Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung

Zusammenfassung

Die Kryosphäre bietet Zugang zu den erhaltenen Organismen, die im Rahmen früherer Umweltbedingungen bestehen blieb. Ein Protokoll vorgestellt zu sammeln und Permafrostkerne von Böden und Eis dekontaminieren. Die Abwesenheit von exogenen DNA-Kolonien und schlagen vor, dass Mikroorganismen detektiert das Material darstellen, anstatt Kontamination durch Bohren oder Verarbeitung.

Zusammenfassung

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

Einleitung

Die Kryosphäre (zB Permafrostböden, Eis Features, Gletscher Schnee, Firn und Eis) bietet einen Einblick in welche Arten von Organismen unter vergangener Umweltbedingungen bestehen blieb. Da diese Substrate Zehn- bis Hunderttausende von Jahren sein alt, ihre mikrobiellen Gemeinschaften, wenn da Ablagerung gefroren konserviert, reflektieren alten Umweltbedingungen. Um entsprechend dieser Ökosysteme zu analysieren und aussagekräftige biologische Informationen aus gefrorenen Böden und Eis, die richtige Erfassung und Verarbeitung der gefrorenen Proben extrahieren notwendig. Dies ist von größter Bedeutung , wie Klimaprognosen für das ^21. Jahrhundert das Potenzial für eine deutliche Erwärmung in den arktischen und subarktischen Regionen zeigen ^1. Insbesondere Interior Alaska und Grönland werden voraussichtlich bis zum Jahr 2100 ^2,3 etwa 5 ° C und 7 ° C, jeweils zu erwärmen. Dies wird voraussichtlich deutlich von Böden und Gewässern mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen und daher verwandtenbiogeochemische Prozesse. Die wärmeren Temperaturen und veränderte Niederschlagsregimes erwartet Permafrostdegradation in vielen Bereichen zu initiieren ^2-5 potenziell zu einem dickeren, was saisonal aufgetaut (aktiv) -Schicht ^6,7, das Auftauen von gefrorenen Böden und das Schmelzen von massiven Eiskörper wie Boden, Eis Keile und Segregation Eis ^8. Dies würde dramatisch die biogeochemischen Attribute neben der Artenvielfalt von Pflanzen und Tieren in dieser Ökosysteme verändern.

Gletschereis und syngenetisch Permafrost Sediment und Eis Merkmale haben chemische und biologische Beweise für eine Umgebung gefangen darstellt, was zu der Zeit dort lebten die Merkmale gebildet. Zum Beispiel in Interior Alaska, beide Illinoisan und Wisconsin im Alter von Permafrost vorhanden sind und diese Permafrost insbesondere bietet einzigartige Orte von modernen Datierung bis 150.000 Jahre vor der Gegenwart (YBP), die biologische und geochemische Beweise für die impa enthaltenct vergangener Klimaveränderungen auf die Biodiversität. Als Ergebnis bieten diese Sedimente eine Aufzeichnung der Biogeochemie und Biodiversität über viele tausend Jahre. Da die Fläche niedrige Sedimentationsraten hat und wurde nie vergletschert, sind ungestörte Proben zugänglich für die Sammlung und Analyse, entweder Bohrungen vertikal in das Bodenprofil oder Bohren horizontal in Tunneln. Noch wichtiger ist , gibt es umfangreiche Datensätze , die vor allem in dieser Region ^9-14 die einzigartigen biogeochemische Eigenschaften des Permafrosts hervorzuheben. Insbesondere ermöglicht die Anwendung der DNA-Analyse zur Schätzung Vorhandensein und das Ausmaß der biologischen Vielfalt in den beiden vorhandenen und alten Eis und Permafrost Proben Erforschung der Verknüpfung von alten Umweltbedingungen und Lebensraum der Besatzung durch bestimmte Organismen.

Frühere Studien haben klimatischen Auswirkungen auf Säugetiere, Pflanzen und Mikroorganismen aus Proben identifiziert 50k YBP Datierung ^{11, 15-19,} obwohl jeder Studie eine differe verwendetnt Methodik zu sammeln und die Permafrost oder Eisbohrkernen dekontaminieren. In einigen Fällen wurden die Bohrkerne ^{16 sterilisiert, 20-21,} obwohl die spezifische Methodik nicht geklärt werden, ob Fremd Nukleinsäuren auch von den Proben wurden eliminiert. In anderen Studien Isolate bakterielle ¹⁵ (beispielsweise Serratia marcescens) sowie fluoreszierenden Mikrokugeln ²² verwendet wurden , um die Wirksamkeit der Dekontaminationsverfahren zu messen.

Dieses Experiment war Teil einer größeren Studie mikrobieller Gemeinschaften aus Permafrostproben untersuchen zu etwa 40k YBP Jahrhundert. Das spezifische Ziel dieses Teils der Studie war erfolgreich Kerne Eis und Permafrost zu dekontaminieren. Unseres Wissens hat keine Methodik die Verwendung von Lösungen integriert entwickelt, um fremde Nukleinsäuren und die damit verbundenen Nukleasen aus dem äußeren Bereich der gefrorenen Kerne zu beseitigen. Dies ist trotz der Tatsache, dass diese Lösungen sind commonly verwendet Laborgeräte für die molekulare Experimente zu dekontaminieren.

Sobald die Kerne dekontaminiert wurden, wurde genomische DNA extrahiert , die entwickelten Protokolle von Griffiths et al. ²³ und Töwe et al. ^24, quantifiziert mit einem Spektralphotometer und verdünnt mit sterilen, DNA-freies Wasser 20 ng pro Reaktion zu erreichen. Bakterielle 16S - rRNA - Gene wurden mit den Primern 331f und 797R verstärkt und Sonde BacTaq ²⁵ und Archaea - 16S - rRNA - Gene mit Primern Arch 349F und Arch 806R amplifiziert wurden und die Sonde TM Arch 516f ²⁶ unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C für 600 sec , gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 57 ° C für 60 sec, und 72 ° C für 25 sec mit abschließende Extension bei 40 ° C für 30 sec. Alle qPCR Reaktionen wurden doppelt durchgeführt. Die 20 & mgr; l Reaktionsvolumina enthalten 20 ng DNA, 10 & mgr; M Primer, 5 & mgr; M der Sonde, und 10 ul der qPCR Reaktionsmischung. Standards for Bakterien und Archaea qPCR wurden unter Verwendung von genomischer DNA , die aus Pseudomonas und Halobacterium salinarum fluorescens, respectively. Beide waren gewachsen Phase zu protokollieren. Plattenzählungen wurden durchgeführt, und die DNA wurde aus den Kulturen isoliert. Genomische DNA wurde mit einem Spektrophotometer unter der Annahme von einem und sechs Kopien des 16S rRNA - Gens pro Genom für H. quantifiziert salinarum und P. fluorescens bzw. ^27-28. Kopieren Nummern der Bakterien und Archaea Gene auf der Basis der Standardkurve berechnet wurden, log-transformierten für ungleiche Varianzen zwischen den Behandlungen zu berücksichtigen und durch ANOVA bewertet.

Gemeinschafts Zusammensetzung wurde durch Sequenzierung des 16S - rRNA - Gen unter Verwendung von Flusszellen und Brückenverstärkertechnologie und Analyse der Gemeinden mit "quantitative Einblicke in die mikrobielle Ökologie" (QIIME) ²⁹ bestimmt. Vorwärts und rückwärts liest zusammen wurden zusammengefügt und dann wurden Sequenzen gefiltert, indiziert,und qualitativ hochwertige Vertreter wurden für die de novo operativen taxonomischen Einheiten (OTU) Zuordnung durch Sequenzabgleich mit einer Referenzdatenbank ausgewählt. Aligned Sequenzen wurden für taxonomische Zuordnung zu einer separaten Referenzdatenbank verglichen. Ein phylum Ebene OTU Tabelle wurde erstellt allgemeine Gemeinschaft Zusammensetzung zu bestimmen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Ausrüstung und Permafrost Core Collection

1. Vorbereitung der Ausrüstung und Feldprobe Sammlung und Erhaltung Gang
   1. Montieren Schnecke für die Probenentnahme durch den Antriebsadapter in die Spitze des Laufes ein und drehen Sie den Hebel um ihn zu sperren. Pin das Adapterrohr auf den Antriebsadapter und stecken Sie den Motor auf den Adapterrohr. Legen Sie die Messer auf den Lauf.
   2. Tragen Sie leichte Pflicht Anzüge, Nitril Handschuhe und Masken eine Kontamination der Proben zu reduzieren. Gehörschutz tragen und einen harten Hut für die Sicherheit auf den Permafrost - Tunnel eintritt (Abbildung 1).
   3. Geben Sie den Tunnel und wählen Sie einen Ort , um die Proben (Abbildung 1B) zu sammeln.
      Hinweis: Für vertikale oder horizontale Bohrstelle, wählen Sie einen Bereich Liegen Beweise bekannt , dass das Material gefroren ist (zB Eis oder Permafrost), gibt es keine bekannten großen Wurzelsysteme, und es gibt keine bekannte Kies. Alles entfernenPflanzenmaterial aus dem Bereich leben, bevor die Probe zu sammeln. Wenn vertikal oder horizontal gebohrt wird, wählen Sie einen Bereich, der relativ flach und zugänglich mit der Schnecke ist.
   4. Vorbereitung eines Arbeitsstation durch den Boden mit einem Kunststoffmaterial Schichtung, die mit 70% Isopropanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung sterilisiert wurde.
   5. Legen Sie einen Durchmesser von 10 cm Polyvinylchlorid (PVC) Rohr in der Hälfte der Länge nach auf der Workstation einen Trog vorzusehen, um die Kerne zu halten, wie sie von der Schnecke entfernt werden. Dekontaminieren PVC-Rohr mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
   6. In der Nähe des Arbeitsplatzes, dekontaminieren die Schnecke indem sie sie mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung gesprüht wird. Entfernen Sie Lösungen aus der Schnecke mit einem Tuch.
2. Eis und Permafrost Kernsammlung und -speicherung
   1. Wählen Sie einen Bereich der Wand Probe (siehe Abschnitt 1.2.1Hinweis).
   2. ca. 10 cm Durchmesser von gefrorenen Wandbereich dekontaminieren, indem sie es mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung abwischen.
   3. Erhöhen die dekontaminierten auger auf den Bereich von Interesse , so dass es auf die Probenfläche senkrecht und beginnen Bohren in die gereinigte Fläche der Wand (1C, D).
   4. Entfernen Sie vorsichtig die Schnecke von der Probensammelbereich. Trennen Sie die Schnecke vom Motor und legen Sie die Schnecke über dem sterilen PVC-Rohr in der sauberen Arbeitsplatz. Kippen vorsichtig Schnecke , so dass die gefrorenen Kerne herausgleiten auf die sterile PVC - Rohr (Abbildung 1E).
   5. Dekontaminieren Handschuhe mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
   6. Pick-up die Eis und Permafrost Kerne mit sterilen Handschuhen und legen Sie sie in sterile Beutel.
   7. Legen Sie die Kerne in einem kühleren oder kalten Raum, bis sie versendet werden oder verarbeitet werden.
   8. Schip die gefrorenen Kerne unter Verwendung von Trockeneis sie unter 0 ° C bei einer Temperatur zu halten.
   9. Sofort speichern die Kerne bei -80 ° C.

2. Permafrost und Eis-Core-Prozessoren

1. Materialvorbereitung
   1. Bereiten Sie sterile, Nukleinsäure-freie schwere Aluminiumfolie, Metallregale, Glaswaren, Metallzangen, und Glaswolle von 4 Stunden bei 450 ° C in einem Ofen backen. Nehmen Sie sich diese Materialien bis zur Verwendung.
   2. Sterilisieren 95% Ethanol und Reinstwasser durch die Lösungen durch ein 0,22 um Filter geleitet.
   3. Store Ethanollösung bei -20 ° C und Wasser bei 4 ° C.
   4. Sterilisieren einer Kunststofflineal indem sie sie mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung Aufsprühen und unmittelbar nach jeder Lösung abgewischt.
2. Bakterienkultur Vorbereitung
   1. Bereiten Sie Brühe und Platten Serratia marcescens zu wachsen.
      1. Für Brühe, kombinieren 5 g VersuchptEins, 1 g Glucose, 5 g Hefeextrakt und 1 g Kaliumhydrogenphosphat, und dann mit destilliertem Wasser auf 1 L. zu erreichen Platten zu machen, fügen Sie 15 g Agar zu der obigen Mischung. Für Brühe und Platten für 15 min pH-Wert auf 7 und Autoklaven bei 121 ° C einzustellen.
   2. Bereiten 1x Phosphat geschwabbelt Kochsalzlösung (PBS) durch die Kombination von 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid, 1,44 g dibasisches Natriumphosphat und 0,24 g monobasisches Kaliumphosphat und fügen destilliertes Wasser 800 ml zu erreichen. PH-Wert auf 7,4 und destilliertes Wasser für 15 min 1 L. Autoklaven bei 121 ° C zu erreichen.
   3. Impfen Brühe mit einer sterilen Schleife durch in den S. Tauchen marcescens Kultur , die zuvor bei -80 ° C eingefroren gelagert wurde. Unter aseptischen Bedingungen wird die Kultur serielle verdünnte durch Zugabe von 1 ml der Kultur zu 9 ml PBS und manuell die Lösung invertieren. 1 ml dieser Verdünnung auf 9 ml PBS und manuell die Lösung invertieren. Wiederholen Sie acht weitere Male , bis ein 10 ^-9 Dilution erreicht ist.
   4. Verbreiten Sie die 10 ^-6, 10 ^-7, 10 ^-8 und 10 ^-9 Lösungen auf Agarplatten durch die Verteilung von 1 ml Brühe auf die Platte und Ausbreitung mit einer Zelle Streuer. Tun Sie dies in dreifacher Ausfertigung pro Verdünnung. Bewahren Sie die ursprüngliche Kultur bei 4 ° C.
   5. Inkubiere Platten bei 30 ° C für 24 Std. Zähle die Anzahl der Kolonien, die Anzahl der Zellen in der ursprünglichen Kultur zu berechnen. Anmerkung: Die Anzahl der Kolonien in der ursprünglichen Kultur auf die Wachstumsrate der Bakterien abhängen.
   6. Pipettieren 250 ul der ursprünglichen Kultur in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnte ursprüngliche Kultur von genügend Volumen des 1x PBS Zugabe etwa 10 ⁹ Zellen / ml zu erhalten , wie durch Koloniezahl in dem vorherigen Schritt bestimmt. Pelletieren Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen durch bei 2.500 xg für 10 min zentrifugiert.
      Hinweis: Das Volumen 1x PBS variiert in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Bakterien.
   7. In einem sterilen biohoodPipettieren aus, die Brühe und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x PBS-Puffer. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung oder etwa zwei Monate.
   8. Am Tag der Verarbeitung verdünnen S. marcescens Kultur aus Schritt 2.2.7 durch Zugabe von 1 ml des ursprünglichen S. marcescens Kultur zu 39 ml 1x PBS - Puffer in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen.
3. Bereiten kalten Raum Platz für Core-Verarbeitung und Konservierung Getriebe
   1. Vor der kalten Raum kühlen, saubere Wände, Böden und Metalltisch mit einer 1% igen Bleichlösung.
   2. Die eingestellte Temperatur des Kühlraum auf etwa -11 ° C.
   3. Sobald der kalten Raum die gewünschte Temperatur erreicht hat, tragen leichte Pflicht Anzüge, Nitril Handschuhe und Masken eine Kontamination in den Kühlraum zu reduzieren und den Proben.
      Hinweis: Zwei richtig gekleidet Personen sind für dieses Verfahren erforderlich.
   4. Bringen Sie die sterile Materialien (zB Aluminiumfolie, Metallregale, Glaswaren, Tablett, S. marcescens Kultur und microtome Klinge) und Proben in den Kühlraum und Platz auf dem sterilen Tisch.
4. Permafrost und Eis Core-Verarbeitung in einem kalten Raum Einrichtung
   1. Legen Sie einen Permafrostkern auf einem sterilen, Nukleinsäure-freie Aluminiumfolie.
   2. Beimpfen leicht die Außenseite des Kerns mit der verdünnten Kultur von S. marcescens mit einem sterilen Schaum - Stecker (2B).
   3. Setzen Sie den Kern auf dem sterilen Metallgestell, das über einem Tablett sitzt.
   4. Sterilisieren des Stahl Mikrotomklinge mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
   5. Haben einzelne Eine saubere Handschuhe aus Nitril mit 70% Ethanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung und halten Kern bei einem Winkel von 45 ° über dem Tablett.
   6. Haben einzelne B sanft ca. 5 mm von der Außenseite des gesamten Kerns kratzen, einschließlich der Enden, die sterile Klinge während Identität Einzel den Kern nach jeder Schramme dreht ( 2C und 3A, B). Abwischen der Klinge mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung nach Bedarf.
   7. Haben einzelne B - Filter-sterilisierte 95% Ethanol über den Kern sorgfältig und schnell gießen, während Einzelne A den Kern dreht als die Lösung (Figuren 2D, 3C) gegossen wird.
   8. Haben einzelne B den Kern mit Filter-sterilisiertes Wasser sofort ausspülen.
   9. Ersetzen Sie gebrauchte Metallgestell auf Tablett mit einer neuen sterilen Metallgestell.
   10. Habe Identität Einzel seine Handschuhe aus Nitril mit 70% Ethanol, DNA-Dekontaminationslösung reinigen und RNase Dekontaminationslösung und halten Sie den Kern in einem Winkel von 45 ° über dem Tablett.
   11. Haben einzelne B den gesamten Kern mit DNA-Dekontaminationslösung besprühen.
   12. Haben einzelne B den Kern mit Filter-sterilisiertes Wasser sofort ausspülen.
   13. Haben einzelne B den gesamten Kern mit RNase Dekontaminationslösung besprühen.
   14. haben Individual B sofort gründlich den Kern mit Filter-sterilisiertes Wasser.
   15. Setzen Sie den Kern auf einem sterilen Blatt aus Aluminiumfolie und leicht zu wickeln.
5. Thaw äußeren Kern
   1. Legen Sie eine sterile Metallgestell über eine sterile Glasschale in einem sterilen biohood mit Laminar-Flow.
   2. Legen Sie zwei Agarplatten spezifisch für S. marcescens in der Glasschale unter dem sterilen Rack Flüssigkeit aus dem Kern (Abbildung 2E) zu sammeln.
   3. Setzen Sie den Kern auf dem sterilen Metallgestell.
   4. Erlauben etwa 2-5 mm von der Außenfläche des Kerns bei 23 ° C auftauen (im Durchschnitt, dies innerhalb von etwa 10 min stattfindet). Drehen Sie den Kern etwa 90 ° alle 2 min.
   5. Swab gesamte Oberfläche des Kerns mit einer sterilen Pinzette und sterile Glaswolle und impfen zwei Agarplatten spezifisch für S. marcescens durch diese Materialien auf die Oberfläche der Platten Abtupfen. Beimpfen von zwei neuen Platten mit der ursprünglichen Kultur verwendet der Außenseite des zu dotierenKern, die den niedrigen Temperaturen des kalten Raum ausgesetzt war.
   6. Messen Außenabmessungen des aufgetauten zylindrischen Kern durch einen sterilen Lineal platzieren in der Nähe, aber nicht berühren den Kern.
   7. Setzen Sie den Kern in großen sterilen Beutel und lagern Sie es bei -80 ° C.
6. Überprüfen Sie für das Wachstum
   1. Inkubieren Agarplatten bei 23 ° C für eine Woche.
   2. Untersuchen Agarplatten für das Wachstum von S. marcescens Kolonien.
      1. Wenn es keine sichtbaren Kolonien auf der Platte sind, gehen 2.5.3 zu treten.
      2. Wenn Kolonien auf der Platte erscheinen, wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 in Abschnitt 2 "Permafrost und Eiskern Verarbeitung".
   3. Erhalten Sie den Kern aus dem Gefrierschrank und aseptisch Übertragung auf einen sterilen Beutel.
   4. Lagern Sie den Kern in einem sterilen Beutel bei 4 ° C für etwa 24 bis 48 Stunden den gesamten Kern aufzutauen.

3. Erhalten Subsample für die Nukleinsäure-Extraktion aus Eisbohrkernen und Permafrost

1. Nukleinsäureextraktion aus Eisbohrkernen
   1. Mischen Sie die aufgetauten Material aus dem Eiskern durch leichtes Schütteln der Tasche (2G).
   2. Gießen die aufgetauten Material in einen sterilen Behälter mit einem 0,22 um-Filter unter Vakuum Mikroorganismen zu sammeln.
   3. Aseptisch entfernen Sie den Filter mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in einem sterilen 2 ml Keramikperlen Rohr (1,4 mm).
   4. Lagern Sie den Filter bei -80 ° C.
2. Nukleinsäureextraktion aus Permafrostkerne
   1. Mischen Sie die aufgetauten Material aus dem Permafrostkern vorsichtig den Beutel kneten.
   2. Nach der Permafrost gut gemischt wurde, erhalten eine Teilprobe von etwa 0,5 g Masse Boden mit einem sterilen Spatel und legen Sie sie in einem tariert sterile 2 ml Keramikperlen Schraubverschluss Rohr (1,4 mm), die senkrecht auf einer Waage sitzt.
   3. Shop subsamples bei -80 ° C.
   4. Erhalten gravimetrischen Wassergehalt der Proben.
      1. Messen Sie 10 g des Permafrostes mit einem Sterile Spatel und in eine tarierte Zinn auf einer Waage. Messen Sie feuchte Masse des Permafrosts und Zinn.
      2. Inkubieren Permafrost in einem Ofen bei 105 ° C eingestellt für 24 Stunden. Messen Trockenmasse des Permafrosts und Zinn.
      3. Berechnen Sie die gravimetrische Wassergehalt der feuchten Masse des Permafrosts durch die Trockenmasse des Permafrost abgezogen und durch die Trockenmasse des Permafrost geteilt wird.
   5. Shop Permafrost bei -80 ° C.

4. Extrahieren von Nukleinsäuren aus Permafrost und Eisbohrkernen

1. Materialvorbereitung
   1. Bereiten Sie amber Fläschchen Lösungen zu halten, indem sie mit 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) Behandlung, Inkubation O / N bei 37 ° C, und Autoklaven.
   2. Bereiten 240 mM Kaliumphosphatpufferlösung. Hinzufügen 2. 5 g monobasisches Kaliumphosphat und 38,7 g Kaliumhydrogenphosphat. Stellen Sie Endvolumen auf 500 ml mit sterilem Wasser hinzugefügt wird.
   3. Bereiten Sie Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Extraktion buffer von in 80 ml Wasser 4,1 g Natriumchlorid gelöst und 10 g CTAB langsame Zugabe unter Erhitzen und Rühren. Stellen Sie Endvolumen auf 100 ml mit sterilem Wasser hinzugefügt wird.
   4. Hinzufügen gleichen Volumina Phosphat-Pufferlösung und CTAB-Puffer und Filter sterilisieren mit einem 0,22 um-Filter. Decken-Flasche mit Aluminiumfolie und lagern bei RT.
   5. Bereiten 1,6 M Natriumchloridlösung (NaCl) durch die Kombination von 9,35 g NaCl und 100 ml sterilem Wasser. 10 g Polyethylenglykol 8000 auf 1,6 M NaCl-Lösung und Filter sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C.
2. Nukleinsäureextraktion nach einer modifizierten Version von Griffiths et al. ²² und Töwe et al. ²³
   1. Tragen Sie leichte Pflicht Anzüge, Nitril Handschuhe und Masken. Sauberen Laborraum und Pipetten mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
   2. Entfernen Substichprobe (Filter aus Eisbohrkernen oder Permafrostboden Probe) in 2 ml Keramikperlen Schraube-cap Rohr von -80 ° C Gefrierschrank und Auftauen bei RT.
   3. 0,5 ml Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Extraktionspuffer und Wirbel kurz.
   4. In 0,5 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25: 24: 1) (pH 8) und schütteln Rohre horizontal für 10 min auf einem Vortexer einen Flachbildschirm-Adapter.
   5. Nach Wulst-Schlagen, Zentrifugenröhrchen bei 16.100 xg für 5 min bei 4 ° C.
   6. Entfernen wässrige Schicht in ein neues steriles 1,5-ml-Röhrchen und Mischen mit einem gleichen Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (24: 1). Zentrifuge bei 16.100 xg für 5 min bei 4 ° C.
   7. Entfernen wässrige Schicht in ein neues steriles 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie zwei Volumina von 30% Polyethylenglykol 8000 und 1,6 M NaCl. Inkubieren für 2 h bei 4 ° C.
   8. Zentrifuge bei 16.100 xg für 10 min bei 4 ° C.
   9. Waschen Sie das Pellet Nukleinsäure mit etwa 500 ul eiskaltem 70% Ethanol und Zentrifuge bei 16.100 g für 10 min bei 4 ° C.
   10. Luft trocknen Pellet in einem sterilen biohood für 2 Stunden. Resuspendieren in 50 & mgr; l DNase / RNase-freiem TE-Puffer (pH 8,0). DNA ist bereit für Downstream-Anwendungen wie PCR und qPCR.
   11. Die Konzentration der DNA mit einem Spektrophotometer.
   12. Verdünnen Sie DNA mit sterilem, DNA-freies Wasser zu erreichen, 20 ng pro Reaktion.

Ergebnisse

Die vorgestellte Methode könnte verwendet werden, gefrorenen Proben aus verschiedenen Kryosphäre Umgebungen, von Gletschereis gesammelt zu dekontaminieren Permafrost. Hier präsentieren wir Daten gesammelt speziell aus Eis und Permafrost - Proben gesammelt aus dem Engineering Research and Development Center - Cold Regions Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost - Tunnel befindet sich in Fox, AK (1A und 1B). Der Permafrost Tunnel ers...

Diskussion

Die Kryosphäre bietet Zugang zu den erhaltenen Organismen, die im Rahmen früherer Umweltbedingungen bestehen blieb. Obwohl die zurückgewonnene Taxa die komplette historische Gemeinde nicht darstellen können, aus der Analyse von Gletschereis und Permafrostproben gewonnen diejenigen können ^15-16 wertvolle historische Informationen über ausgewählte Zeiträume ergeben. So hat beispielsweise sinnvolle biologische Informationen wurden aus Eis Studien zur Untersuchung der anaeroben Aktivität in grönländisc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auger	Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol	Walmart	551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7010
RNase decontamination solution, RNase Away	Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA	7002
Light Duty Suits	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	10606
Nitrile Gloves	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FFS-700
Antiviral Masks	Curad, Walgreens	CUR3845
Sterile Sample Bags	Nasco, Fort Atkinson, WI	B01445
Steel Microtome Blade	B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack	Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray	Handy Paint Products, Chanhassen, MN	7500-CC
Aluminum Foil	Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter	Corning, Corning, NY	430513
Serratia marcescens	ATCC, Manassas, VA	17991
Biosafety Hood	NuAire, Plymouth, MN	NU-425-400
Petri Dish	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone	Acros Organics, NJ	61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
ATCC Agar 181- Agar	Difco, Sparks, MD	214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System	Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	12224-50
Ear Protection	Elvex	EP-201
Hard Hat
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA	34705
Glass Wool	Pyrex	430330
Ruler
Weighing Tin	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-732-100
Sodium chloride	Sigma Aldrich, St Louis, MO	S-9625
Potassium chloride	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3040-04
Potassium phosphate, monobasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3246-01
Potassium phosphate, dibasic	JT Baker, Phillipsburg, NJ	3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes	Corning, Corning, NY	4558
2 ml Microcentrifuge Tubes	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm)	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13113-50
Scoopula	Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE	1437520
Balance	Ohaus, Parsippany, NJ	E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)	Acros Organics, NJ	22716-5000
Polyethylene glycol 8000	Sigma Aldrich, St Louis, MO	P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP1752-400
Centrifuge	Eppendorf, Hauppauge, NY	5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1)	Sigma Aldrich, St Louis, MO	C0549-1PT
TE Buffer	Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE	AM9860
Pipets	Rainin, Woburn, MA	Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips	Rainin, Woburn, MA	Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor	Scientific Industries, Bohemia, NY	G-560
Vortex Adaptor	MoBio Laboratories, Carlsbad, CA	13000-V1
Clear Bottle	Corning, Corning, NY	C1395500
Amber Bottle	Corning, Corning, NY	C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm	Corning, Corning, NY	430513
60 ml Syringe	Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ	BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm	EMD Millipore, Billerica, MA	SLGV033RB
70% Ethanol	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP2818-500	diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	151030511
Cell Spreader	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	08-100-10
Disposable Inoculating Loops	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-363-602