En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Resumen

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O ₂ ^.- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

Resumen

óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir del endotelio NO-sintasa (eNOS) es una de las moléculas vasoprotective más importantes en la fisiología cardiovascular. Disfuncional eNOS como desacoplamiento de eNOS conduce a la disminución en la biodisponibilidad de NO y el aumento de anión superóxido (O ₂ ^.-) de producción, y a su vez promueve las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, la medición apropiada de NO y O ₂ ^.- niveles en las células endoteliales son fundamentales para la investigación sobre las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO y O ₂ ^.-, es difícil medir el NO y O ₂ ^.- directamente en un vaso sanguíneo. Numerosos métodos se han desarrollado para medir el NO y O ₂ ^.- producción. Es, sin embargo, ya sea insensible, o no específicas, o técnicamente exigente y requiere un equipo especial. A continuación se describe una adaptacióndel método de colorante de fluorescencia para la detección simultánea en face y visualización de intracelular NO y O ₂ ^.- utilizando la celda permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE), respectivamente, en aortas intactos de un modelo de obesidad inducida ratón por la alimentación alta en grasas de la dieta. Hemos podido demostrar una disminución intracelular NO y O ₂ ^.- mejorado los niveles en las aortas intactas recién aisladas de ratón de la obesidad, en comparación con el ratón magra control. Se demuestra que este método es una técnica fácil para la detección directa y la visualización de NO y O ₂ ^.- en los vasos sanguíneos intactos y se puede aplicar ampliamente para la investigación de la función endotelial (dys) en (fisio) condiciones patológicas.

Introducción

Las células endoteliales vasculares mantienen la integridad funcional y estructural vascular por la liberación de factores vasoactivos ^1. Entre estos factores, el óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir de L-arginina a través endotelial NO-sintasa (eNOS) es el factor más importante y mejor caracterizado en la fisiología cardiovascular ^2. NO causa la relajación del músculo liso e inhibe la proliferación celular, inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión celular y la infiltración inflamatoria en el espacio subendotelial, por lo tanto, la protección contra el desarrollo de enfermedad vascular ^3. Bajo muchas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el envejecimiento, la hipertensión, la diabetes, la hiperlipidemia, etc., la disfunción endotelial se caracteriza por disminución de la biodisponibilidad de NO y el aumento de O ₂ ^.- producción está presente y promueve la patogénesis de la aterosclerosis ^2. Los estudios realizados en los últimos años demuestran que el desacoplamiento de la eNOS es unamecanismo importante para la disfunción endotelial, en la que la enzima eNOS genera O ₂ ^.- en lugar de NO, bajo las diversas condiciones antes mencionadas ^1,4. Por lo tanto, el análisis de la función endotelial, en particular, la producción de NO endotelial y O ₂ ^.- generación es fundamental para la investigación experimental en las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones.

Hay numerosos enfoques metodológicos que se han desarrollado para analizar y medir la producción de NO en muestras biológicas. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO que se oxida fácilmente en NO ₂ ^- y NO ₃ ^- con una vida media de 3 a 6 segundos, es difícil de medir directamente NO. Por lo tanto la determinación de NO ₂ ^- / NO ₃ ^- en las muestras de fluido se utiliza como un índice de NO liberado de las células o tejidos ^5. Aunque el procedimiento es relativamente fácil, el método es, sin embargo, easily afectados por el alto fondo del NO estable ₂ ^- / NO ₃ ^- contenida en la solución. Debido a que no estimula la guanilato ciclasa soluble para producir monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) ^6, el nivel de GMPc celular también se ha determinado para estimar la liberación de NO ^7. Una vez más, esta es una estimación indirecta y puede no ser específica, ya que algunos factores derivados del endotelio como-péptido natriurético tipo C (CNP) también podrían aumentar los niveles de GMPc a través de la activación de la guanilato ciclasa particulada ^8. El NO es producido a partir de L-arginina con generación de L-citrulina como se utiliza por lo tanto también subproducto ^9, la medición de la producción de L-citrulina como un método indirecto para estimar la producción de NO. Los principales inconvenientes de este método son que es radiactivo y no mide los niveles de NO bioactivos, ya que libera NO podría ser inactiva rápidamente por O ₂ ^.-; Por otra parte, L-citrulina puede ser reciclado a L-arginina ^10. Otros métodos químicos, tales como la detección de quimioluminiscencia ^11, la resonancia de spin electrónico ^12, o porfirínico electroquímica NO sensor ¹³ son utilizadas por varios investigadores. Estos métodos no son generalmente fáciles de funcionamiento, procedimientos de detección y requieren equipo especial. También es de mencionar que muchos estudios se aplican experimentos baño de órganos con vasos sanguíneos aislados con o sin el endotelio para evaluar la función endotelial y indirectamente medir relajaciones NO vascular mediada derivados del endotelio. Sin embargo, este método, aunque es en su mayoría cerca de situación fisiológica, pero estrictamente decir, no mide NO función, en lugar evalúa respuestas vasomotoras mediada por el endotelio en general que reflejan efectos netos de la función eNOS, la producción de otro relajante derivado del endotelio factores y factores contratantes derivados del endotelio, la producción de O ₂ ^.-, y también las respuestas de las células del músculo lisoa estos factores. Un análisis específico de la función eNOS o la producción de NO por lo general se requiere ^3.

Muchos grupos de investigación, incluyendo la nuestra tienen en los últimos años utilizan el método de tintura fluorescente para detectar la producción intracelular de NO ^14-19. En este método se utilizó la célula indicador de fluorescencia permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) para medir la función libre de NO y NOS en células y tejidos in vitro o ex vivo vivo. El principio es que en las células vivas, DAF-2DA se desacetila por esterasa intracelular a no fluorescente de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) que después se convierte en fluorescente DAF-2 triazol (DAF-2T) por reacción con NO . La fluorescencia de DAF-2T se puede observar bajo un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal de fluorescencia ^14. Por tanto, la intensidad de la fluorescencia intracelular refleja la producción de NO intracelular en las células o el endotelio de un vesse en sangre intactal. En combinación con un colorante de fluorescencia específica tal como dihydroethidium (DHE), se puede evaluar simultáneamente intracelular NO y O ₂ ^.- generación en las células o en los vasos sanguíneos ^14. Del mismo modo, DHE es también un compuesto permeable a las células que se oxida por O ₂ ^.- dentro de las células, y el producto oxidativo a continuación, se intercala con ácidos nucleicos para emitir un color rojo brillante detectable cuantitativamente mediante microscopio de fluorescencia o fluorescencia microscopio confocal. DHE es un colorante muy específico para la detección de O ₂ ^.- partir de muestras biológicas, ya que detecta esencialmente radicales superóxido, se conserva bien por las células, e incluso puede tolerar fijación suave ^20. Una de las ventajas de este método de tinte de fluorescencia es que detecta y visualiza NO y / o O ₂ ^.- en face directamente sobre la capa endotelial intacta de un vaso sanguíneo de estar.

En este papel,describimos este método colorante fluorescente para detectar el NO y O ₂ ^.- que hemos adaptado para la detección de rostros es de NO y O ₂ ^.- en aortas intactos de un modelo de ratón de la obesidad inducida por el alto contenido de grasa-dieta de alimentación (HFD). Se demuestra que este método podría con éxito y de forma fiable de medir el NO y O ₂ ^.- niveles y evaluar la función eNOS (dis) en la capa endotelial de las aortas recién aislados intactos de ratón en la obesidad.

Protocolo

los animales de trabajo fue aprobado por el Comité Ético de la Oficina Veterinaria de Friburgo, Suiza. El protocolo sigue las directrices sobre cuidado de los animales y la experimentación en nuestra institución.

1. Preparación de una puesta a punto para la incubación de las arterias aislada

1. Construir un sistema de baño de órganos que puede ser calentado a 37 ° C y se aireó con 95% O ₂ y 5% de CO ₂ de un tanque de gas de carbono.
2. Preparar como mucho tampón de bicarbonato Krebs-Ringer según sea necesario con la concentración de la composición siguiente: (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, 2,5 mM CaCl _2, 1,2 mM _MgSO4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 25 mM NaHCO _3, 0.026 EDTA mM, y 11,1 mM de D-glucosa).
3. Mantener la reserva de estabilización en hielo y airear el tampón con un 95% _{de O2} y 5% de _CO2.
4. Active el sistema de baño de órganos, ajustar la temperatura a 37 ° C, añadir 5 ml del tampón listo para su uso a cada cámaray mantener la aireación del tampón con un 95% _{de O2} y 5% de _CO2.
5. Lavar las cámaras de una vez con tampón de Krebs-Ringer durante 30 min.
6. Añadir 5 ml de tampón de Krebs-Ringer a cada cámara y la cubierta de la cámara para evitar la evaporación.

2. Aislamiento del mouse aortas

1. Inyectar pentobarbital que se disuelve en 0,9% de NaCl por vía intraperitoneal a una concentración de 150 mg / kg de sacrificar los ratones.
2. Coloque el ratón supina sobre una tabla quirúrgica.
3. Pulverizar la piel de la región del pecho con 70% de etanol a los efectos de la desinfección y la humedad.
4. cavidad torácica abierta cortando alrededor de la costilla para exponer el corazón y los pulmones, y quitar los pulmones.
5. Retire la sangre en la cavidad del pecho suavemente con un pañuelo de papel.
6. Agarre el corazón suavemente con unas pinzas y separar la aorta torácica mediante la reducción del tejido adiposo perivascular entre la aorta y la espina dorsal con tijeras quirúrgicas.
7. Inmediatamente sumerja el whole tejidos en hielo frío (4 ° C) tampón de Krebs-Ringer.
8. Retire el corazón y el arco aórtico bajo un microscopio de disección y mantener el segmento de aorta torácica en el búfer.
9. Diseccionar la aorta libre de tejido adherente perivascular con un microscopio con tijeras quirúrgicas y fórceps.
10. Tome el borde final de la aorta con una pinza, y arrastre de la sangre en la luz vascular enjuagando suavemente tampón Krebs-Ringer con un 26 G x 1 / 2" jeringa.
11. Cortar los anillos de aorta limpiados en segmentos más largos de 3 mm.
    Nota: Tener en cuenta en este paso para no dañar la capa endotelial.

3. DHE y DAF-2DA tinción

1. La transferencia de los segmentos aórticos limpiadas con una pinza a las cámaras de baño de órganos lleno con el tampón de Krebs-Ringer a 37 ° C se aireó con 95% _{de O2} y 5% de _CO2.
   Nota: solo se puede tocar el lado de la adventicia de los anillos aórticos con fórceps y no sujetar la bLood vasos.
2. Equilibrar las arterias en la cámara de baño de órganos para 30 min.
3. Añadir la acetilcolina (ACh) al baño de órganos a la concentración final de 1 mM, y se incuban las arterias de 10 min.
4. Preparar 1 ml de solución DHE / DAF-2DA (5 M de cada colorante, diluido a partir de 1000 × Stock) con tampón de Krebs-Ringer pre-calentado en 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Envolver el tubo de microcentrífuga con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
5. Después de la estimulación, la transferencia de los anillos aórticos de baño de órganos a la solución DHE / DAF-2DA en un tubo de microcentrífuga a 37 ° C aireada con 95% O ₂ y CO ₂ al 5% y se incuban los anillos de aorta durante 30 minutos.
   Nota: A partir de este paso, mantener las aortas siempre en la oscuridad.
6. La transferencia de los anillos aórticos a un nuevo tubo de microcentrífuga con tampón de Krebs-Ringer para el lavado y repita el lavado tres veces en 1 min.
7. La transferencia de los anillos aórticos a la solución de paraformaldehído al 4% para la fijación de 30min.
8. Preparar 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) solución (300 nM, diluido a partir de 1000 × Stock) con salina tamponada con fosfato (PBS) tampón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. CONTRATINCIÓN las aortas durante 3 min.
9. Transferencia de las aortas de nuevo tubo de microcentrífuga con tampón de PBS para el lavado de 1 min. Repita el lavado tres veces.
   Nota: Tenga cuidado de no apretar los anillos de aorta o dañar la capa endotelial.

4. Montaje En Face

1. Añadir una gota de medio de montaje a la diapositiva.
2. Cortar los anillos de aorta longitudinalmente con tijeras de microcirugía con el microscopio, hacer que las aortas enrolladas plana y montarlo en face en el medio de montaje con el endotelio hacia abajo sobre el portaobjetos de vidrio. No mueva las aortas de ida y vuelta.
3. Cubrir el portaobjetos con cubreobjetos y selle la diapositiva con esmalte de uñas.
4. Después de secado al aire bajo la protección de la luz, utilizar las diapositivas para obtener imágenes de extremactly en cuestión de horas o almacenarlos a -20 ° C para los próximos días.

5. confocal de imágenes microscópicas

1. Use un microscopio confocal para detectar las señales de fluorescencia. Encender la máquina y optimizar los ajustes de imagen como la ampliación, la velocidad de escaneo, resolución, Z-pila.
   1. Para este protocolo, utilizar una velocidad de barrido de 200 Hz, resolución de 1.024 x 1.024 píxeles y el tamaño de Z a paso de 0,25 micras. Excite fluorescencia de DAF-2DA con 488 nm láser de argón y detectar a 515 nm, mientras que excitar la fluorescencia de DHE en 514 nm y detectar a 605 nm de emisión.
2. Utilice 10X aumentos para centrarse en la muestra hasta que la señal DAPI es clara con rayos ultravioleta, y luego ajustar el objetivo de 40x.
3. Definir el rango de la capa endotelial mediante el ajuste de la posición Z en el panel de control. Las señales de los núcleos con DAPI manchadas son puntos ovalados o redondos en la capa endotelial.
4. Escanear desde la parte superior(Capa endotelial en la frontera lumen) de la muestra a través del espesor completo de imágenes de señal de registro y endoteliales. Elija por lo menos 3 campos diferentes para el escaneo de cada muestra.

6. Análisis de Imágenes

1. Utilice el software para abrir los datos escaneados por microscopio confocal. Elija tres imágenes consecutivas por campo para el análisis y evaluación de al menos 3 diferentes campos por muestra. Exportar las imágenes elegidas y guardarlas como archivos JPEG.
2. Cuantificar las imágenes de DAF-2DA, DHE y DAPI con el software de procesamiento de imágenes. Para la imagen de DAPI, seleccione 'plugins' → 'Analizar' → 'contador de células' para contar el número de núcleos DAPI positivo.
   1. Para las imágenes de DAF-2DA y tinción DHE, seleccione "Analizar" → "Medir" para analizar la intensidad de las señales, y tomar el valor 'Mean' como la intensidad relativa de la señal. Presente, entonces los resultados como la relación de DAF-2DA anúcleos positivos DAPI o relación de DHE para DAPI. Para cada muestra, tomar el valor promedio de cada imagen y el campo.
3. Dividir el resultado de cada muestra por la media del grupo de control para obtener el factor de cambio. El análisis estadístico se realizó con unpaired la prueba t de Student o ANOVA con Dunnett o post-test de Bonferroni. Dar los datos como media ± SEM. Considerar las diferencias en los valores medios como significativos valores de p <0,05 ^14.

Resultados

La obesidad es un importante factor de riesgo de enfermedad coronaria isquémica y se asocia con una disminución de la biodisponibilidad de NO endotelial, una característica de la enfermedad vascular aterosclerótica ^21. eNOS-desacoplamiento ha demostrado ser un importante mecanismo de la disfunción endotelial bajo numerosas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el envejecimiento ^22, la aterosclerosis y la obesidad ^14. Por lo tanto, aqu?...

Discusión

Detección de NO o O ₂ ^.- con tintes fluorescentes se utiliza con frecuencia en muchos estudios en cultivos de células endoteliales y también en criosecciones de tejido ^23. Aquí hemos extendido este método a los vasos sanguíneos de vida intacta, es decir, en la detección de rostros de NO y O ₂ ^.- niveles en la capa endotelial con DAF-2DA y DHE, respectivamente, que sea eficaz, relativamente simple y intuitiva. En comparación con el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dihydroethidium (DHE)	Invitrogen	D 1168	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)	Calbiochem	251505	dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D 1306	dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium	Vector labor. (reactolab)	H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)	Sigma-aldrich	N5751
Pentobarbital	Sigma-aldrich	P3636
Multi-Myograph System	Danish Myo Technology A/S	Model 610M
Microscope	Nikon	SMZ800
Confocal microscope	Leica	DM6000
Image processing software	National Institute of Health (NIH)	Image J
Surgical scissors	S&T AG	SDC-11
Microsurgical scissors	F.S.T	15000-01
Forceps	S&T AG	JF-5
Coverslip round diameter 15 mm	VWR	631-1579
Tips 1 ml	VWR	RFL-1200c
Tips 200 μl	VWR	613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml	Eppendorf	30120086
Acetylcholine chloride	Sigma-aldrich	A-6625