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摘要

我们描述了检测，定量和监测血管内皮生长因子家族的配体的成员的活性的简单的基于细胞的生物测定法。该测定法使用在因子相关性细胞系中表达的嵌合受体的配体，以提供受体结合和交联的半定量或定量的评估。

摘要

参与血管生物学受体酪氨酸激酶及其相互作用的配体的分析常常是具有挑战性的，由于相关的受体，范围广泛的相关配体和处理专门内皮细胞的原代培养物的难度家庭的组成型表达。这里，我们描述用于检测配体的血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）中，促进血管生成和淋巴管生成的信号的键传感器生物测定。编码VEGFR-2的胞外（配体结合）区的融合与跨膜和促红细胞生成素受体（EpoR的）的细胞质区域的cDNA，在因子相关性细胞系的Ba / F3表示。该细胞系生长在白细胞介素-3（IL-3）和该因子的结果的撤出在细胞的死亡存在24小时之内。在VEGFR-2 / EpoR的受体融合的表达提供了一种替代机制，促进生存和势的在能够结合和交联的融合蛋白（ 即 ，一个可以交联的VEGFR-2的胞外区）的胞外部分的配位体的存在下稳定转染的Ba / F3细胞的LLY增殖。半定量的方法，其中配位体和细胞小体积在24小时允许快速结果，并且涉及活细胞数目的替代标志物的定量方法:在测定可以通过两种方式来执行。该测定是比较容易进行，是高度响应于已知VEGFR-2的配体，可容纳的VEGFR-2的信号，如单克隆抗体的受体或配体，和可溶性配体陷阱胞抑制剂。

引言

血管内皮生长因子（VEGF）家族的分泌蛋白的生长因子和它们的同源细胞表面受体是可溶性配体和膜包埋的受体，分别在穿过细胞膜转导信号该函数的一个重要和多样的基团。它们主要发挥作用的内皮细胞，而且在和上皮来源的细胞的那些免疫系统1,2。信令由配体激活的VEGF受体（VEGFRs）是在主要的病状，如年龄相关性黄斑变性和癌症关键的，和治疗啮合途径靶向它们是在常见的临床使用（例如，单克隆抗体贝伐单抗靶向的VEGF-A）的3,4。

一项所述的VEGF家族的复杂性是存在于自然界（可溶性配体VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，由parapox病毒家族ORF和蛇毒VEGF，加上其他编码的VEGF蛋白质的多样性抑制VEGF-A）2亚型。

这些配体与受体酪氨酸激酶家族的三个成员，即VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3相互作用。这些受体可变地表达于不同的细胞类型，但该行的所有大小5的血液和淋巴管内皮细胞的表面上常常共表达。 VEGFR-2可以结合哺乳动物配体VEGF-A 6，VEGF-C 7和VEGF-D -8,9-以及口疮病毒VEGF 10和蛇毒VEGF的11。 VEGFR-2在驱动血管发生在胚胎发育（新血管从预先存在的血管的生长），伤口愈合，癌症和眼病主要作用。在这些情况下，配体例如VEGF-A，-C和-D结合并激活血液血管内皮细胞12-15受体。上淋巴管内皮细胞，VEGFR-2在淋巴管生成的作用，新的淋巴管16的形成。 VEGFR-2还可以促进扩张和主要动脉和淋巴管在健康组织和疾病17扩张。 VEGFR-2的完整的理解:配体的相互作用是因此对于抑制剂的开发用于治疗血管生成依赖性疾病18重要。而VEGF-A结合的对VEGFR-2的大部分同种型，是必需的VEGF-C和VEGF-D的蛋白水解裂解，以释放由表现出高亲和力结合VEGFR-2 19,20的VEGF-同源结构域的片段。

我们已经开发出一种生物测定来监测，其被设计来规避初级内皮细胞，这是技术上难以通过，购买昂贵的和培养的需要VEGFR-2的配体（需要专门介质）21和表达多种VEGFRs和相关的共受体22。旨在螺柱当与其他VEGF受体或共受体VEGFR-2的异源可引起不希望的复杂性ý二进制受体-配体相互作用，评估活性归属于特定的受体，或评估抑制试剂的效果。23。生物测定保留在细胞膜相关受体的流动性，并允许的配位体的结合能力并交联的VEGFR-2的细胞外区域的评价。

生物测定依赖于其中（在这种情况下，VEGFR-2）VEGF受体的胞外区融合至跨膜和促红细胞生成素受体（EpoR的），细胞因子受体家族的一个成员的胞内区域的创建的嵌合受体8,24。此融合蛋白然后在从属因子原B细胞系的Ba / F3表示，在其上的刺激与能结合和交联的受体的胞外结构域导致胞质效应区，其能够激活一个配位体通过JAK激酶（JAKS）转导存活信号，促进细胞的存活和/或增殖。与此相反，全长VEGFR-2在相同的细胞类型，并刺激配体表达，不促进细胞存活和增殖，表明VEGFR-2通路的近端信令效应不在此细胞类型可用。

我们已经使用该测定在各种情况下，探索新的VEGFR-2的配体10,19,20,24-29的结合。在与VEGFR-3-EpoR的-的Ba / F3测定结合，我们比较了VEGF-C的结合和交联的VEGFR-2和VEGFR-3 30的相对活性和VEGF-D的生长因子。该测定法已被用于表征中和单克隆抗体对VEGFR-2或VEGF-D，可溶性VEGFR-2捕集和拟肽靶向VEGF家族31的抑制活性。该试验也用于显示的VEGF的不同ORF病毒株结合交联的VEGFR-2在测试之前在初级内皮细胞的能力，并 10,26。该测定是对的VEGF的突变体的快速筛选，可以它们被引入到更费力内皮细胞分析25，或当用于净化生长评估协议因子27前被快速评估活动特别有用。

我们描述了检测容易进行，并且半定量版本允许监测的生长因子，抗体或其他实验的可溶性受体结构域的生产或纯化时有时需要快速测定。使用该测定的易用性使得它与从血液或淋巴管衍生自特定的组织或器官系统主内皮细胞进行进一步和更完全的研究，一个理想的补充。

研究方案

IL-3和制备的源WEHI-3D​​的空调中等

注意:小鼠粒细胞白血病细胞系WEHI-3D​​是培养以产生含IL-3条件培养基。

  1. 培养WEHI-3D​​中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS），1％的长寿命补充谷氨酰胺，50μg/ ml的庆大霉素。接种5×10 6个细胞中生长的对数相到50ml在一个T175 cm 3的组织培养瓶的新鲜培养基并生长约7天，或者直到细胞已经由约24通过增长其数期- 48小时（避免过度培养细胞死亡）。条件培养基是能够被存储为多个年在-20℃，所以200批次 - 400毫升能在同一时间产生。
  2. 滗析从烧瓶和旋转流体和细胞在1,000×g下15分钟以除去细胞和细胞碎片。拆下顶部90％supern的atant。通过0.22微米的过滤器单元进行过滤。
  3. 等分试样WEHI-3D​​的条件培养基（CM）在1ml 50毫升，并在-20℃下200毫升卷进行存储或-70℃。小等分试样用于测定制备，用于制备培养基为因子依赖性细胞系的通道中间的卷，以及用于长期储存的卷是有用的。 IL-3是在4℃下，如果在无菌条件下使用，所以解冻介质可以存储几个星期相对稳定。
  4. 另外，使用重组小鼠IL-3的稀释于培养基中，通过0.22微米的过滤器单元过滤后50ng / ml的水平。

2.培养和评价的VEGFR-2-EpoR的-的Ba / F3和控制的Ba / F3细胞系的

  1. 培养控制Ba / F3细胞在DMEM，10％FBS，50μg/ ml的庆大霉素或青霉素/链霉素补充，1％稳定的L-谷氨酰胺和10％WEHI-3D​​-CM。有关从细胞每三天传代细胞以1:15稀释在对数期生长。
  2. 培养VEGFR2-EpoR的-Ba / F3细胞在DMEM，10％FBS，50μg/ ml的庆大霉素，1％稳定的L-谷氨酰胺和10％WEHI-3D​​-CM和1毫克/毫升G418。传代细胞1:15稀释在对数期生长的细胞。有关嵌合受体的构建和表达的更多详细信息，请参阅24。
  3. 收获控制的Ba / F3或VEGFR2-EpoR的-Ba / F3细胞中旬对数期的文化。轻轻吸取从烧瓶底部除去这些非贴壁细胞。在小鼠张力磷酸盐缓冲盐水，pH值7.3（PBS）中洗涤三次，（10毫升，离心，在750×g下5分钟以回收细胞沉淀）以除去含IL-3培养基。
  4. 洗涤细胞用DMEM和添加剂一次，而不WEHI-3D-CM或重组IL-3，然后重悬在该培养基中以7.4×10 4个细胞/ ml（即每13.5微升1,000个细胞的浓度; 10,000个细胞每135微升通过使用血细胞计数器计数测定）为在分别测定的半定量或定量的版本使用。
  5. 评估由台盼蓝排斥（警告）的活力细胞。混台盼蓝的PBS（0.4％）1:1的细胞群，并在血细胞计数器计数的最低100个细胞。这样会占用染料细胞被认为是死亡或濒临死亡。的大于98％的生存力是需要进行测定。

3.半定量分析

  1. 添加包含在13.5微升IL-3缺陷型培养基中以在RT 72孔微孔板的孔中洗涤细胞（1000细胞）。小心aliquotting确保细胞沉淀在重力作用下不偏细胞浓度时混合细胞悬液。使用以及校准P20自动化移液器和蒸压提示。
  2. 添加测试样品和对照的孔中在10％体积（1.5微升，使得每孔含有1,000个细胞15微升的最终体积）使用校准P20移液管或，优选，P2移液管。以CA重，以确保样品在pH值，盐和其他可能的细胞毒性/细胞抑制剂的物质而言的培养条件为Ba / F3细胞兼容。如果可能的话，使用兼容的介质或缓冲液（如 DMEM或PBS，分别），或在此类介质或缓冲液稀释。研磨用相同的尖端将确保混合。
  3. 对于对照样品，包括（i）中单独的含无IL-3; （ⅱ）WEHI-3BD-CM加入到培养基单独以10％的最终体积和/或（iii）VEGF-A稀释至在单独介质100纳克/毫升，不含有IL-3。
  4. 填用无菌水，PBS或培养基的微孔板的任何未使用的孔中，放置的潮湿容器中的板（与水浸泡棉纸）允许气体交换。孵育在容器内的细胞在10％的CO 2的潮湿气氛中。该测定可以舒适地设置在3小时由一个人如果测试样品和媒体组件是可用的。
  5. 评估板通常后16小时在培养其阳性和阴性样品之间的时间区别是显而易见的。参见图3的细胞如何出现在文化的例子。 100×放大率 - 使用标准倒置相差显微镜在40分析平板。
    注意:包含韦尔斯支持生长因子如IL-3或VEGF-A将含有呈圆形和半透明的细胞。而不支持生长因子或与单独的培养基孔中会具有降低的圆形细胞，以及死亡或正在死亡的细胞和细胞碎片（例如， 图3C）的号码。在24-48小时后孵化评估法是最佳的灵敏度。

4.定量生物测定

  1. 在IL-3缺陷型培养基中添加洗涤细胞（10,000个细胞在135微升），以在RT标准的96孔微量滴定板的孔中。小心aliquotting以确保重力不影响CE细胞沉淀过程中，混合细胞悬液LL浓度。
  2. 添加测试样品和对照到孔在使用校准吸管（P20）10％体积（15微升）。小心确保样品与pH值，盐或其他潜在的细胞毒性/细胞物质方面的培养条​​件为Ba / F3细胞兼容。如果可能的话，使用兼容的介质或缓冲液（ 例如 ，DMEM或PBS），或在此类介质或缓冲液稀释。过滤器采用0.22微米孔径的醋酸纤维素离心管过滤装置灭菌小容量。
  3. 孵育细胞，生长因子和/或抑制剂剂的混合物中的10％的CO 2的潮湿气氛48小时。具有水渍薄纸，并允许气体交换的潮湿容器中进行测定。在温育期结束时，评估使用的，低于该列出的替代性方法中的一种测定是在井的活细胞数目的替代标志。
  4. 替代＃1:3 H-thymidiNE公司注册
    注意:此量化是专为96孔板形式。
    1. 在37℃下（每孔150μl的体积）为48小时测定板的温育后，在50微升测定培养基的体积添加3 H-胸苷（的Ba / F3培养基没有IL-3 / WEHI-3D ​​CM）每孔以20微居里/ ml的浓度，得到的每孔1微居里的最终剂量。
    2. 孵育板用于使用细胞收集器收获细胞前在37℃下再进行4小时。通过将过滤器在闪烁体提取各个样品，并用液体闪烁计数器定量。
  5. 替代＃2:细胞内ATP生物发光检测
    注意:此方法使用当与细胞裂解物相结合，可产生反映在人口中的活细胞的生物发光信号的ATP的监测试剂。
    1. 裂解细胞以提取ATP和使用ATP监测试剂，以产生一个根据制造商的说明发光信号。使用带有一个96孔板格式兼容光度计读取发光。
  6. 替代＃3:由活细胞的指示剂染料酶催化还原
    注:基于刃天青试验显示良好的相关性细胞活力。
    1. 结合培养细胞用刃天青染料和量化使用根据制造商的说明在荧光读板器测定。

结果

在这一节中，我们显示的实验展示一VEGFR-2-EpoR的-的Ba / F3生物测定（参见图1用于测定的原理）的基本特征的结果。其他已发表 ​​的研究表明在测定的替代VEGFR-2的配体，突变的VEGF分子和抑制性单克隆抗体8,10,19,24-30的更广泛的应用。

此处呈现的数据表示，其中的VEGFR-2-EpoR的-的Ba / F3生物测定来量化三种重?...

讨论

此处所描述的测定法依赖于使用高存活率的细胞，这是依赖于生长因子。因此细胞需要仔细培养，以确保它们是因子依赖性的，并保留嵌合受体的表达。确保介质新鲜的，而不是存放过长的时间，并且WEHI-3D​​ CM为高活性是重要的。细胞需要从含培养基的IL-3彻底洗涤进测定培养基，以确保无残留的IL-3将细胞暴露于配位体抢救时污染测定。作为配体可以来以多种不同的形式，护理需要用于测定制?...

披露声明

史蒂芬A.堆和Marc M.亚琛是股东Circadian技术有限公司，公司通过瞄准生长因子VEGF家族发展疗法。

致谢

SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Trypan BlueSigma-AldrichT81540.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin)Invivogenant-gn-5Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-ThymidinePerkinElmerNET-027This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus KitLonzaLT07-221Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability ReagentInvitrogenA13261Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)Thermo Scientific136528Small microtitre plate
96 well Tissue Culture PlateFalcon, Corning Inc.353072
DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
Fetal Bovine SerumGibco 10099-141
Cell HarvesterTomtec Life SciencesTomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation CounterLKB Wallac1205LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
GentamicinGibco, Life Technologies15750-060
Penicillin/StreptomycinGibco, Life Technologies15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unitCostar, Corning Inc.8160Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence ReaderBioTekBioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

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