Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

Resumen

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Resumen

En este protocolo, se demuestra un método para la síntesis de 2'-alquino modificado hebras ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntesis en fase sólida automatizada usando química de fosforamidita estándar. Los oligonucleótidos se post-sintéticamente etiquetados por dos nuevos tintes de cianina fotoestables utilizando catalizada por cobre click-química. La síntesis tanto de tinte donador y el aceptor se describe y se realiza en tres pasos consecutivos. Con el ADN como la arquitectura circundante, estos dos colorantes se someten a una transferencia de energía cuando se ponen en estrecha proximidad por hibridación. Por lo tanto, la hibridación de dos cadenas de ADN de cadena sencilla se visualiza mediante un cambio de color de la fluorescencia. Este cambio de color se caracteriza por espectroscopia de fluorescencia, pero también puede ser observada directamente mediante el uso de una lámpara de ultravioleta de mano (UV). El concepto de una lectura de fluorescencia de dos colores hace que estas sondas de oligonucleótidos excelentes herramientas para imágenes moleculares especialmente cuando el pho descritose utilizan colorantes tostable. De este modo, se evita que photobleaching de las sondas de formación de imágenes, y los procesos biológicos se puede observar en tiempo real para un período de tiempo más largo.

Introducción

La imagen molecular representa una técnica fundamental para la comprensión de los procesos biológicos dentro de las células vivas. ^1-3 El desarrollo de sondas basadas en ácidos nucleicos fluorescentes para tales aplicaciones químico-biológicas se ha convertido en un campo de investigación en expansión. Estas sondas fluorescentes tienen que cumplir con algunos requisitos para convertirse en herramientas adecuadas para imágenes de células. En primer lugar, los tintes aplicados deben exhibir fluorescencia con altos rendimientos cuánticos, los cambios grandes de Stokes y, sobre todo, las altas fotoestabilidades para permitir a largo plazo de imágenes in vivo. Y en segundo lugar, deben mostrar una lectura de fluorescencia fiable. Convencional cromóforo-extintor-sistemas se basan en la lectura de un solo color fluorescencia mediante simples cambios en la intensidad de fluorescencia. ⁴ Este enfoque conlleva el riesgo de resultados positivos falsos o negativos falsos debido a la autofluorescencia de los componentes intracelulares o baja relación señal-ruido debido a enfriamiento no deseado por otro comcomponentes. ⁴

Recientemente hemos informado sobre el concepto de "semáforos" de ADN que muestran lecturas de fluorescencia de dos colores mediante el uso de dos cromóforos diferentes. ^5-6 El concepto se basa en la transferencia de energía (ET) a partir del colorante donante al colorante aceptor que cambia la fluorescencia Color (ver Figura 1). Esto permite una lectura más fiable y por lo tanto proporciona una poderosa herramienta para sondas de imagen fluorescentes. Etiquetado de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes se puede lograr mediante dos enfoques diferentes. Los colorantes se pueden incorporar durante la síntesis química de ADN sobre una fase sólida mediante el uso de bloques de construcción de fosforamidita correspondientemente modificados. ⁷ Este método se limita a colorantes que son estables bajo condiciones de fosforamidita y desprotección estándar. Como alternativa, las metodologías de modificación post-sintéticos fueron establecidos en la química de oligonucleótidos. Aquí, demostramos la síntesis de una de nuestras nuevas fotosenergía tabla de pares de transferencia de ^8,9 y el etiquetado de post-sintética de ADN mediante el uso de cobre-1,3-catalizada cicloadición entre azidas y alquinos (CuAAC). ¹⁰

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Protocolo

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas apropiadas de seguridad que normalmente se requieren en los laboratorios de química orgánica, tales como el uso de una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes.

1. Síntesis de los colorantes

Nota: Ambos colorantes pueden ser sintetizados por los mismos tipos de reacción Figura 2 muestra una visión general de estas reacciones..

1. Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1)
   1. Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa a)
      1. Disolver 466 mg 4-picolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum.
      2. Calentar a 85 ° C durante 16 hr.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
      4. Añadir 20 ml de acetato de etilo al aceite residual y la mezcla se trata en un baño ultrasónico W 120 para 3 min.
      5. Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N.
   2. Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa b)
      1. Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 376 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum.
      2. Calentar a 85 ° C durante 16 hr.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
      4. Añadir 15 ml de diclorometano al residuo.
      5. Filtrar y desechar el precipitado resultante.
      6. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un rotevaporador ary para obtener el producto como aceite de color marrón.
   3. Síntesis de 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2A, etapa c)
      1. Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de indol-3-carbaldehído, 1,52 g de carbonato de potasio y 2,70 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo.
      2. Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo.
      4. Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo.
      5. Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a 50 ° C bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio.
   4. Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1) (Figura 2A, etapa d)
      1. Trabajar en atmósfera de argón y con exclusión de humedad. DISSOLve 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io y 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo.
      2. Añadir 0,07 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
      4. Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava tres veces con éter dietílico.
      5. Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico.
      6. Combinar los precipitados.
2. Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (tinte 2)
   1. Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, etapa a)
      1. Disolver 715 mg 4-metilquinolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum.
      2. Calora 85 ° C durante 16 hr.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
      4. Añadir 20 ml de acetato de etilo al resto de aceite y tratar la mezcla en un baño ultrasónico 120 W durante 3 min.
      5. Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N.
   2. Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, la etapa b)
      1. Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 333 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum.
      2. Calentar a 85 ° C durante 16 hr.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
      4. Añadir 15 ml de diclorometano al residuo.
      5. Filtrar y desechar el precipitado resultante.
      6. Retire el disolvente under presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para obtener el producto como aceite de color marrón.
   3. Síntesis de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2B, la etapa c)
      1. Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de 2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído, 0,996 g de carbonato de potasio y 1,77 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo.
      2. Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo.
      4. Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo.
      5. Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio.
   4. Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-phe nyl-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (Figura 2B, la etapa d)
      1. Trabajar bajo argsobre y bajo exclusión de humedad. Disolver 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io y 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz de fondo redondo equipado con condensador de reflujo.
      2. Añadir 0,06 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h.
      3. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
      4. Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava con éter dietílico tres veces.
      5. Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico.
      6. Combinar los precipitados.

2. Síntesis de las cadenas de ADN

Nota: La síntesis de las cadenas de ADN se lleva a cabo utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida, como se describe por M. Caruthers ¹¹ en un sintetizador de ADN. El funcionamiento del sintetizador se prueba antes del procedimiento sintético, y los reactivos se renuevan sinecesario.

1. prearrangements
   1. Se disuelve el disponible comercialmente 2'-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) en 1,2 ml de diluyente amidita (acetonitrilo seco adicional). Mueva la solución en el vial a un vial de sintetizador y el tornillo en el sintetizador.
   2. Realizar una "prueba de fugas" (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para asegurarse de que no existe una fuga de gas argón. Si la "prueba de fugas" falla, el tornillo en el vial con más fuerza.
   3. Primer la solución cU rellenando el tubo que conecta a la cámara de síntesis en fase sólida.
   4. Lave todas las líneas con acetonitrilo.
2. Síntesis de cadenas de ADN
   1. Utilizar el ordenador conectado a entrar en el método de secuencia de ADN y de acoplamiento, siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. La etapa de acoplamiento del bloque de construcción cU tarda 168 segundos con 7 pulsos (cada pulso son 16 l) en comparación con 40 segundos con 7 impulsos para una convencionalfosforamidita como bloques de construcción.
   2. Montar la columna que contiene el CPG (vidrio de poro controlado) como fase sólida que se ha modificado con 1 mol de la primera base (síntesis de ADN se lleva a cabo a partir de 3 'a 5') en el sintetizador.
   3. Iniciar la síntesis de ADN en el sintetizador ^11.
3. Workup de cadenas de ADN sintetizadas
   1. Se secan las columnas con las cadenas de ADN sintetizadas bajo vacío S / N.
   2. Utilice una pinza para abrir la columna y liberar la CPG en un vial de reacción. Añadir 700 l de solución de amoniaco acuoso concentrado para desproteger el oligonucleótido y liberar la hebra de ADN a partir de la GPC.
   3. Cerrar el vial y aplicar una tapa de seguridad en el recipiente de reacción para evitar que se rompa, y se calienta a 50 ° C durante 18 hr.
   4. Eliminar el amoníaco por centrifugación bajo presión reducida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min.
   5. Comience la filtración de GPC: Recipiente de centrifugar a 11.000 xg for 3 min. Tome sobrenadante y la transfiere en un dispositivo centrífugo con un tamaño de poro de 0,45 micras. Se centrifuga a 1.000 xg durante 4 minutos.
   6. Mientras tanto, añadir 300 l de agua doblemente destilada a la GPC, vórtice durante 20 segundos y se centrifuga a 11.000 xg durante 3 min. Transferir el sobrenadante en el dispositivo de centrífuga y centrifugar a 1000 xg durante 4 min. Repita este procedimiento de lavado dos veces.
   7. Eliminar el agua de las soluciones acuosas combinadas por centrifugación a 0,1 mbar y 25 ° CO / N.

3. Procedimiento de "clic"

1. Añadir 50 l de agua doblemente destilada, 25 l de una solución de ascorbato de sodio (0,4 M en agua), 34 l de tris - [(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1), 114 l de la azida (0,01 M en DMSO / tBuOH 3: 1) y 17 l de un tetrakis () de cobre (solución hexafluorofosfato de acetonitrilo I) (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1) a la muestra de ADN alquino-modificado liofilizado.
2. Incubar la muestra a 60 ° C durante 1,5 hr.
3. Enfriar a temperatura ambiente.
4. Añadir 150 l Na ₂ EDTA (0,05 M en agua) y 450 l de acetato de sodio (0,3 M en agua) a la muestra de ADN y la transferencia a un tubo de 10 ml.
5. Añadir 10 ml de etanol (100%) y mantenerla en -32 ° C durante 16 horas.
6. buque Centrifugar durante 15 min a 1.000 xg y eliminar el sobrenadante.
7. Lavar DNA-pellet con 2 ml de etanol frío (80%).
8. pellet seco bajo presión reducida.

4. La purificación por HPLC

Nota: Antes de la separación de las hebras de ADN se aseguran de que la HPLC está funcionando adecuadamente, lo suficientemente solvente está disponible y la columna está limpio. Enjuague columna con la concentración de partida de tampón / acetonitrilo.

1. Se disuelve el crudo ADN precipitado en 250 l de agua doblemente destilada y la transferencia a un vial de HPLC.
2. Iniciar la HPLC de ejecución de 45 min con un gradiente de 0% de acetonitrilo a 15% de acetonitrilo para el tinte 1 y un gradi ento de 0% de acetonitrilo al 17% de acetonitrilo para el tinte 2. Monitorear la carrera por el control de 260 nm (absorción de ADN) y 459 nm (colorante 1) o 542 nm (colorante 2). Reunir las fracciones que muestran la absorción en los dos canales de longitud de onda.
3. Compruebe las fracciones recogidas de la masa por la derecha asistida por matriz de ionización de desorción por láser (MALDI) espectrometría de masas usando una matriz que consiste en 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) y diammoniumhydrogencitrate.
   1. Preparar la matriz mediante la mezcla de 900 l de una solución saturada de 3-HPA en 1: 1 mezcla de acetonitrilo y agua con 100 l de una solución diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) en agua.
   2. Pipetear 1-2 l de la sonda de ADN en el objetivo y dejar secar al aire.
   3. Añadir 0,2 l de la matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate a la muestra y se mezcla hasta que cristaliza.
   4. Realizar la espectrometría de masas MALDI.
   5. Combinar las fracciones de HPLC que muestran los medios de la derecha.

_TITLE "> 5. Determinación de la concentración

Nota: La concentración se determina midiendo la absorción a 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS, sobre la base de los coeficientes de extinción (ε ₂₆₀₎ de las bases de ADN y el colorante.

1. Disolver el ADN en 100 - 200 l de agua doblemente destilada.
2. Aplicar 1 l de la solución de ADN en el UV / Vis espectrofotómetro.
3. Medir la absorción a 260 nm. Repetir tres veces.
4. Toma el valor medio para calcular la concentración de la solución. Para el cálculo de los coeficientes de extinción, utilizar ε _{260 nm} de las cuatro bases naturales ¹² y el _{260 nm} ε de la UC bloque de construcción comprado (considerado como uridina natural) ¹² para obtener el _{260 nm} ε de toda la cadena de ADN. Para colorante 1, el uso ε _{260 nm} = 10,200 * L * mol ^-1 cm ^-1 y 2 para el tinte, el uso ε = _{260 nm} 13.100 L * mol ^{-1 * cm-1. Calcular la concentración de la solución siguiente ley de Lambert-Beers 'basado en los coeficientes de extinción y absorbancias medidas. 13}

6. Preparación de la muestra y Espectroscopía

1. Preparación de muestras de una sola hebra
   1. Preparar separado 1 ml de 2,5 M soluciones de cada uno de los DNA1 modificado y DNA2 en NaCl 200 mM, NaP 50 mM, pH _i = 7.
2. Preparación de muestras de doble cadena
   1. Preparar 1 ml de una solución que contiene 2,5 M de DNA1 y 2,5 M de NaCl en DNA2 200 mM, NaP 50 mM _I buffer, pH = 7 en un recipiente de reacción.
   2. Fije la tapa con un tapón de seguridad y el calor a 90 ° C durante 10 min. A continuación, apague la calefacción y se deja enfriar a temperatura ambiente O / N.
3. espectroscopia de absorción
   Nota: Para determinar la longitud de onda de excitación para la especificación de fluorescenciaLos espectros de absorción espectroscopia se registran.
   1. Capítulo único de mediciones
      1. Registrar una medición en blanco, solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP _I buffer, pH = 7.
      2. Transferir la solución preparada de DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo y registrar la absorción. Corregir la medición contra los datos en blanco. Determinar el valor máximo de absorción del colorante.
      3. Repita para DNA2.
4. La espectroscopia de fluorescencia
   1. Capítulo único de mediciones
      1. Grabar una medida en blanco que contenía NaCl 200 mM única, NaP 50 mM _I buffer, pH = 7; usando la longitud de onda de excitación del tinte 1.
      2. Transferir la solución DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo.
      3. Registre el espectro de fluorescencia.
   2. Medición de doble hebra
      1. Transferir la solución de doble cadena en una cubeta de vidrio de cuarzo.
      2. Registre el espectro de fluorescencia utilizando la longitud de onda de excitación del tinte 1.
5. experimentos de visualización
   Precaución: la protección ocular adecuada se debe usar para evitar el daño UV a los ojos!
   1. Para obtener una mejor comprensión de lo que los espectros registrados se muestran, irradiar las cubetas con lámparas UV de mano (Figura 5). Observe el cambio en el color de la fluorescencia de la sola con el ADN de doble cadena.

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Resultados

La absorción y fluorescencia espectros del ADN de una sola y de doble cadena se registran como se muestra en la Figura 4.

Los espectros de absorción registrada (Figura 4 derecha) muestran la absorción máximos λ _max a 465 nm para DNA1 de cadena sencilla (colorante 1) y 546 nm para DNA2 de cadena sencilla (colorante 2). El DNA1_2 recocido (tinte y tinte 1 2) muestra máximos a 46...

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Discusión

Este protocolo muestra el procedimiento completo para etiquetar ADN post-sintéticamente a través de CuAAC por los tintes fluorescentes azida modificado. Esto incluye la síntesis de los colorantes y el ADN alquino-modificado, así como el procedimiento de etiquetado.

La síntesis de los colorantes sigue cuatro pasos. Todos los productos pueden ser obtenidos por una precipitación bastante simple debido a su carga positiva y no se necesita cromatografía en columna consume mucho tiempo. La ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
synthesis
4-Picoline	Sigma Aldrich	239615
1,3-Diiodopropane	Sigma Aldrich	238414
Acetonitrile	Fisher Scientific	10660131	HPLC grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10456870	technical grade
Sodium azide	Sigma Aldrich	71290	p.a. grade
Dichloromethane	Fisher Scientific	10626642	technical grade
Indole-3-carboxaldehyde; 98%	ABCR	AB112969
Potassium carbonate, 99+%	Acros	424081000
dimethylcarbonate	Sigma Aldrich	517127
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve	Acros	348435000
Sodium sulfate	Bernd Kraft	12623.46
Ethanol, 99.5%	Acros	397690010
Piperidine, 99%	Acros	147181000
Diethylether	Fisher Scientific	10407830	technical grade
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%	ABCR	AB125050
4-Methylquinoline	ABCR	AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer	Applied Biosystems	-
DMT-dA(bz) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	A111081
DMT-dT Phosphoramidite	Sigma Aldrich	T111081
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	G11508
DMT-dC(bz) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	C11108
Amidite Diluent for DNA synthesis	Sigma Aldrich	L010010
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis	Sigma Aldrich	L010400
Cap A	Sigma Aldrich	L840000
Cap B	Sigma Aldrich	L850000
CPG dT Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	T461010
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	A461010
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	G461010
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole	Proligo Reagents	C461010
ammonia (aqueous solution)	Fluka Analytical	318612
centrifugal devices nanosep 0.45 µm	Pall	ODGHPC34
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)	Sigma Aldrich	75666
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite	Chem Genes	ANP-7754
workup
vacuum concentrator	Christ
clicking procedure
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate	Sigma Aldrich	346276
Sodium acetate	Sigma Aldrich	S2889
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma Aldrich	A7631
EDTA disodium salt	Sigma Aldrich	E5134
TBTA-ligand	-	-	synthesized according to a literature procedure1
HPLC
HPLC-system	Shimadzu
MALDI-Biflex-IV spectrometer	Bruker Daltonics
LC-318 C18 column	Supelcosil via Sigma Aldrich	58368
determination of concentration
ND 1000 Spectrophotometer	nanodrop
sample preparation and spectroscopy
Cary 100 Bio	Varian
Fluoromax-3 fluorimeter	Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.