contratantes derivado do endotélio, a produção de _O2 ^.-, e também as respostas das células musculares lisasa estes factores. A análise específica da função eNOS ou nenhuma produção é geralmente necessária ^3.

Muitos grupos de investigação, incluindo o nosso, nos últimos anos usaram o método do corante de fluorescência para detectar a produção intracelular de NO ^14-19. Neste método, a célula indicadora fluorescente permeável diaminofluorescein 2-diacetato (DAF-2DA) foi usada para medir a função NÃO livre e NOS em células e tecidos in vitro ou ex vivo vivo. O princípio é que nas células vivas, DAF-2DA é desacetilada por esterase intracelular para não-fluorescente de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), que foi depois convertida a fluorescente DAF 2-triazole (DAF-2T) fazendo reagir com NO . A fluorescência a partir de DAF-2T podem ser observados sob um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal de fluorescência ^14. Por conseguinte, a intensidade de fluorescência intracelular reflecte a produção de NO intracelular nas células do endotélio ou de um vesse no sangue intactoeu. Combinado com um corante fluorescente específico, tal como dihydroethidium (DHE), pode-se avaliar simultaneamente intracelular NO e _O2 ^.- geração nas células ou nos vasos sanguíneos ^14. Da mesma forma, a DHE é também um composto de células-permeável que é oxidado por O ₂ ^.- interior das células, e, em seguida, o produto oxidativo intercala com ácidos nucleicos para emitir uma cor vermelho brilhante detectável quantitativamente por microscopia fluorescente ou de fluorescência microscópio confocal. A DHE é um corante muito específico para a detecção de O ₂ ^.- a partir de amostras biológicas, que detecta essencialmente radicais superóxido, é mantida assim por células, e pode mesmo tolerar fixação suave ^20. Uma das vantagens deste método de fluorescência do corante é que ele detecta e visualiza NO e / ou _de O ₂ ^.- en face directamente sobre a camada endotelial intacta de um vaso sanguíneo de estar.

Nesse papel,descrevemos este método de fluorescência de corantes para detectar NO e O ₂ ^.- que temos adaptado para en detecção de face de NO e O ₂ ^.- em aortas intactas de um modelo de rato obesidade induzida por alta gordura com a dieta (HFD) alimentação. Nós demonstramos que este método poderia com sucesso e de forma confiável medir NO e O ₂ ^.- níveis e avaliar a função eNOS (dis) na camada endotelial de aortas de rato intactas recém-isoladas em obesidade.

Protocolo

animal de trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Veterinário de Fribourg, Suíça. O protocolo segue as orientações sobre cuidados com os animais e experimentação em nossa instituição.

1. Preparação de um Set-up para a incubação de Isolated Artérias

1. Construção de um sistema de banho de órgãos que pode ser aquecida a 37 ° C e arejada com 95% de _O2 e 5% de CO ₂ a partir de um tanque de gás de carbono.
2. Preparar de forma muito tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer, conforme necessário, com a concentração de a composição seguinte: (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, CaCl ₂ 2,5, MgSO ₄ 1,2 mM, 1,2 mM _de KH ₂ PO _4, mM de NaHCO 25 _3, 0,026 mM de EDTA e mM de D-glicose 11,1).
3. Manter o tampão de estoque em gelo e arejar o tampão com 95% de _O2 e 5% de CO _2.
4. Ligar o sistema de banho de órgãos, ajustar a temperatura a 37 ° C, adicionam-se 5 ml do tampão de pronto-para-uso para cada câmarae manter o arejamento do tampão com 95% de _O2 e 5% de CO _2.
5. Lavam-se as câmaras de uma vez com tampão de Krebs-Ringer durante 30 min.
6. Adicionar 5 ml de tampão de Krebs-Ringer a cada câmara e cobrir a câmara para evitar a evaporação.

2. Isolamento de rato aortas

1. Injectar pentobarbital que é dissolvido em NaCl a 0,9% por via intraperitoneal, na concentração de 150 mg / kg de sacrificar os ratinhos.
2. Coloque o mouse passivamente em uma placa cirúrgica.
3. Pulverizar a pele da região do peito, com 70% de etanol para fins de sanitização e umidade.
4. cavidade torácica aberta cortando em torno da costela para expor o coração e os pulmões, e remover os pulmões.
5. Remover o sangue na cavidade torácica suavemente com um toalhete de papel.
6. Segure o coração delicadamente com uma pinça e retire da aorta torácica, cortando o tecido adiposo perivascular entre a aorta e da coluna com uma tesoura cirúrgica.
7. imediatamente mergulhe o whole tecidos em gelo frio (4 ° C) tampão Krebs-Ringer.
8. Remover o coração e o arco aórtico sob um microscópio de dissecção e manter o segmento da aorta torácica no buffer.
9. Dissecar a aorta livre de aderir tecido perivascular sob um microscópio com uma tesoura cirúrgica e uma pinça.
10. Segure a borda final da aorta com uma pinça, e lave o sangue na luz vascular por lavagem suavemente tampão Krebs-Ringer com um 26 G × 1 / 2" seringa.
11. Corte os anéis de aorta limpas em longos segmentos de 3 mm.
    Nota: Preste atenção nesta etapa para não danificar camada endotelial.

3. DHE e DAF-2DA Coloração

1. Transferir os segmentos aórticos limpa com um fórceps para as câmaras de banho de órgãos cheios com o tampão de Krebs-Ringer a 37 ° C arejada com 95% de _O2 e 5% de CO _2.
   Nota: Toque apenas o lado adventícia dos anéis de aorta com uma pinça e não prender a bvasos Lood.
2. Equilibrar as artérias na câmara de banho de órgãos durante 30 min.
3. Adicionar a acetilcolina (ACh) ao banho de órgãos para a concentração final de 1 uM, e incuba-se as artérias, durante 10 min.
4. Prepare 1 ml de solução de DHE / DAF-2DA (5 uM de cada corante, diluiu-se a partir de 1,000 × estoque) com tampão Krebs-Ringer pré-aquecida em 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Enrole o tubo de microcentrífuga com papel alumínio para evitar a exposição à luz.
5. Após a estimulação, transferir os anéis de aorta a partir de banho de órgãos para a solução de DHE / DAF-2DA num tubo de microcentrífuga a 37 ° C arejada com 95% de O ₂ e CO ₂ a 5% e incuba-se os anéis aórticos em 30 min.
   Nota: A partir desta etapa, mantenha as aortas sempre no escuro.
6. Transferir os anéis aórticos para um novo tubo de microcentrifugação com tampão de Krebs-Ringer para lavar e repetir a lavagem três vezes dentro de 1 min.
7. Transfira os anéis de aorta de solução de paraformaldeído a 4% para fixação para 30min.
8. Prepare 1 ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) solução (300 nM, diluiu-se a partir de 1,000 × estoque) com tampão fosfato salino (PBS) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Contracoloração as aortas durante 3 min.
9. Transferir as aortas para novo tubo de microcentrifugação com tampão PBS para lavagem durante 1 min. Repetir a lavagem três vezes.
   Nota: Preste atenção para não prender os anéis de aorta ou danificar o endotélio.

4. Rosto En Montagem

1. Adicionar uma gota de meio de montagem para a corrediça.
2. Corte os anéis de aorta longitudinalmente com uma tesoura de microcirurgia sob o microscópio, faça as aortas enroladas plano e montá-lo en rosto no meio de montagem com o endotélio virado para baixo na lâmina de vidro. Não mova as aortas e para trás.
3. Cobrir a lâmina com tampa de deslizamento e selar o slide com unha polonês.
4. Após secagem ao ar sob a proteção de luz, use os slides para imagens directly dentro de horas ou armazená-los a -20 ° C para próximos dias.

5. confocal microscópica de imagem

1. Usar um microscópio confocal para detectar os sinais de fluorescência. Ligue a máquina e otimizar as configurações de imagem, como ampliação, velocidade de digitalização, a resolução, Z-stack.
   1. Para este protocolo, usar um 200 Hz velocidade de digitalização, resolução de 1.024 × 1.024 pixels e tamanho Z-passo de 0,25 mm. Excita a fluorescência da DAF-2DA com laser de argônio de 488 nm e detectar a 515 nm, enquanto que excita a fluorescência da DHE a 514 nm e detectar a 605 nm de emissão.
2. Use 10X ampliações para focar a amostra até que o sinal DAPI é claro com os raios ultravioletas, e depois ajustar o objetivo de 40X ampliações.
3. Definir a gama da camada endotelial, ajustando a posição de Z do painel de controlo. Os sinais de núcleos corados-DAPI são pontos ovais ou redondas na camada endotelial.
4. Digitalização a partir do topo(Camada endotelial no lúmen da fronteira) da amostra através de toda a espessura de imagens de sinal e ficha endoteliais. Escolha pelo menos 3 campos diferentes para a digitalização de cada amostra.

6. Análise de Imagens

1. Use software para abrir os dados digitalizados por microscopia confocal. Escolha três imagens consecutivas por campo para análise e avaliar, pelo menos, 3 campos diferentes por amostra. Exportar as imagens escolhidas e salvá-los como arquivos JPEG.
2. Quantificar as imagens de DAF-2DA, DHE e DAPI coloração com software de processamento de imagem. Para a imagem da coloração DAPI, escolha 'Plugins' → 'Analisar' → 'Counter celular' para contar o número de núcleos DAPI positivo.
   1. Para as imagens da DAF-2DA e coloração DHE, escolha "Analisar" → "medida" para analisar a intensidade dos sinais, e tomar o valor "médio" como a intensidade relativa do sinal. Presente, então os resultados como a relação de DAF-2DA anúcleos positivos DAPI ou o prolongamento de DHE para DAPI. Para cada amostra, tomar o valor médio de cada imagem e de campo.
3. Dividir o resultado de cada amostra por a média do grupo de controlo para obter a mudança de dobragem. A análise estatística foi realizada com o teste t de Student não pareado ou ANOVA com Dunnett ou pós-teste de Bonferroni. Dê dados como média ± SEM. Considerar as diferenças nos valores médios como significativo p <0,05 ^14.

Resultados

A obesidade é um importante fator de risco de doença cardíaca isquêmica coronariana e está associada à diminuição endoteliais biodisponibilidade, uma característica da doença vascular aterosclerótica ^21. eNOS desacoplamento foi demonstrado ser um importante mecanismo de disfunção endotelial sob várias condições fisiológicas e patológicas, incluindo envelhecimento ^22, aterosclerose, obesidade e ^14. Portanto, aqui vamos comparar os ratos m...

Discussão

Detecção de NO ou O ₂ ^.- com corantes fluorescentes era frequentemente usado em muitos estudos em células endoteliais cultivadas e também em criosecções tecido ^23. Aqui nós estendemos este método para os vasos sanguíneos de vida intacta, ou seja, en detecção de face de NO e O ₂ ^.- níveis na camada endotelial com DAF-2DA e DHE, respectivamente, o que é eficaz, relativamente simples e intuitiva. Em comparação com o método no ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D 1306	dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium	Vector labor. (reactolab)	H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 610M
Microscope	Nikon	SMZ800
Confocal microscope	Leica	DM6000
Image processing software	National Institute of Health (NIH)	Image J
Surgical scissors	S&T AG	SDC-11
Microsurgical scissors	F.S.T	15000-01
Forceps	S&T AG	JF-5
Coverslip round diameter 15 mm	VWR	631-1579
Tips 1 ml	VWR	RFL-1200c
Tips 200 μl	VWR	613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml	Eppendorf	30120086
Acetylcholine chloride	Sigma-aldrich	A-6625