通过使用光稳定菁染料波长移的DNA杂交探针的合成

摘要

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

摘要

在这个协议中，我们证明了2'-炔合成的方法，用标准的亚磷酰胺化学改性通过自动固相合成脱氧核糖核酸（DNA）链。寡核苷酸是使用铜催化点击化学两个新的耐光菁染料后的综合标记。供体和受体染料的合成中描述并在连续的三个步骤进行。用该DNA作为周边结构，这两种染料经历能量转移时，他们通过杂交带入靠近。因此，两个单链DNA链的退火通过荧光颜色的变化可视化。这种颜色的变化的特征是荧光光谱，但也可以通过使用手持式紫外线（UV）灯被直接观察。双色荧光读出的概念使得这些寡核苷酸探针的分子成像尤其是当所描述的河粉优秀的工具tostable染料被使用。从而，成像探针的光漂白防止和生物过程可实时地观察了更长的时间。

引言

分子成像代表活细胞内理解生物过程的基本技术^。1-3荧光基于核酸的探针，例如化学-生物应用的发展，已成为一个扩大的研究领域。这些荧光探针需要满足一些要求，成为细胞成像适当的工具。首先，施加染料应该具有高量子产率的荧光，大斯托克斯位移，而最重要的是，高光稳定性，以允许在体内成像长期。其次，他们应该表现出可靠的荧光读数。常规发色团-猝灭剂的系统是基于在荧光强度简单的变化的单一荧光颜色的读出^。4这种方法承担的假阳性或假阴性结果的风险，由于细胞内成分或低信号对噪声比的自发荧光由于其他COM意外淬火ponents ⁴

我们最近报道的"DNA的交通灯"，通过使用两个不同的发色团显示出双重荧光颜色读数的概念^。5-6的概念是基于从供体染料的能量传递（ET），以受体染料而变化的荧光颜色（参见图1）。这允许更可靠的读出，从而提供了用于荧光成像探针的有力工具。用荧光染料的寡核苷酸标签可通过两种不同的方法来实现。染料可以在化学DNA合成过程中，通过使用相应的改进的Phosphoramidite积木掺入在固相上^。7该方法仅限于那些标准亚磷酰胺和脱保护条件下是稳定的染料。作为替代方案，后合成修饰方法建立在寡核苷酸化学。在这里，我们展示我们的新照片之一的合成表能量转移对^8,9和DNA的用叠氮化物和炔烃（CuAAC）之间的铜催化的1,3-环加成的合成后标记^。10

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研究方案

注意:使用前请咨询所有相关的材料安全数据表（MSDS）。几个在这些合成中使用的化学品是有毒和致癌性。请使用在有机化学实验室，如穿试验服，护目镜和手套通常所需的所有适当的安全措施。

1.染料的合成

注意:两个染料可以通过相同类型的反应来合成图2示出了这些反应的概述。

1. 1-（3-叠氮基丙基）的合成-4-（2-（1-甲基-1H-吲哚-3-基）乙烯基）吡啶-1-鎓碘化物（染料1）
   1. 1-（3-碘丙基）-4-甲基吡啶-1-鎓碘化物的合成（图2A，步骤a）
      1. 溶解466毫克4-甲基吡啶和5.91克1,3-二碘丙烷在10ml乙腈中的在20ml的顶部空间小瓶中，通过隔片盖紧密地密封。
      2. 热至85℃16小时。
      3. 允许冷却至室温，然后使用旋转蒸发器减压除去溶剂。
      4. 加入20ml乙酸乙酯加入到残留的油和处理在120瓦超声浴将混合物3分钟。
      5. 通过过滤收集形成的沉淀并用乙酸乙酯洗涤五次。在真空下干燥O / N固体产品。
   2. 1-（3-叠氮基丙基）-4-甲基吡啶-1-鎓合成（图2A，步骤b）
      1. 溶解900毫克1-（3-碘丙基）-4-甲基吡啶-1-鎓碘化物12毫升乙腈中20ml的顶部空间小瓶中，添加376毫克叠氮化钠，并且通过隔片盖紧密地密封。
      2. 热至85℃16小时。
      3. 允许冷却至室温，然后用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。
      4. 二氯甲烷（15mL）添加至残余物中。
      5. 滤除并丢弃得到的沉淀。
      6. 使用腐减压除去溶剂进制蒸发，得到产物，为棕色油状物。
   3. 1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛的合成（图2A，步骤c）
      1. 在惰性气体（氩气），溶解1.45克吲哚-3-甲醛，1.52克碳酸钾2.70克的二碳酸在10ml绝对二甲基甲酰胺在50毫升圆底烧瓶装有回流冷凝器。
      2. 搅拌在130℃的混合物19小时。
      3. 允许冷却至室温，然后倒在冰上将混合物。
      4. 萃取水层用150ml乙酸乙酯萃取三次。
      5. 合并有机层，用水洗，晾干硫酸钠和用旋转蒸发器在减压下于50℃除去溶剂。
   4. 耦合至1-（3-叠氮基丙基）-4-（2-（1-甲基-1H-吲哚-3-基）乙烯基）吡啶-1-鎓碘化物（染料1）（图2A，步骤d）
      1. 在氩气下和在排除水分工作。 Dissol已经90毫克1-（3-叠氮基丙基）-4-甲基吡啶-1-鎓和48毫克1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛在4ml乙醇中20ml的圆底烧瓶装有回流冷凝器。
      2. 添加0.07毫升哌啶，并加热到80℃4小时。
      3. 允许冷却至室温。
      4. 通过过滤收集得到的沉淀，用乙醚洗涤三次。
      5. 二乙醚添加到上清液并通过过滤收集得到的沉淀。用乙醚洗涤三次。
      6. 结合沉淀。
2. 1-（3-叠氮基丙基）的合成-4-（2-（1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-基）乙烯基）喹啉-1-鎓碘化物（染料2）
   1. 1-（3-碘丙基）-4-甲基喹啉-1-鎓碘化物的合成（图2B，步骤a）
      1. 溶解715毫克4-甲基喹啉和5.91克1,3-二碘丙烷在10ml乙腈中的在20ml的顶部空间小瓶中，通过隔片盖紧密地密封。
      2. 热至85℃16小时。
      3. 允许冷却至室温，然后用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。
      4. 加入20ml乙酸乙酯添加到剩余的油和处理在120瓦超声浴将混合物3分钟。
      5. 通过过滤收集形成的沉淀并用乙酸乙酯洗涤五次。在真空下干燥O / N固体产品。
   2. 1-（3-叠氮基丙基）-4-甲基喹啉-1-鎓合成（图2B，步骤b）
      1. 溶解900毫克1-（3-碘丙基）-4-甲基喹啉-1-鎓碘化物12毫升乙腈中20ml的顶部空间小瓶中，添加333毫克叠氮化钠，并且通过隔片盖紧密地密封。
      2. 热至85℃16小时。
      3. 允许冷却至室温，然后用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。
      4. 二氯甲烷（15mL）添加至残余物中。
      5. 滤除并丢弃得到的沉淀。
      6. 除去溶剂ü升气管使用旋转蒸发，得到产物，为棕色油状物减压。
   3. 1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛的合成（图2B，步骤c）
      1. 在惰性气体（氩气），溶解1.45克2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛，0.996克碳酸钾和1.77克的二碳酸在10ml绝对二甲基甲酰胺在50毫升圆底烧瓶装有回流冷凝器。
      2. 搅拌在130℃的混合物19小时。
      3. 允许冷却至室温，然后倒在冰上将混合物。
      4. 萃取水层用150ml乙酸乙酯萃取三次。
      5. 合并有机层，用水洗，干燥它们经硫酸钠，并使用旋转蒸发器在减压下除去溶剂。
   4. 耦合至1-（3-叠氮基丙基）-4-（2-（1-甲基-2-苯丙氨酸NYL -1H-吲哚-3-基）乙烯基）喹啉-1-鎓碘化物（图2B，步骤d）
      1. ARG下工作上和下排除水分。溶解90mg的1-（3-叠氮基丙基）-4-甲基喹啉-1-鎓和59.7毫克1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛在4ml乙醇中20ml的圆底烧瓶中装有回流冷凝器。
      2. 添加0.06毫升哌啶，并加热到80℃4小时。
      3. 允许冷却至室温。
      4. 通过过滤收集得到的沉淀，并用乙醚三次洗涤。
      5. 二乙醚添加到上清液并通过过滤收集得到的沉淀。用乙醚洗涤三次。
      6. 结合沉淀。

2. DNA链的合成

注意:DNA链的合成是通过使用亚磷酰胺方法在固相上，如在DNA合成由M. Caruthers ¹¹所述。合成器的功能是在合成步骤之前进行测试，和试剂被更新，如果必要。

1. Prearrangements
   1. 在1.2毫升亚酰胺稀释剂（额外干燥乙腈）的溶解市售2'-O-炔丙基deoxyuridinephosphoramidite（CU）。移动溶液在小瓶给合成小瓶中，并拧入合成器。
   2. 执行"泄漏测试"（根据制造商的说明），以确保没有氩气泄漏存在。如果"泄漏测试"失败，拧小瓶更紧密。
   3. 素填充，连接到固相合成腔管中的CU溶液。
   4. 清洗所有线路的乙腈。
2. DNA链的合成
   1. 使用连接计算机进入DNA序列和耦合方法，以下从制造商的协议的提示。相比40秒，7个脉冲为一常规的CU积木的偶联步骤需要168秒，7个脉冲（每个脉冲是16微升）亚磷作为构建块。
   2. 装入含有与该第一基底的1微摩尔改性的CPG（可控孔度玻璃），为固相的柱到合成仪（DNA合成是从3'至5'执行）。
   3. 开始对DNA合成¹¹的合成。
3. 合成的DNA链的后处理
   1. 干燥，真空下O / N合成的DNA链的列。
   2. 使用钳子打开柱并释放CPG入反应小瓶中。加入700μl浓缩的氨水溶液的去保护寡核苷酸，并从CPG释放的DNA链。
   3. 关闭小瓶并应用安全盖到反应容器中，以防止其破裂，并加热至50℃18小时。
   4. 通过在减压（100毫巴）离心，在30℃30分钟除去氨。
   5. 在11000 XG FO离心机容器:从CPG开始过滤R 3分钟。取上清液，并将其与0.45微米的孔尺寸转移到一个离心设备。离心在1000 xg离心4分钟。
   6. 同时在11000 xg离心加300微升双蒸水至CPG，涡旋20秒并离心3分钟。将上清转移到离心装置和离心机在1000×g离心4分钟。重复此洗涤步骤两次。
   7. 通过在0.1毫巴和25℃CO / N离心除去从合并的水溶液的水。

3."单击"程序

1. 加入50μl双蒸馏水中，抗坏血酸钠溶液的25微升（在水中的0.4M），34微升三 - [（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺（0.1 M在DMSO /叔丁醇3:1），114微升叠氮化物（0.01M在DMSO /叔丁醇3:1）和17微升四（乙腈）铜（I）​​六氟磷酸盐溶液（0.1M在DMSO /叔丁醇3: 1）以冻干炔修饰的DNA样品。
2. 孵育在60℃下的样品1.5小时。
3. 冷却到室温。
4. 添加150微升_的 Na ₂ EDTA（0.05M水溶液）和450微升乙酸钠（在水中的0.3M）的DNA样品，并转移到10毫升管。
5. 加入10毫升乙醇中（100％），并保持在-32℃下16小时。
6. 离心容器在1000 XG 15分钟和上清。
7. 洗的DNA沉淀用2ml冷的乙醇（80％）。
8. 减压干燥沉淀。

4. HPLC纯化

注:之前分离DNA链，确保了HPLC工作正常，足够的溶剂可和列是干净的。用缓冲液/乙腈的起始浓度冲洗柱。

1. 溶解在250微升双蒸馏水和转让的粗的DNA沉淀至HPLC小瓶中。
2. 用0％乙腈梯度开始的45分钟HPLC运行乙腈的15％为染料1和gradi 0％乙腈耳鼻喉科乙腈染料2的17％通过检查260纳米（DNA吸收）和459纳米（染料1）或542纳米（染料2）监控运行。收集那些表现在两个波长信道的吸收分数。
3. 通过采用由3-羟基吡啶甲酸（3HPA）和diammoniumhydrogencitrate基质基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱法检查正确质量的收集的级分。
   1. 乙腈和水用100μl在水中的diammoniumhydrogencitrate溶液（100克/升）的1-混合物:通过在1混合900微升的饱和3-HPA溶液的制备基质。
   2. 吸取目标1-2微升DNA探针，让它干燥的空气。
   3. 添加0.2微升3-HPA / diammoniumhydrogencitrate矩阵于样品并混合至其结晶。
   4. 执行MALDI质谱法。
   5. 结合表现出正确的质量那些HPLC级分。

_title"> 5。浓度的测定

注意:浓度是通过使用紫外/可见分光光度计，基于所述DNA碱基和染料的消光系数_（ε260）测定260nm处的吸收来确定。

1. 溶解在100 DNA的 - 200微升双蒸馏水。
2. 应用1μl的在紫外/可见分光光度计的DNA溶液。
3. 测量在260nm的吸收。重复三次。
4. 取平均值来计算该溶液的浓度。为消光系数的计算中，使用四种天然碱基¹²的_ε260nm处和购买的积木Cu的_ε260nm处 （被认为是自然尿苷^）12，以获得整个DNA链的_ε260nm处 。对于染料1，用ε= _260nm的 10200 L *摩尔^-1 * ^-1和染料2，用ε= _260nm的 13100 L *摩尔 ^{-1 * -1。计算以下基于所述消光系数和测定吸光度朗伯-比尔斯定律的溶液的浓度。13}

6.样品制备和光谱

1. 单链样品的制备
   1. 制备分别将1ml各200mM的氯化钠，50mM的NAP _i缓冲改性DNA1和DNA2的2.5微米的解决方案，pH值= 7。
2. 双链样品的制备
   1. 制备1ml含有DNA1 2.5μM和2.5μMDNA2的在200毫摩尔NaCl，50毫NAP _i缓冲，pH值= 7在反应容器中的溶液。
   2. 固定盖子与安全盖，并加热到90℃10分钟。然后关闭加热，让冷却到室温O / N。
3. 吸收光谱
   注意:要确定规范的荧光激发波长troscopy吸收光谱被记录。
   1. 单链测量
      1. 记录只含有200 mM氯化钠，50mM的NAP _i缓冲，pH值= 7的空白测量。
      2. 转移DNA1的制备的溶液到1厘米的石英玻璃比色杯，并记录吸收。纠正对空白数据的测定。确定染料的吸收最大值。
      3. 重复DNA2。
4. 荧光光谱
   1. 单链测量
      1. 记录只包含200毫米氯化钠，50毫米NAP _i缓冲空白测量，pH值= 7;用染料1的激发波长。
      2. 转移DNA1溶液到1厘米的石英玻璃比色杯。
      3. 记录荧光光谱。
   2. 双链测量
      1. 转移双链溶液到石英玻璃比色杯。
      2. 记录用染料1的激发波长的荧光光谱。
5. 可视化实验
   注意:适当的保护眼睛应佩戴避免紫外线对眼睛的伤害！
   1. 为了更好地了解什么样的记录的光谱显示，用照射紫外线手持灯（ 图5）的试管。观察荧光的颜色由单一的双链DNA的变化。

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结果

的单链和双链DNA的吸收和荧光光谱被记录为如图4所示。

所记录的吸收光谱（ 图4右）显示吸收峰λ _最大为465纳米的单链DNA1（染料1）和单链DNA2（染料2）546纳米。退火的DNA1_2（染料1染料2）示出了在两个469纳米和567纳米的最大值。两个最大吸收显示出红移，对于染料1 4纳米和21纳米的染料。这些...

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讨论

这个协议显示了完整的过程来标记DNA后合成通过CuAAC由叠氮化物修饰的荧光染料。这包括染料和炔修饰的DNA的合成，以及作为标记过程。

染料的合成如下四个步骤。所有的产品可以通过一种相当简单的沉淀由于它们的正电荷而获得，不需要耗时柱色谱法。引入中央偶联步骤之前的叠氮化物官能的缩短了染料的合成四个而不是5个连续的反应步骤。避免了1,3-二碘丙烷代替3-碘丙?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
synthesis
4-Picoline	Sigma Aldrich	239615
1,3-Diiodopropane	Sigma Aldrich	238414
Acetonitrile	Fisher Scientific	10660131	HPLC grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10456870	technical grade
Sodium azide	Sigma Aldrich	71290	p.a. grade
Dichloromethane	Fisher Scientific	10626642	technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98%	ABCR	AB112969
Potassium carbonate, 99+%	Acros	424081000
dimethylcarbonate	Sigma Aldrich	517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve	Acros	348435000
Sodium sulfate	Bernd Kraft	12623.46
Ethanol, 99.5%	Acros	397690010
Piperidine, 99%	Acros	147181000
Diethylether	Fisher Scientific	10407830	technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%	ABCR	AB125050
4-Methylquinoline	ABCR	AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer	Applied Biosystems	-
DMT-dA(bz) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	A111081
DMT-dT Phosphoramidite	Sigma Aldrich	T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis	Sigma Aldrich	L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis	Sigma Aldrich	L010400
Cap A	Sigma Aldrich	L840000
Cap B	Sigma Aldrich	L850000
CPG dT Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	C461010
ammonia (aqueous solution)	Fluka Analytical	318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm	Pall	ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)	Sigma Aldrich	75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite	Chem Genes	ANP-7754
workup
vacuum concentrator	Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate	Sigma Aldrich	346276
Sodium acetate	Sigma Aldrich	S2889
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
EDTA disodium salt	Sigma Aldrich	E5134
TBTA-ligand	-	-	synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system	Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer	Bruker Daltonics
LC-318 C18 column	Supelcosil via Sigma Aldrich	58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer	nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio	Varian
Fluoromax-3 fluorimeter	Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.