从冷冻芯的外层部分外源物质的去除探讨古代生物群落里面窝藏

摘要

冰雪圈提供了保存完好的生物，过去的环境条件下坚持访问。的协议，提出收集和净化土壤和冰的永冻层的核心。缺乏外源菌落和DNA的建议检测微生物所代表的材料，而不是从钻孔或加工污染。

摘要

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

引言

冰雪圈（ 例如 ，永冻层土壤，冰功能，冰川积雪，积雪和冰）提供了一个窥探到过去的环境条件下坚持什么类型的生物。由于这些基材可以是几十到几十万岁，他们的微生物群落，因为沉积在冷冻保存，反映古环境条件。要正确分析这些生态系统和提取冷冻样品的冻土和冰块，正确的收集和处理有意义的生物信息是必要的。这是最重要的，因为气候预测为21 ^世纪指示北极和亚北极地区¹有明显的变暖的潜力。具体来说，内政部阿拉斯加和格陵兰预期升温5℃左右，并分别在2100年^2,3 7℃。预计这将影响显著土壤和水生微生物群落，因此，相关的生物地球化学过程。温暖的温度和降水改变政权有望开始在许多领域^2-5冻土退化可能导致较厚，季节性解冻（活动^）6,7层，冻土的解冻，和大量的冰体，如熔化地下冰，冰楔，和隔离冰^8。这将极大地改变除了这些生态系统中的植物和动物的生物多样性生物地球化学属性。

冰川和永冻层同生沉积物和冰的功能已经被困化学和代表的环境中生活是什么在那里形成的功能时的生物学证据。例如，在内部阿拉斯加，既Illinoisan和威斯康星州的永久冻土岁都存在这个永久冻土尤其在本（YBP）包含IMPA的生物地球化学的证据之前，提供了从现代到15万年约会不同的位置对生物多样性过去气候变化克拉。其结果是，这些沉积物提供生物地球化学和生物多样性的记录了数千年。由于该区域具有低的沉积速率，并从来没有被冰川覆盖的，不受干扰的样本是收集和分析，无论是钻访问垂直插入隧道土壤剖面或钻孔水平。更重要的是，大量的记录存在的突出特别是在该地区永久冻土^9-14的独特生物地球化学特征。具体来说，DNA分析的应用，同时估计现存的古冰和永冻土样本中的生物多样性的存在和程度使古环境条件特定生物联动和栖息地的职业探索。

以前的研究已经确定在哺乳动物，植物和可追溯至50K YBP ^11，15-19样品微生物气候影响，虽然每个研究使用各色一nt的方法来收集和净化冻土和冰芯。在某些情况下，钻芯灭菌^{16，20-21，}虽然具体的方法没有澄清是否外来核酸还从样品中消除。在其他研究中，细菌分离物^15（ 例如 ， 粘质沙雷氏菌 ），以及²²已被用于测量的净化程序的功效荧光微球。

这个实验是一个大型研究调查冻土样本可以追溯到大约40K YBP微生物群落的组成部分。研究这部分的具体目标是成功地净化冰和冻土内核。就我们所知，没有任何方法集成了使用而设计的，以消除从冷冻芯的外侧部分外来核酸和相关的核酸溶液。尽管这是一个事实，这些解决方案是commonlŸ用于净化实验室设备分子实验。

一旦芯进行了去污，使用由Griffiths等 ²³和TOWE 等人 ²⁴开发的协议提取基因组DNA，使用分光光度计进行定量，并用无菌，无DNA的水稀释至达到每反应20纳克。细菌的16S rRNA基因用引物331F及797R扩增和探针BacTaq ²⁵和古16S rRNA基因用引物拱349F和拱806R和在下列条件下探测TM拱516F ²⁶扩增:95℃600秒，随后45个循环95℃，30秒，57℃60秒，72℃，在40℃，30秒下进行25秒，最后延伸。所有的qPCR反应中重复进行。在20微升的反应体积包含20 ng的DNA，引物10μM的，探针的5微米，和10微升的qPCR反应混合物。 FO标准- [R采用基因组DNA分别假单胞菌荧光和嗜盐salinarum，细菌和古细菌定量PCR制备。两者中生长至对数期。平板计数进行了与DNA从培养物中分离。与一个的假设和每个基因组为H的16S rRNA基因的六份分光光度计基因组DNA进行定量salinarum和P.荧光 ，分别为^27-28。细菌和古细菌的基因的拷贝数是基于标准曲线上计算出的，对数转换，以占治疗之间不等方差，并通过ANOVA评估。

群落的组合物通过使用流动池和桥扩增技术测序16S rRNA基因，并与"定量分析上市微生物生态学^{'（QIIME）29}分析该社区确定。正向和反向读取被连接在一起，然后序列进行过滤，索引，并选择高品质的代表从头操作分类单元（OTU）通过序列比对分配有一个参考数据库。比对的序列进行了比较，对分类分配一个单独的参考数据库。一个门级OTU表的建立是为了确定一般群落组成。

研究方案

1.设备的准备和冻土核心种质

1. 设备的准备和现场样品采集和保存减速
   1. 通过将驱动器适配器插入筒的顶端和转动杠杆锁定到位组装为样品采集螺旋钻。针适配器管到驱动适配器和电机引脚到适配器管。插入桶上的刀具。
   2. 穿轻型服，丁腈手套，口罩和任何污染，减少对样品。耳罩和在进入隧道冻土（ 图1）安全性的安全帽。
   3. 进入隧道，并选择收集样本（ 图1B）的位置。
      注意:对于垂直或水平钻孔位置，选择已知有证据表明，该材料被冻结（ 例如 ，冰或多年冻土）的区域，也没有已知的大根系统，并且没有已知的砾石。移除所有从生活区的植物材料收集样品之前。如果垂直或水平钻孔中，选择相对平坦，并与螺旋推运器可访问的区域。
   4. 通过与已用70％的异丙醇，DNA的去污溶液，和RNase去污溶液的塑料材料成层地制备工作站。
   5. 放置纵向在工作站上半个直径10厘米的聚氯乙烯（PVC）管切割，以提供一个槽，因为它们是从螺旋推运器除去以保持芯。除污PVC管，用70％的异丙醇，DNA净化解决方案，和RNase净化解决方案。
   6. 附近的工作站，用70％的异丙醇，DNA净化解决方案，并核糖核酸酶净化解决方案喷洒消毒螺旋。从与擦拭螺旋钻移除的解决方案。
2. 冰和冻土核心的采集和存储
   1. 选择墙样品的面积（参见1.2.1注意）。
   2. 用70％的异丙醇，DNA净化解决方案，并核糖核酸酶净化解决方案擦拭消毒冻结壁面积约直径10厘米。
   3. 提升净化螺旋推运到感兴趣的区域，使得其垂直于样品区，并开始钻入壁（ 图1C，D） ​​的清洁面。
   4. 小心地从样品采集区域的螺旋。断开电机螺旋并将无菌的PVC管上面的螺旋在洁净工作台。小心倾斜螺旋推运器，使得冷冻芯滑出到无菌的PVC管（ 图1E）。
   5. 净化用70％的异丙醇，DNA净化解决方案，并核糖核酸酶净化解决方案手套。
   6. 拿起冰和冻土内核和无菌手套，将它们放入无菌袋。
   7. 放置在核心凉爽或寒冷的房间里，直到它们被运或处理。
   8. 嘘的ip使用干冰以保持它们在低于0℃的温度下冷冻芯。
   9. 紧随核储存在-80℃。

2，多年冻土和冰芯处理

1. 备料
   1. 通过在450℃下进行4小时的烘箱中烘烤制备无菌的，核酸游离重负荷铝箔，金属架，玻璃器皿，金属镊子，和玻璃棉。直至使用抛开这些材料。
   2. 通过0.22微米过滤器传递溶液消毒95％乙醇和超纯水。
   3. 在-20℃和水商店乙醇溶液在4℃下。
   4. 通过用70％乙醇，DNA的去污溶液，和RNase去污溶液喷洒和各溶液后，立即擦拭消毒一个塑料尺。
2. 细菌培养制备
   1. 准备肉汤和板成长粘质沙雷氏菌 。
      1. 对于肉汤，结合5克试ptone，1克葡萄糖，5克酵母提取物和1g磷酸氢二钾，然后加蒸馏水至达到1L。为了使板，琼脂15克的加入到上述混合物。对于肉汤和板材，调节pH至7和高压釜在121℃下15分钟。
   2. 通过组合8克氯化钠，0.2克氯化钾，1.44加入磷酸氢二钠的，及0.24g的磷酸二氢钾制备1X磷酸盐磨光盐溶液（PBS）中，并加蒸馏水至达到800毫升调节pH至7.4，并添加蒸馏水于121℃以达到1升高压灭菌15分钟。
   3. 通过浸入S.接种用无菌环肉汤沙雷氏菌培养以前存储在-80℃下冷冻。在无菌条件下，串行稀加入1 ml培养至9毫升的PBS并手动培养反转溶液。 1ml该稀释液加入到9毫升的PBS并手动反转溶液。重复八点多，直到10 ^-9 DILU达到化。
   4. 通过1毫升肉汤散发到板，并用细胞吊具扩频传播10 ^{-6，10 -7，10 -8}和10 ^-9解到琼脂平板上。每稀释三次做到这一点。在4℃保存原有的文化。
   5. 在30℃孵育板24小时。计数菌落数来计算在原始培养细胞的数目。注意:菌落在原始培养的数量将依赖于细菌的生长速度。
   6. 吸取250微升原生态文化的进入无菌1.5 ml离心管。通过添加1×PBS中的足够量如通过菌落计数在先前步骤中确定的，以获得约10 ⁹个细胞/ ml稀释原始培养。通过以2,500 xg离心离心10分钟沉淀在离心管的细胞。
      注:1×PBS中的量将依赖于细菌的生长速度各不相同。
   7. 在无菌biohood，吸取了肉汤和悬浮细胞在1毫升1×PBS缓冲液。储存在4℃直至使用或约2个月。
   8. 上处理的当天，淡化S.通过加入1ml的原始S的从步骤2.2.7 沙雷氏菌培养沙雷氏菌培养至39毫升1×PBS缓冲液在50毫升离心管中。
3. 准备冷室空间，核心处理和保存齿轮
   1. 前冷却的冷室，洁净的墙壁，地板和金属表用1％漂白溶液中。
   2. 冷室的设定温度至约-11℃。
   3. 一旦冷室已达到所需温度时，穿轻型服，腈手套和口罩，以任何污染减少到冷室和样品。
      注:两个身着正常个人需要这种方法。
   4. 把无菌材料 （ 如铝箔，金属架，玻璃器皿，盘， 粘质沙雷氏菌文化，MIcrotome刀片）和样品入冷室，地点在无菌表。
4. 多年冻土和冰核处理在寒冷的房间设施
   1. 放置一个永久冻土芯上的无菌的，核酸自由铝箔的片材。
   2. 轻轻接种芯的外侧与S的稀培养沙雷氏菌使用无菌泡沫塞（ 图2B）。
   3. 放在一个盘上方坐在无菌金属机架的核心。
   4. 消毒用70％乙醇，DNA的去污溶液，和RNase去污溶液钢切片机刀片。
   5. 有70％的乙醇，DNA净化解决方案，并核糖核酸酶净化解决方案个体干净丁腈手套，并在45°角的盘上方持有的核心。
   6. 有个人乙轻轻刮去约5mm的整个芯的外侧的，包括端部，使用无菌刀片而个人A熄灭各刮后的核心（ 图2C和图3A，B）。根据需要擦拭用70％的乙醇，DNA的去污溶液，和RNase去污溶液刀片。
   7. 有个人乙小心，并迅速倒入过滤除菌的95％的乙醇对核心，而个人A熄灭的溶液倾倒芯（ 图2D，3C）。
   8. 有个别乙立即冲洗用过滤灭菌的水的核心。
   9. 用新的无菌金属架更换托盘使用的金属架。
   10. 有个别A以45°角的托盘上方清理他或她的丁腈手套用70％乙醇，DNA净化解决方案，并核糖核酸酶净化解决方案和保持核心。
   11. 有个别乙喷洒DNA净化解决方案的整个核心。
   12. 有个别乙立即冲洗用过滤灭菌的水的核心。
   13. 有个别乙喷洒核糖核酸酶净化解决方案的整个核心。
   14. 有Individu人乙立即冲洗用过滤灭菌的水的核心。
   15. 放置在铝箔的无菌片芯和轻轻包。
5. 解冻外核
   1. 将在无菌玻璃皿无菌金属架在层流无菌biohood。
   2. 将具体到S. 2琼脂平板沙雷氏菌在无菌机架下面的玻璃皿从核心（ 图2E）收集液体。
   3. 放置在无菌的金属架的核心。
   4. 允许约2-5毫米芯的外表面，以在23℃解冻（平均，这将约10分钟内发生）。转芯大约每2分钟90°。
   5. 使用无菌镊子和无菌玻璃棉拭芯的整个表面上，并接种2琼脂平板特定至S.由这些材料擦拭到板的表面沙雷氏菌 。接种与原来的文化两个新的板块用于掺杂的外芯，将其暴露于冷室的低温条件下。
   6. 通过将无菌标尺附近，但不触及核心测量解冻圆柱形芯的外形尺寸。
   7. 将核心成大无菌袋，并将其存储在-80℃。
6. 检查增长
   1. 在23℃孵育琼脂平板一周。
   2. 检查S的生长琼脂平板沙雷菌菌落。
      1. 如果有在平板上没有可见的菌落，继续执行步骤2.5.3。
      2. 如果菌落出现在平板，从步骤2.1.1第2条"冻土和冰芯处理"重复。
   3. 获得从冷冻芯，并无菌转移到一个无菌袋。
   4. 存储在无菌袋中的芯在4℃下约24-48小时，解冻整个核心。

3.获取子样本从冰芯和冻土核酸提取

1. 从冰芯核酸提取
   1. 轻轻摇动袋（ 图2G）混合从冰芯解冻材料。
   2. 倒入解冻材料放入无菌容器用0.22微米的过滤器在真空下收集的微生物。
   3. 无菌取出用无菌镊子过滤，并将其放置在无菌2毫升陶瓷珠管（1.4毫米）。
   4. 储存在-80℃的过滤器。
2. 冻土核核酸提取
   1. 通过轻轻揉捏袋子从混合冻土核心解冻材料。
   2. 多年冻土已充分混合后，得到大约为0.5 g整体土壤的子样本用无菌scoopula并将其放置在该直立坐在一个平衡配衡无菌2毫升陶瓷珠螺旋盖管（1.4毫米）。
   3. 店子样本在-80℃。
   4. 获取样本的重量含水量。
      1. 措施10克永久冻土带与不孕在天平上去皮重的锡Ëscoopula和地点。测量永久冻土和锡的湿重。
      2. 在24小时设定在105℃的烘箱孵育永久冻土。测量永久冻土和锡干质量。
      3. 由永久冻土层的干质量减去冻土的湿重和多年冻土的干燥质量除以计算重量含水量。
   5. 在-80°C储存永久冻土带。

4.永久冻土和冰芯中提取核酸

1. 材料准备
   1. 制备琥珀小瓶通过用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，在37℃，高压灭菌孵育O / N保存的解决方案。
   2. 制备240 mM磷酸钾缓冲液。添加2.5克氢磷酸二氢和38.7克磷酸氢二钾的。通过加入无菌水调节终体积为500毫升。
   3. 准备溴化十六（CTAB）提取BUFFER 4.1 5g氯化钠溶解在80毫升水中，慢慢加入10克CTAB同时加热和搅拌。通过加入无菌水调节最终体积至100ml。
   4. 添加的磷酸缓冲液等体积​​的CTAB缓冲液和过滤用0.22微米的过滤器消毒。盖瓶用铝箔和储存在室温。
   5. 通过组合9.35克氯化钠和100ml无菌水制备1.6M的氯化钠（NaCl）溶液。加入10克聚乙二醇8000至1.6M的NaCl溶液和过滤消毒。保存在4℃。
2. 根据Griffiths 等人的修改的版本的核酸提取²²和TOWE 等人 ²³
   1. 穿轻型服，丁腈手套，和口罩。干净的实验室空间并用70％的乙醇，DNA的去污溶液，和RNase去污溶液移液管。
   2. 在2毫升删除子样本（来自冰芯或永久冻结带的土壤样品过滤器），陶瓷珠螺-CA从-80℃冷冻室和解冻在RT p管。
   3. 将0.5ml溴化十六（CTAB）提取液，涡旋简要的。
   4. 将0.5ml酚 - 氯仿 - 异戊醇（25:24:1）（pH 8）中，并使用上的涡旋平板适配器水平摇晃试管10分钟。
   5. 在4℃以下珠跳动，离心管在16100 XG 5分钟。
   6. 到一个新的无菌1.5毫升管除去水层，并用等体积的氯仿 - 异戊醇混合（24:1）。离心16100 XG在4℃下5分钟。
   7. 到一个新的无菌1.5毫升管除去水层，加入30％的聚乙二醇8000和1.6 M氯化钠的两卷。孵育在4℃下2小时。
   8. 离心机在16100 xg离心在4℃下10分钟。
   9. 于4℃在16100 xg离心用约500微升冰冷的70％乙醇和离心机的洗涤核酸沉淀10分钟。
   10. 在2小时的无菌biohood空气干燥颗粒。重悬在50μlDNA酶/无RNase的TE缓冲液（pH8.0）中。 DNA可用于下游应用如PCR和qPCR。
   11. 确定的DNA的浓度用分光光度计。
   12. DNA稀释用无菌，不含DNA的水达到每20反应纳克。

结果

该方法可用于净化各种冰冻圈环境中收集的冷冻样品，从冰川冻土到。在这里，我们提出从工程技术研究开发中心收集冰和永冻土样本专门收集的数据-寒冷地区研究和工程实验室（ERDC-CRREL）冻土隧道位于福克斯，AK（ 图1A和1B）。多年冻土隧道约110米延伸到黄金溪山谷的一侧，并提供访问丰富的冰和淤泥冲积层^30-31。从冰楔和冰冻土壤样?...

讨论

冰雪圈提供了保存完好的生物，过去的环境条件下坚持访问。虽然恢复类群可能不是完整的历史社会，来自冰川和冻土样品的分析中回收可产生约选择时间段^15-16宝贵的历史资料。举例来说，有意义的生物信息已经从冰研究在格陵兰冰盖考察²⁰厌氧活性和冻土试验研究了碳循环过程的解冻³³的结果绘制的，并已在白令陆桥¹⁶提供了深入了解真菌的多样性冻土。之前进...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auger	Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol	Walmart	551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7010
RNase decontamination solution, RNase Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7002
Light Duty Suits	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	10606
Nitrile Gloves	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FFS-700
Antiviral Masks	Curad, Walgreens	CUR3845
Sterile Sample Bags	Nasco, Fort Atkinson, WI	B01445
Steel Microtome Blade	B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack	Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray	Handy Paint Products, Chanhassen, MN	7500-CC
Aluminum Foil	Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter	Corning, Corning, NY	430513
Serratia marcescens	ATCC, Manassas, VA	17991
Biosafety Hood	NuAire, Plymouth, MN	NU-425-400
Petri Dish	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone	Acros Organics, NJ	61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
ATCC Agar 181- Agar	Difco, Sparks, MD	214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System	Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	12224-50
Ear Protection	Elvex	EP-201
Hard Hat
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	34705
Glass Wool	Pyrex	430330
Ruler
Weighing Tin	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-732-100
Sodium chloride	Sigma Aldrich, St Louis, MO	S-9625
Potassium chloride	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3040-04
Potassium phosphate, monobasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3246-01
Potassium phosphate, dibasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes	Corning, Corning, NY	4558
2 ml Microcentrifuge Tubes	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm)	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13113-50
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE	1437520
Balance	Ohaus, Parsippany, NJ	E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)	Acros Organics, NJ	22716-5000
Polyethylene glycol 8000	Sigma Aldrich, St Louis, MO	P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1752-400
Centrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C0549-1PT
TE Buffer	Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE	AM9860
Pipets	Rainin, Woburn, MA	Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips	Rainin, Woburn, MA	Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor	Scientific Industries, Bohemia, NY	G-560
Vortex Adaptor	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13000-V1
Clear Bottle	Corning, Corning, NY	C1395500
Amber Bottle	Corning, Corning, NY	C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm	Corning, Corning, NY	430513
60 ml Syringe	Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ	BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm	EMD Millipore, Billerica, MA	SLGV033RB
70% Ethanol	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP2818-500	diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	151030511
Cell Spreader	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-100-10
Disposable Inoculating Loops	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-363-602