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要約

雪氷圏は過去の環境条件の下で持続保存生物へのアクセスを提供しています。プロトコルは、収集し、土壌や氷の永久凍土コアを除染するために提示されています。外因性コロニーとDNAの不在が検出された微生物は、掘削や処理からの材料ではなく、汚染を表すことを示唆しています。

要約

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

概要

雪氷圏（ 例えば 、永久凍土の土壌、氷の特徴、氷、雪、フィルン、氷は）過去の環境条件の下で持続する生物の種類に垣間見ることができます。これらの基板が堆積するので凍結保存古い何千年もの間、その微生物群集、数十〜数百することができますので、古代の環境条件を反映しています。適切にこれらの生態系を分析し、凍結した土壌や氷から意味のある生物学的情報を抽出するには、凍結試料の適切な回収方法や処理が必要です。 21世紀のための気候予測は北極と亜北極地域1における顕著な温暖化の可能性を示しているので、これは最も重要です。具体的には、インテリアアラスカやグリーンランドは、2100年2,3によってそれぞれ約5℃〜7℃で、温めることが期待されます。これは、大幅に土壌や水生微生物群集に影響を与えることが予想されるので、関連されます生物地球化学的プロセス。気温の上昇と変更された沈殿政権は、潜在的に厚く、季節解凍（アクティブ）につながる多くの地域2-5の永久凍土の劣化6,7、凍結した土壌の解凍、およびなどの大規模な氷体の融解をレイヤーを開始することが期待されていますグランドアイス、アイスウェッジ、および分離氷8。これは劇的にこれらの生態系における植物や動物の生物多様性に加えて、生物地球化学的属性を変更します。

氷河氷とsyngenetic永久凍土の堆積物と氷の特徴は、化学的および機能が形成された時にそこに住んでいたものを表す環境の生物学的証拠を閉じ込められています。たとえば、インテリアアラスカで、イリノイ州のウィスコンシンの両方が永久凍土が存在している熟成させ、特にこの永久凍土が存在IMPAの生物学的および地球化学的証拠を含む（YBP）の前に15万年に現代の出会い系からのユニークな場所を提供します生物多様性に関する過去の気候の変化のCT。その結果、これらの堆積物は何千年もかけて生物地球化学と生物多様性の記録を提供します。面積が低い沈降速度を有しており、氷河ではありませんでしたので、邪魔されずにサンプルが土壌断面に垂直に掘削やトンネルに水平掘削いずれかで、収集と分析のためにアクセス可能です。さらに重要なのは、大規模なレコードは、特にこの領域9-14で永久凍土のユニークな生物地球化学的特徴を強調することを存在します。具体的には、DNA分析のアプリケーションは両方現存し、古代の氷と永久凍土試料中の生物多様性の有無と程度を推定するためには、特定の生物による占領に古代の環境条件の連携や生息地の探査を可能にします。

各研究はdiffereを使用しても以前の研究では、50kのYBP 11、15-19に遡るサンプルから哺乳動物、植物や微生物の気候への影響を確認しました永久凍土や氷床コアを収集し、除染するためのntの方法論。特定の方法は、外来核酸はまた、試料から除去されたかどうかを明らかにしなかったもののいくつかの例において、掘削コアは、16、20-21を滅菌しました。他の研究では、細菌の分離株15（ 例えば 、 セラチア・マルセッセンス ）、ならびに蛍光ミクロスフェア22は、除染手順の有効性を測定するために使用されてきました。

この実験は、後方に約40kのYBPまでさかのぼる永久凍土サンプルから微生物群集を調査する大規模な研究の一部でした。研究のこの部分の具体的な目的は、成功した氷と永久凍土コアを除染することでした。我々の知る限り、いかなる方法論は、凍結されたコアの外側部分から外国の核酸および関連するヌクレアーゼを排除するために設計されたソリューションの使用を統合していません。これは、これらのソリューションはcommonlであるという事実にもかかわらずですyは、分子の実験のための実験装置を除染するために使用されます。

コアを除染した後、ゲノムDNAをグリフィスら 23及びトウらによって開発されたプロトコルを用いて抽出した。24、分光光度計を用いて定量し、反応あたり20 ngのを達成するために、無菌の、DNAを含まない水で希釈しました。 600秒間95℃で45サイクル行った：細菌の16S rRNA遺伝子は、rRNA遺伝子を、プライマーアーチ349Fとアーチ806Rと、以下の条件でTMアーチ516F 26をプローブで増幅したプライマー331Fおよび797Rで増幅し、BacTaq 25と古細菌の16Sをプローブしました。 30秒間、95℃、57℃60秒間、および72℃での30秒間の40℃での最終伸長で25秒間。すべてのqPCR反応は二連で行いました。 20μlの反応容量は、20 ngのDNA、プライマーの10μM、プローブの5μM、および定量PCR反応ミックス10μlのを含んでいました。標準FOR細菌および古細菌の定量PCRは、それぞれ、 シュードモナス・フルオレッセンスおよび好塩菌のsalinarumからのゲノムDNAを用いて調製しました。両方とも、数期まで成長させました。プレートカウントを実施し、DNAを培養物から単離しました。ゲノムDNAはH.ためのゲノム当たり16S rRNA遺伝子の1と6のコピーを仮定した分光光度計で定量しましたsalinarumとP.それぞれ27-28、 フルオレッ 。細菌および古細菌の遺伝子のコピー数は、標準曲線に基づいて計算された、治療間不等分散を考慮して対数変換し、ANOVAによって評価しました。

コミュニティ組成物は、16S rRNA遺伝子の配列を決定するフローセルと、ブリッジ増幅技術を使用し、「微生物の生態に定量的洞察'（QIIME）29でコミュニティを分析することによって決定しました。順方向および逆方向読み込みを接合し、その後の配列は、ろ過し、インデックス付けされました、高品質の代表者は、参照データベースとの配列アラインメントを経て新たに操作的分類単位（OTU）の割り当てのために選択しました。整列された配列は、分類学上の割り当てのための別個の基準データベースと比較しました。門レベルのOTUテーブルは、一般的なコミュニティの組成を決定するために作成されました。

プロトコル

1.機器の準備や永久凍土コアコレクション

  1. 機器の準備およびフィールドサンプル収集および保存ギア
    1. バレルの上部にドライブアダプタを挿入し、所定の位置にロックするレバーを回転させることにより、サンプル収集のためのオーガーを組み立てます。ドライブアダプタにアダプタチューブをピンとアダプターチューブ上にモーターを固定します。バレル上のカッターを挿入します。
    2. サンプルに任意の汚染を低減するために軽量スーツ、ニトリル手袋、マスクを着用してください。耳の保護と永久凍土トンネル（ 図1）を入力する際の安全のためヘルメットを着用してください。
    3. サンプル（ 図1B）を収集するためにトンネルを入力し、場所を選択します。
      注：垂直または水平掘削場所については、材料（ 例えば 、氷や永久凍土の）凍結されているという証拠が知られている領域を選択し、既知の大きな根系が存在しない、とは知ら砂利はありません。すべて削除するサンプルを収集する前に、地域からの植物材料を生きています。垂直方向または水平方向に掘削した場合、比較的平坦なオーガでアクセス領域を選択します。
    4. 70％のイソプロパノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液で滅菌されたプラスチック材料で地面を積層してワークステーションを準備します。
    5. 彼らはオーガーから除去されるコアを保持するためのトラフを提供するために、長さ方向のワークステーション上半分に直径10cmのポリ塩化ビニル（PVC）パイプカットを配置します。 70％のイソプロパノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でPVC管を除染。
    6. ワークステーションの近くに、70％のイソプロパノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液とそれを噴霧することにより、オーガを除染。ワイプとオーガーからソリューションを削除してください。
  2. 氷と永久凍土コアの収集と保管
    1. サンプルに壁の面積を選択します（1.2.1を参照してください注意）。
    2. 70％のイソプロパノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でそれを拭いて凍結壁面積の約10cmの直径を除染。
    3. それはサンプル領域に対して垂直になるように、関心領域に除染オーガを上昇させると壁（ 図1C、D）の洗浄面に掘削を開始。
    4. 慎重に試料収集領域からオーガーを削除します。モータからのオーガを取り外し、きれいなワークステーションで滅菌PVCパイプ上記のオーガーを配置します。慎重に凍結されたコアは、無菌の塩ビ管（ 図1E）上にスライドさせ、そのようなことはオーガを傾けます。
    5. 70％のイソプロパノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液で手袋を除染。
    6. 滅菌手袋をして氷と永久凍土のコアをピックアップし、滅菌袋に入れます。
    7. 彼らは出荷または処理されるまで、クーラーや低温室でのコアを配置します。
    8. Sh0℃以下の温度でそれらを維持するためにドライアイスを用いて凍結したコアをIP。
    9. 直ちに-80℃でコアを格納します。

2.永久凍土と氷コアプロセッシング

  1. 材料の準備
    1. 4時間450℃のオーブンで焼成することにより、滅菌、核酸自由ヘビーデューティーアルミ箔、金属ラック、ガラス製品、金属鉗子、およびグラスウールを準備します。使用されるまで、これらの材料を置いておきます。
    2. 0.22μmフィルターを通して溶液を通過させることによって、95％のエタノールと超純水を殺菌します。
    3. 4°C -20°Cと水で保存エタノール溶液。
    4. 70％エタノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液でそれをスプレーし、す​​ぐにそれぞれの溶液の後に拭くことによって、プラスチック定規を滅菌します。
  2. 細菌培養の準備
    1. セラチアを成長させるために、ブロスとプレートを準備します。
      1. ブイヨンのために、5グラムのトライを組み合わせますptone、1グラムのグルコース、5gの酵母抽出物、および1グラムのリン酸カリウム二塩基性、およびその後、上記混合物に寒天の15グラムを追加し、プレートを作成するには1 L.に到達するために蒸留水を追加します。ブロスおよびプレートは、15分間121℃で7、オートクレーブにpHを調整します。
    2. 8グラムの塩化ナトリウム、塩化カリウム0.2gのリン酸ナトリウム二塩基1.44gの、0.24グラムのリン酸二水素カリウムを組み合わせて1×リン酸バフ食塩水（PBS）を調製800ミリリットル到達するために蒸留水を加えます。 pHを7.4に調整し、15分間121℃で1 L.オートクレーブに到達するために蒸留水を追加します。
    3. Sに浸漬することにより滅菌ループを用いたブロスに接種以前に-80℃で凍結保存したマルセッセンス文化 。無菌条件下で、シリアル希薄文化PBSの9ミリリットルに1mlの培養物を添加し、手動でソリューションを反転することによって。 PBSの9ミリリットルにこの希釈液の1ミリリットルを追加し、手動でソリューションを反転。 10 -9 DILUまで8回以上繰り返します化が達成されます。
    4. プレート上に培養液の1ミリリットルを配布し、細胞スプレッダーと拡散することにより寒天プレート上に10 -6、10 -7、10 -8、10 -9ソリューションを広げます。希釈につき三連でこれを行います。 4°Cで独自の文化を保存してください。
    5. 24時間30℃で培養します。元の培養物中の細胞の数を計算するために、コロニーの数を数えます。注：元の培養中のコロニー数は、細菌の増殖速度に依存します。
    6. ピペット滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに元の培養250μlの。前のステップでコロニー数によって決定されるように、約10 9細胞/ mlを得るために1×PBSの十分な量を添加することによって、元の培養物を希釈します。 10分間、2500×gで遠心分離することにより、マイクロ遠心チューブ内の細胞をペレット化。
      注：1×PBSの体積は、細菌の増殖速度に応じて変化します。
    7. 滅菌biohoodで、ブイヨンオフピペットと1ミリリットル1×PBS緩衝液中で細胞を再懸濁します。使用または約2ヶ月まで4℃で保存。
    8. 処理の日に、Sを希釈元Sの1ミリリットルを添加することにより、ステップ2.2.7からマルセッセンス文化50ミリリットルの遠心管中で39ミリリットル、1×PBS緩衝液にマルセッセンス文化 。
  3. コア処理や保存ギア冷室内空間を準備
    1. 1％の漂白剤溶液を用いて低温室、きれいな壁、床、および金属製のテーブルを冷却する前に。
    2. 約-11℃〜低温室の温度を設定します。
    3. 低温室が所望の温度に達した後は、冷蔵室とサンプルに任意の汚染を低減するために軽量スーツ、ニトリル手袋、マスクを着用。
      注：二適切に服を着た人が、この手順のために必要とされます。
    4. 滅菌材料を持参（ 例えば、アルミ箔、金属ラック、ガラス製品、トレー、S.マルセッセンスの文化、MI無菌のテーブルの上に寒い部屋や場所にcrotomeブレード）とサンプル。
  4. 低温室施設における永久凍土や氷床コアの処理
    1. アルミ箔の滅菌、核酸自由シートに永久凍土コアを配置します。
    2. 軽くS.の希薄文化とコアの外側に接種マルセッセンスは、滅菌発泡栓（ 図2B）を使用します。
    3. トレイの上に座って無菌金属ラックにコアを配置します。
    4. 70％エタノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液で鋼ミクロトームブレードを滅菌します。
    5. 70％エタノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液で個々のAきれいなニトリル手袋を持って、トレイの上45°の角度でコアを保持します。
    6. 個々のBは静かに（個人Aは、各こすり後にコアをオンにしながら、滅菌ブレードを用いて、両端を含む全体のコアの外側の約5ミリメートルを、こすりしています図2C及び図3A、B）。必要に応じて、70％エタノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でブレードを拭きます。
    7. 個々のAは、溶液が注がれるように、コア（ 図2D、3C）をオンにしながら、個々のBは、慎重かつ迅速にコアを覆ってフィルター滅菌し、95％エタノールを注ぐ必要があります。
    8. 個々のBはすぐにフィルター滅菌水でコアを洗い流してもらいます。
    9. 新しい無菌の金属ラックとトレイ上使用される金属ラックを交換してください。
    10. 個々のAは70％エタノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液で彼または彼女のニトリル手袋をきれいにし、トレイの上45°の角度でコアを保持しています。
    11. 個々のBはDNAの除染液でコア全体をスプレーしています。
    12. 個々のBはすぐにフィルター滅菌水でコアを洗い流してもらいます。
    13. 個々のBは、RNアーゼの除染液でコア全体をスプレーしています。
    14. Individuを持っていますアルBはすぐにフィルター滅菌水でコアをすすぎます。
    15. アルミ箔の滅菌シート上のコアを置き、軽くラップ。
  5. 雪解け外側コア
    1. 層流無菌biohood中の滅菌ガラス皿の上に無菌金属ラックを配置します。
    2. Sに特異的な2つの寒天プレートを配置コア（ 図2E）から液体を収集するための無菌のラック下のガラス皿でマルセッセンス 。
    3. 無菌金属ラックにコアを配置します。
    4. （平均して、これは約10分以内に発生します）コアの外側表面の約2〜5ミリメ​​ートルは、23℃で解凍することができます。約90°2分ごとにコアを回します。
    5. 滅菌ピンセットと滅菌ガラスウールを使用して、コアのスワブ表面全体およびSに特異的な2つの寒天プレートに接種プレートの表面に、これらの材料を拭き取りによってマルセッセンス 。の外側をドープするために使用される独自の文化を持つ2つの新しいプレートに接種寒い部屋の低温にさらされたコア。
    6. 近く滅菌定規を配置することによって、解凍し、円筒状コアの外形寸法を測定しますが、コアに触れていません。
    7. 大滅菌バッグの中にコアを配置し、-80℃で保管してください。
  6. 成長のためのチェック
    1. 1週間23℃で寒天プレートをインキュベートします。
    2. S.の成長のための寒天プレートを調べmarcescensのコロニー 。
      1. プレートには目に見えるコロニーが存在しない場合は、2.5.3に進みます。
      2. コロニーがプレート上に表示された場合は、「永久凍土や氷床コアの処理」セクション2のステップ2.1.1から繰り返します。
    3. 冷凍庫からコアを入手し、無菌的に滅菌バッグに移します。
    4. コア全体を解凍するために約24〜48時間、4℃で滅菌バッグでコアを保管してください。

3.アイスコアと永久凍土からの核酸抽出のためのサブサンプルを入手

  1. 氷床コアからの核酸抽出
    1. そっとバッグ（ 図2G）を攪拌することによって氷床コアから解凍した材料を混ぜます。
    2. 微生物を収集するために、真空下で0.22μmのフィルターで無菌容器に解凍された材料を注ぎます。
    3. 無菌的に滅菌ピンセットでフィルタを削除し、滅菌2ミリリットルのセラミックビーズチューブ（1.4ミリメートル）に配置します。
    4. -80℃でフィルターを保管してください。
  2. 永久凍土コアからの核酸抽出
    1. そっとバッグを混練して永久凍土コアから解凍した材料を混ぜます。
    2. 永久凍土が十分に混合された後、滅菌薬匙で約0.5グラムバルク土壌のサブサンプルを取得し、バランスに直立座っ風袋を測定し、滅菌2ミリリットルのセラミックビーズスクリューキャップチューブ（1.4ミリメートル）に配置します。
    3. -80℃で保存サブサンプル。
    4. サンプルの重量含水量を取得します。
      1. sterilで永久凍土の10グラムを測定します天びんの風袋を計った錫での電子の薬匙と場所。永久凍土とスズの湿潤質量を測定します。
      2. 24時間105℃に設定したオーブンで永久凍土をインキュベートします。永久凍土と錫の乾燥質量を測定します。
      3. 永久凍土層の乾燥質量によって永久凍土の湿潤質量を差し引くと永久凍土の乾燥質量で割ることにより、重量含水量を計算します。
    5. -80℃で保存の永久凍土。

4.永久凍土と氷コアから核酸を抽出

  1. 材料の準備
    1. 、0.1％のジエチル（DEPC）で処理し、37℃でO / Nをインキュベートし、オートクレーブで解決策を保持するために琥珀色のバイアルを準備します。
    2. 240 mMのリン酸カリウム緩衝溶液を調製します。リン酸二水素カリウムとリン酸カリウム二塩基性の38.7グラムの2 5グラムを追加します。滅菌水を加えて500ミリリットルに最終的な音量を調整します。
    3. 臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB）抽出BUFを準備水80ml 4.1グラムの塩化ナトリウムを溶解させ、ゆっくりと加熱し、撹拌しながら10gのCTABを添加することによってFER。滅菌水を加えて100ミリリットルに最終的な音量を調整します。
    4. 0.22μmのフィルターで滅菌リン酸緩衝液およびCTABバッファおよびフィルタの同等のボリュームを追加します。 RTでアルミ箔とストアとボトルをカバーしています。
    5. 9.35グラムのNaCl、100mlの滅菌水を組み合わせることにより、1.6 M塩化ナトリウム溶液（塩化ナトリウム）を調製します。 1.6 M NaCl溶液とフィルター滅菌するために10グラムのポリエチレングリコール8000を追加します。 4℃で保存。
  2. グリフィスら 22及びトウらの修正版に従って核酸抽出。23
    1. 軽量スーツ、ニトリル手袋、マスクを着用してください。きれいな実験室スペース、70％エタノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でピペット。
    2. 2ミリリットル中にサブサンプル（氷床コアや永久凍土の土壌サンプルからフィルタ）を取り外しセラミックビーズスクリュー-CARTで-80℃の冷凍庫と融解からのpチューブ。
    3. 簡単臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB）抽出緩衝液と渦の0.5ミリリットルを追加します。
    4. フェノール - クロロホルム - イソアミルアルコール（25：24：1）0.5mlの追加（pHが8を）し、ボルテックス上のフラットパネルアダプタを使用して10分間水平にチューブを振ります。
    5. 4℃で5分間、16,100×gでビーズビーティング、遠心チューブを以下。
    6. 新しい無菌の1.5mlチューブに水層を除去し、クロロホルム - イソアミルアルコール等容量のミックス（24：1）。 4℃で5分間、16,100×gで遠心分離します。
    7. 新しい無菌の1.5mlチューブに水層を除去し、30％ポリエチレングリコール8000および1.6 MのNaClの2ボリュームを追加。 4℃で2時間インキュベートします。
    8. 4℃で10分間、16,100×gで遠心分離します。
    9. 4℃で10分間16,100×gでの氷冷70％エタノールおよび遠心分離機の約500μlの核酸ペレットを洗浄します。
    10. 2時間滅菌biohood内の空気の乾燥ペレット。 50μlのDNアーゼ/​​ RNaseフリーのTE緩衝液（pH8.0）で再懸濁します。 DNAは、PCRや定量PCRなどの下流のアプリケーションの準備ができています。
    11. 分光光度計を用いてDNAの濃度を決定します。
    12. 反応あたり20 ngのを達成するために、滅菌、DNAフリーの水でDNAを希釈します。

結果

提示された方法は、氷河からの永久凍土に、様々な雪氷圏環境から収集した凍結試料を除染するために使用することができます。ここでは、特に工学研究開発センターから収集した氷と永久凍土サンプルから収集したデータを提示-フォックス、AK（ 図1Aおよび1B）に位置する寒冷地調査及び技術研究所（ERDC-CRREL）永久凍土トンネル。永久凍土...

ディスカッション

雪氷圏は過去の環境条件の下で持続保存生物へのアクセスを提供しています。回収された分類群は完全な歴史的なコミュニティを表していないかもしれないが、氷河や永久凍土サンプルの分析から回収されたものは、選択期間15-16に関する貴重な歴史的な情報を得ることができます。例えば、意味のある生体情報は、解凍33の結果としての炭素循環プロセスを調査アイスグリ?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AugerSnow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% IsopropanolWalmart551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured) Fisher Scientific, Pittsburgh, PAA407-4
DNA decontamination solution, DNA AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA7010
RNase decontamination solution, RNase AwayMolecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7002
Light Duty SuitsKimberly-Clark Professional, Roswell, GA10606
Nitrile GlovesFisher Scientific, Pittsburgh, PAFFS-700
Antiviral MasksCurad, WalgreensCUR3845
Sterile Sample Bags Nasco, Fort Atkinson, WIB01445
Steel Microtome Blade B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal RackFabricated at CRREL, Hanover, NH
TrayHandy Paint Products, Chanhassen, MN7500-CC
Aluminum FoilWestern Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm FilterCorning, Corning, NY430513
Serratia marcescensATCC, Manassas, VA17991
Biosafety HoodNuAire, Plymouth, MNNU-425-400
Petri DishFisher Scientific, Pittsburgh, PAFB0875712
ATCC Agar 181- TryptoneAcros Organics, NJ61184-5000
ATCC Agar 181- GlucoseFisher Scientific, Pittsburgh, PABP381-500
ATCC Agar 181- Yeast ExtractFisher Scientific, Pittsburgh, PABP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium PhosphateJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
ATCC Agar 181- AgarDifco, Sparks, MD214530
NanoDrop 2000 UV Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 SystemRoche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarumAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescensAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation KitMoBio Laboratories, Carlsbad, CA12224-50
Ear ProtectionElvexEP-201
Hard Hat
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34705
Glass WoolPyrex430330
Ruler
Weighing Tin Fisher Scientific, Pittsburgh, PA08-732-100
Sodium chlorideSigma Aldrich, St Louis, MOS-9625
Potassium chlorideJT Baker, Phillipsburg, NJ3040-04
Potassium phosphate, monobasicJT Baker, Phillipsburg, NJ 3246-01
Potassium phosphate, dibasicJT Baker, Phillipsburg, NJ3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrousFisher Scientific, Pittsburgh, PABP332-500
50 ml Centrifuge TubesCorning, Corning, NY4558
2 ml Microcentrifuge TubesMoBio Laboratories, Carlsbad, CA1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm)MoBio Laboratories, Carlsbad, CA13113-50
ScoopulaThermo Fisher Scientific, Wilmington, DE1437520
BalanceOhaus, Parsippany, NJE12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich, St Louis, MOD5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) Acros Organics, NJ22716-5000
Polyethylene glycol 8000 Sigma Aldrich, St Louis, MOP5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP1752-400
CentrifugeEppendorf, Hauppauge, NY5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1)Sigma Aldrich, St Louis, MOC0549-1PT
TE BufferAmbion (Thermo Fisher), Wilmington, DEAM9860
PipetsRainin, Woburn, MAPipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tipsRainin, Woburn, MARainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
VortexorScientific Industries, Bohemia, NYG-560
Vortex AdaptorMoBio Laboratories, Carlsbad, CA13000-V1
Clear BottleCorning, Corning, NYC1395500
Amber BottleCorning, Corning, NYC5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µmCorning, Corning, NY430513
60 ml SyringeBecton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJBD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μmEMD Millipore, Billerica, MASLGV033RB
70% EthanolFisher Scientific, Pittsburgh, PABP2818-500diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L OvenFisher Scientific, Pittsburgh, PA151030511
Cell SpreaderFisher Scientific, Pittsburgh, PA08-100-10
Disposable Inoculating LoopsFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-363-602

参考文献

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