Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

Resumen

Se describe un bioensayo sencillo basado en células para la detección, cuantificación y seguimiento de la actividad de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular de ligandos. El ensayo utiliza receptores quiméricos expresados ​​en una línea celular dependiente de factor para proporcionar una evaluación semi-cuantitativa o cuantitativa de la unión al receptor y la reticulación por el ligando.

Resumen

El análisis de receptores tirosina quinasas y sus ligandos que interactúan implicadas en la biología vascular es a menudo difícil debido a la expresión constitutiva de familias de receptores relacionados, una amplia gama de ligandos relacionados, y la dificultad de tratar con cultivos primarios de células endoteliales especializadas. Aquí se describe un bioensayo para la detección de ligandos para el factor de crecimiento vascular endotelial receptor-2 (VEGFR-2), un transductor clave de las señales que promueven la angiogénesis y linfangiogénesis. Un ADNc que codifica una fusión de la región extracelular (de unión a ligando) de VEGFR-2 con la transmembrana y las regiones citoplásmicas del receptor de la eritropoyetina (EpoR) se expresa en la línea celular dependiente del factor de Ba / F3. Esta línea celular crece en presencia de interleucina-3 (IL-3) y la retirada de este factor de resultados en la muerte de las células dentro de 24 hr. La expresión de la / EpoR fusión del receptor VEGFR-2 proporciona un mecanismo alternativo para promover la supervivencia y potentiala proliferación de las células LLY Ba / F3 transfectadas de forma estable en presencia de un ligando capaz de unirse y reticulación de la porción extracelular de la proteína de fusión (es decir, uno que puede reticular la región extracelular de VEGFR-2). El ensayo se puede realizar de dos formas: un enfoque semi-cuantitativa en la que pequeños volúmenes de ligando y células permiten un resultado rápido en 24 horas, y un enfoque cuantitativo que implica marcadores sustitutos de un número de células viables. El ensayo es relativamente fácil de realizar, es muy sensible a conocidos VEGFR-2 ligandos y puede acomodar inhibidores extracelulares de VEGFR-2 de señalización tales como anticuerpos monoclonales para el receptor o ligandos, y las trampas de ligando soluble.

Introducción

La familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de factores de crecimiento proteína secretada y sus receptores de la superficie celular afines es un grupo importante y diverso de ligandos solubles y los receptores de membrana embebido en, respectivamente, que la función en la transducción de señales a través de las membranas celulares. Funcionan principalmente en las células endoteliales sino también en las células de origen epitelial y las del sistema inmune ^1,2. Vías de señalización contratados por los receptores activados por ligando VEGF (VEGFRs) son críticos en las principales patologías, como la degeneración y el cáncer macular relacionada con la edad, y la terapéutica dirigidas a ellos están en uso clínico frecuente (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal bevacizumab que se dirige a VEGF-A) ^3,4.

Una de las complejidades de la familia VEGF es la diversidad de ligandos solubles presentes en la naturaleza (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, proteínas de VEGF codificadas por el ORF familia parapoxvirus y serpiente VEGF veneno, además de otra inhibitorioisoformas de VEGF-A) ^2.

Estos ligandos interactúan con tres miembros de la familia de tirosina quinasas receptoras, a saber, VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. Estos receptores se expresan de forma variable en diferentes tipos de células, pero a menudo se co-expresan en la superficie de las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y linfáticos de todos los tamaños ^5. VEGFR-2 se puede unir el mamífero ligandos de VEGF-A ^6, VEGF-C y ^VEGF-7 D ^8,9, así como virus orf VEGF ¹⁰ y veneno de serpiente VEGF ^11. VEGFR-2 juega un papel importante en la conducción de la angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes) en el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, el cáncer y enfermedades de los ojos. En estos contextos, los ligandos tales como VEGF-A, -C y -D se unen y activan el receptor en las células endoteliales vasculares sanguíneos ^12-15. En las células endoteliales linfáticas, VEGFR-2 juega un papel en la linfangiogénesis, la formación de nuevos vasos linfáticos ^16. VEGFR2 también puede promover la dilatación y expansión de las principales arterias y vasos linfáticos en los tejidos y la enfermedad ¹⁷ sanos. Una comprensión completa de VEGFR-2: interacciones ligando es por lo tanto importante para el desarrollo de inhibidores para uso en el tratamiento de enfermedades dependientes de la angiogénesis ^18. Aunque la mayoría de las isoformas de VEGF-A se unen a VEGFR-2, se requiere la escisión proteolítica de VEGF-C y VEGF-D para liberar un fragmento que consiste en el dominio de homología de VEGF-que exhibe unión a VEGFR-2 ^19,20 alta afinidad.

Hemos desarrollado un bioensayo para monitorear ligandos de VEGFR-2 que está diseñado para eludir la necesidad de que las células primarias endoteliales, que son técnicamente difíciles de paso, que sean caros de comprar y la cultura (que requiere medio especializado) ²¹ y expresar múltiples VEGFR y co-asociado ²² receptores. Heterodimerización de VEGFR-2 con otros receptores de VEGF o co-receptores puede causar complejidad no deseada cuando se pretende espárragointeracciones Y binarios receptor-ligando, la evaluación de la actividad atribuible a un receptor específico, o que evalúan el efecto de los reactivos inhibidores. ^23. El bioensayo conserva la movilidad del receptor relevante en la membrana celular y permite la evaluación de la capacidad de un ligando para unirse y reticular la región extracelular de VEGFR-2.

El bioensayo se basa en la creación de un receptor quimérico en el que la región extracelular de un receptor de VEGF (en este caso VEGFR-2) se fusiona a la transmembrana y regiones intracelulares del receptor de la eritropoyetina (EpoR), un miembro de la familia de receptores de citoquinas ^8,24. Esta proteína de fusión se expresa entonces en la línea celular pro-B dependiente de factor Ba / F3, en la que la estimulación con un ligando capaz de unirse y de reticulación del dominio extracelular del receptor causa la activación de la región efector citoplasmático, que es capaz de la transducción de una señal de supervivencia a través de Janus quinasas (JAK) para promover la célulala supervivencia y / o proliferación. En contraste, la expresión de larga duración VEGFR-2 en el mismo tipo de células, y la estimulación con el ligando, no promueve la supervivencia y proliferación de las células, lo que indica que los efectores de señalización proximal de la vía de VEGFR-2 no están disponibles en este tipo de células.

Hemos utilizado el ensayo en una variedad de contextos para explorar la unión de nuevos VEGFR-2 ligandos ^{10,19,20,24-29.} En combinación con un ensayo / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, hemos comparado las actividades relativas de la VEGF-C y factores de crecimiento VEGF-D para la unión y reticulación de VEGFR-2 y VEGFR-3 ^30. El ensayo se ha utilizado para caracterizar la actividad inhibidora de anticuerpos monoclonales neutralizantes para VEGFR-2 o VEGF-D, VEGFR-2 soluble trampa y peptidomiméticos dirigidos a la familia VEGF ^31. El ensayo también se utilizó para mostrar la capacidad del VEGF de diferentes cepas de virus orf para atar y reticular VEGFR-2 antes de la prueba en las células endoteliales primarias 10,26. El ensayo es particularmente útil para la detección rápida de mutantes de VEGF que puede ser evaluado rápidamente para la actividad antes de que se introducen en los ensayos de células endoteliales más laboriosas ²⁵ o la hora de evaluar los protocolos para el crecimiento de purificación de factores de ^27.

El ensayo se describe es fácil de realizar, y la versión semi-cuantitativa permite determinaciones rápidas que a veces se requieren cuando el control de la producción o purificación de factores de crecimiento, anticuerpos o dominios de receptores solubles para otros experimentos. La facilidad de uso del ensayo hace que sea un complemento ideal para los estudios más y más completos realizados con células endoteliales primarias derivadas de la sangre o los vasos linfáticos de los tejidos específicos o sistemas de órganos.

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Protocolo

Medium fuente de IL-3 y Preparación de WEHI-3D ​​acondicionado

Nota: La línea celular de leucemia mieloide de ratón WEHI-3D ​​se cultiva para generar un medio acondicionado que contenía IL-3.

1. Cultura WEHI-3D ​​en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM), suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de suplemento de glutamina-vida larga, 50 mg / ml de gentamicina. Inocular 5 × 10 ⁶ células en la fase logarítmica de crecimiento en 50 ml de medio de cultivo fresco en una T175 cm matraz de cultivo de ³ tejidos y crecer durante aproximadamente 7 días o hasta que las células han pasado su fase logarítmica de crecimiento en alrededor de 24 a 48 hr (evitar la muerte celular excesiva en la cultura). El medio acondicionado es capaz de ser almacenado durante varios años a -20 ° C, por lo que los lotes de 200 - 500 ml se pueden producir al mismo tiempo.
2. Decantar líquido y células de los matraces y centrifugado a 1000 x g durante 15 min para eliminar las células y restos celulares. Retire la parte superior del 90% de supernatant. Filtrar a través de una unidad de 0,22 micras filtro.
3. Alícuota WEHI-3D ​​medio condicionado (CM) en 1 ml, 50 ml y 200 ml de volumen para el almacenamiento a -20 ° C o -70 ° C. alícuotas más pequeñas son útiles para la preparación de ensayo, los volúmenes intermedios para la fabricación de medio de cultivo para el paso de líneas celulares dependientes de factor, y los volúmenes más grandes para el almacenamiento a largo plazo. IL-3 es relativamente estable a 4 ° C por lo medio descongelado se puede almacenar durante un par de semanas si se utiliza bajo condiciones estériles.
4. Alternativamente, utilizar el ratón recombinante IL-3 a niveles de 50 ng / ml diluido en medio de cultivo, después de ser filtrada a través de una unidad de 0,22 micras filtro.

2. Cultura y Evaluación de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 y Líneas Celulares / F3 Control de Ba

1. control del cultivo de células Ba / F3 en DMEM, 10% de FBS, 50 mg / ml de gentamicina o penicilina suplemento / estreptomicina, 1% estabilizada L-glutamina y 10% WEHI-3D-CM. células de paso a las 1:15 diluciones aproximadamente cada tres días a partir de célulascreciendo en la fase de registro.
2. Cultura células VEGFR2-EpoR-Ba / F3 en DMEM, 10% FBS, 50 mg / ml de gentamicina, 1% estabilizada L-glutamina y 10% WEHI-3D-CM y 1 mg / ml G418. células de paso a las 1:15 diluciones de células en crecimiento en fase logarítmica. Véase la sección ²⁴ para más detalles acerca de la construcción y expresión del receptor quimérico.
3. control de las capturas Ba / F3 o células / F3 VEGFR2-EpoR-BA de cultivos en fase semilogarítmica. pipetear suavemente para quitar estas células no adherentes del fondo del matraz. Lavar tres veces en solución salina tamponada con fosfato tonicidad ratón, pH 7,3 (PBS), (10 ml, de centrifugación a 750 x g durante 5 minutos para recuperar el sedimento celular) para eliminar el medio que contiene IL-3.
4. Lavar las células una vez con DMEM y aditivos, sin el WEHI-3D-CM o IL-3 recombinante, y luego se resuspenden en este medio a una concentración de 7,4 × 10 ⁴ células / ml (es decir, 1.000 células por 13,5 l; 10.000 células por 135 l según lo determinado por recuento usando un hemocitómetro) parautilizar en las versiones semi-cuantitativos o cuantitativos del ensayo, respectivamente.
5. Evaluar la viabilidad de las células por exclusión de azul de tripano (PRECAUCIÓN). Mezclar azul de tripano en PBS (0,4%) 1: 1 con la población de células y contar un mínimo de 100 células en un hemocitómetro. Las células que absorben el colorante se consideran muertos o moribundos. Se requiere Viabilidad de mayor que 98% para realizar el ensayo.

3. Ensayo semi-cuantitativa

1. Añadir células lavadas (1.000 células) contenidas en 13,5 l de medio IL-3-deficiente a los pocillos de una placa de 72 pocillos de micropocillos a TA. Tenga cuidado para mezclar la suspensión celular durante alícuotas para asegurar la sedimentación por gravedad celular no lo hace la concentración de células sesgo. Utilice una pipeta P20 automatizado bien calibrado y consejos tratadas en autoclave.
2. Añadir muestras de ensayo y los controles a los pocillos a 10% en volumen (1,5 l, por lo que un volumen final de 15 l que contenía 1.000 células por pocillo) utilizando una pipeta P20 calibrada o, preferiblemente, P2 pipeta. tome care para garantizar que las muestras sean compatibles con las condiciones de cultivo para las células Ba / F3 en términos de pH, sal y otras sustancias potencialmente citotóxicos / citostáticos. Siempre que sea posible, utilizar un medio compatibles o tampón (por ejemplo, DMEM o PBS, respectivamente) o diluido en tal medio o tampón. La trituración con la misma punta se asegurará de mezcla.
3. Para las muestras de control, incluyen (i) medio solo que contiene no IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM añadido al medio solo en 10% de volumen final; y / o (iii) VEGF-A se diluyó a 100 ng / ml en medio solo, que no contiene IL-3.
4. Rellene los pocillos no utilizados de la microplaca con agua estéril, PBS o medio y colocar la placa dentro de un recipiente humidificado (con agua empapado pañuelo de papel) que permite el intercambio de gases. Se incuban las células dentro de los recipientes en una atmósfera humidificada de 10% de CO _2. Este ensayo se puede ajustar cómodamente hasta en 3 hr por una persona si las muestras de prueba y los componentes de los medios están disponibles.
5. Evaluar placas típicamente después de 16 h dede incubación en el que la discriminación de tiempo entre muestras positivas y negativas es evidente. Vea la Figura 3 para ver ejemplos de cómo aparecen las células en cultivo. Analizar las placas usando un microscopio de contraste de fase invertida estándar en 40 a 100 × magnificación.
   Nota: Los pocillos que contienen factores de crecimiento de apoyo, tales como IL-3 o VEGF-A contendrá células que aparecen redonda y translúcida. Wells sin factores de crecimiento de apoyo o con medio solo se han reducido número de células redondas, así como las células muertas o moribundas y desechos celulares (por ejemplo, la Figura 3C). Evaluar el ensayo a las 24-48 h después de la incubación es la óptima para la sensibilidad.

4. El bioensayo cuantitativo

1. Añadir células lavadas (10.000 células en 135 l) en IL-3 con deficiencia de medio a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos estándar a TA. Tenga cuidado para mezclar la suspensión celular durante alícuotas para asegurar la sedimentación por gravedad celular no afecta ceconcentración ll.
2. Añadir muestras de ensayo y los controles a los pocillos a% en volumen de 10 (15 l) con una pipeta calibrada (P20). Tener cuidado de asegurarse de que las muestras sean compatibles con las condiciones de cultivo para las células Ba / F3 en términos de pH, sal u otras sustancias potencialmente citotóxicos / citostáticos. Siempre que sea posible, utilizar un medio compatibles o tampón (por ejemplo., DMEM o PBS) o diluido en tal medio o tampón. Filtrar esterilizar pequeños volúmenes utilizando una unidad de filtro de tubo de centrífuga de acetato de celulosa de 0,22 micras de poro.
3. Incubar la mezcla de células, factores de crecimiento y agentes o inhibidor / en una atmósfera humidificada de 10% de _CO2 durante 48 hr. Realizar el ensayo dentro de un recipiente humidificado que tiene un pañuelo de papel empapado en agua y permite de intercambio de gases. A la finalización del período de incubación, evaluar el ensayo utilizando uno de los métodos alternativos enumerados a continuación que son marcadores sustitutos del número de células viables en el pozo.
4. Alternativa # 1: ³ H-thymidiIncorporación ne
   Nota: Esta cuantificación está diseñado para el formato de placa de 96 pocillos.
   1. Después de la incubación de las placas de ensayo durante 48 horas a 37 ° C (volumen 150 l por pocillo), añadir ³ H-timidina en un volumen de 50 l de medio de ensayo (Ba / medio de cultivo F3 sin IL-3 / WEHI-3D ​​CM) por pocillo a una concentración de 20 Ci / ml, dando una dosis final de 1 Ci por pocillo.
   2. Incubar las placas para un 4 hr a 37 ° C antes de recoger las células usando un recolector de células. Extraer muestras individuales mediante la colocación de los filtros en líquido de centelleo y cuantificar con un contador de centelleo líquido.
5. Alternativa # 2: Detección de bioluminiscencia de ATP celular
   Nota: Este método utiliza un reactivo de monitoreo ATP que cuando se combina con lisado de células se puede generar una señal de bioluminiscencia que refleja las células viables en la población.
   1. lisar las células para extraer ATP y el uso de un reactivo de Seguimiento ATP para generar unaseñal luminiscente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Leer la luminiscencia usando un luminómetro compatible con un formato de placa de 96 pocillos.
6. Alternativa # 3: Reducción enzimática de un colorante indicador de células viables
   Nota: ensayos basados ​​resazurina muestran una buena correlación con la viabilidad celular.
   1. Combinar las células cultivadas con el colorante basado resazurina y cuantificar ensayos usando un lector de placas de fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Resultados

En esta sección, se muestran los resultados de un experimento que demuestra las características esenciales de un bioensayo VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (véase la Figura 1 para principios del ensayo). Otros estudios publicados demuestran aplicaciones más amplias del ensayo para alternativas VEGFR-2 ligandos, moléculas de VEGF mutantes y los anticuerpos monoclonales inhibidores ^{8,10,19,24-30.}

Los datos p...

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Discusión

El ensayo descrito aquí se basa en el uso de células de alta viabilidad, que son dependientes de factores de crecimiento. Por lo tanto, las células tienen que ser cuidadosamente cultivadas para asegurar que son dependiente del factor, y conservan la expresión del receptor quimérico. Asegurar que el medio está recién hecha y no se almacena por un período excesivamente largo y que WEHI-CM 3D es altamente activo es importante. Las células necesitan ser lavados a fondo de IL-3 que contiene el medio en el medio de e...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin)	Invivogen	ant-gn-5	Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine	PerkinElmer	NET-027	This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit	Lonza	LT07-221	Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13261	Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)	Thermo Scientific	136528	Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate	Falcon, Corning Inc.	353072
DMEM (1X)	Gibco	11965-92
GlutaMAX (100X)	Gibco	35050-061
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099-141
Cell Harvester	Tomtec Life Sciences		Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter	LKB Wallac	1205	LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B	Perkin Elmer	6005177	White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin	Gibco, Life Technologies	15750-060
Penicillin/Streptomycin	Gibco, Life Technologies	15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit	Costar, Corning Inc.	8160	Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader	BioTek		BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader