应用荧光共振能量转移（FRET）审查效应转运效率由<em&gt;贝氏柯克斯体</em&gt; siRNA沉默中

摘要

调查细菌病原体和宿主之间的相互作用是生物学研究的一个重要领域。在这里，我们描述了必要的技术测量使用布拉姆基板的siRNA的基因沉默过程中贝氏柯克斯体效应易位。

摘要

贝氏柯克斯体 ，Q热的病原体，是一种细胞内病原体依赖于IV型点/ ICM分泌系统建立一个复制的利基。效应的队列，通过该系统转移进入宿主细胞来操纵主机进程和允许建立用于复制一个独特溶酶体衍生的液泡的。这里提出的方法涉及的两个成熟的技术相结合:使用的siRNA特异性基因沉默和使用依赖于β内酰胺酶活性的基于FRET的衬底效应易位测定。运用这两种方法，我们可以开始了解宿主因素在细菌分泌系统的功能和效应易位的作用。在此研究中，我们检查RAB5A和Rab7A，无论是内吞贩卖通路的重要调节器的作用。我们表明，沉默在效应translocatio下降或者蛋白质结果的表达氮效率。这些方法可以很容易地修改，以研究其他细胞内外的病原体也利用分泌系统。以这种方式，所涉及的细菌效应易位宿主因子的全局图像可以显现出来。

引言

贝氏柯克斯体是一种独特的细胞内病原体引起人畜共患的人类感染Q热。此疾病与延伸从无症状的血清转化到威胁生命的慢性感染，往往表现为心内膜炎年曝光¹后临床 ​​表现的广谱相关联。人类感染主要通过与反刍动物感染的主要储存器，特别是奶牛，绵羊和山羊污染气溶胶的吸入发生。虽然感染贝氏在这些动物通常是亚临床型，感染可能引发流产和分娩流体和胎盘中的相当细菌量会污染当地环境^1。巨大的负担，这种污染的一个例子可能对公共健康和农业产业化中的Q热疫情发生在荷兰²最近观察。 2007年之间，2010年，Q热4000人感染病例被确诊，这爆发挂山羊养殖场³显著污染。另外， 贝氏是潜在的生物武器，如划分由美国疾病控制和预防中，由于细菌的和必要的低感染剂量的环境稳定性造成严重的发病率和死亡率^4。

贝氏存在于两个阶段:第一阶段的生物体，从天然来源分离的，是非常强毒和II期生物体在体内高度衰减。例如，在贝氏柯克斯体九里期生物体几个体外通路，制作了第二阶段的细菌包含一个不可逆转的染色体缺失导致截短的脂多糖^{（LPS）5。}本品系，C. burnetii NMII，是表型上类似的I期的组织培养模型，并提供一个更安全的模式l对于研究人员研究实验室⁵发病贝氏 。近年来几个突破进展迅速贝氏遗传学领域。最值得注意的是，无菌媒体的发展（酸化柠檬酸半胱氨酸介质- ACCM-2）已经允许贝氏的无细胞生长在液体和固体培养基上^6,7。这导致了包括可诱导的基因表达系统，穿梭载体和随机转座子系统^8-11可贝氏遗传工具直接改进。最近，两种方法靶向的基因的失活也已经开发铺平用于检查特定毒力基因的候选¹²的方式。

肺泡巨噬细胞以下内化， 贝氏复制到高号码的膜-结合的隔室中称为含液泡（CCV）的Coxiella-。该CCV需要主机内吞贩运日粗糙的早期和晚期内涵体，直到成熟为溶酶体衍生的细胞器^13。在这整个过程中，CCV获得，要么出现瞬时或保持与液泡相关联，包括但不限于，Rab5的，RAB7，CD63和^LAMP-1月13日至15日宿主因素。在宿主细胞内的贝氏复制完全依赖于一个全功能点/ ICM型IVB分泌系统^{（T4SS）8,16,17。}此分泌系统是祖先相关的共轭系统多蛋白质结构和跨越细菌和液泡膜提供细菌蛋白，称为效应，到宿主细胞质^18。在贝氏 T4SS在功能上非常相似的特点以及IVB型点/ ICM分泌嗜肺军团菌 ^19,20制度。有趣的是，不会发生T4SS和随后的效应易位激活直到贝氏达到酸性溶酶体衍生细胞器，大约8小时后感染^17,21。迄今为止，已有超过130点/ ICM效应已经确定^{9,17,22-24。}许多这些效应的宿主细胞内的贝氏在复制过程中可能发挥重要作用;然而，只有少数的效应已在功能上表征^25-29。

在这项研究中，我们利用依赖于通过在宿主细胞的细胞质内的β内酰胺酶的活性的CCF2-AM FRET底物（以下简称为BLAM基板）（ 图1）的裂解的基于荧光易位测定。感兴趣的基因融合到TEM-1上的报道质粒，提供组成型表达β内酰胺酶（BLAM）。的BLAM基板由两种荧光团（香豆素和荧光素），该形成FRET对。在荧光素和在不存在效应易位绿色荧光发射的FRET香豆素结果的激励;然而，如果该布拉M-效应融合蛋白易位到宿主胞质，所得β内酰胺酶活性裂解BLAM基板的β内酰胺环，分离FRET对生产下列激发的蓝色荧光发射。这种易位试验得到了证明作为一种方法，从各种不同的细胞内外的细菌，其中包括C.确定的效应蛋白burnetii，L.肺 ，L. longbeachae， 沙眼衣原体 ，肠致病性大肠杆菌 ， 沙门氏菌和布鲁氏菌 ^17,30-35。

为了确定对效应贝氏易位主机特定因素的作用下，我们采用了称为RNA干扰基因沉默一套行之有效的方法，特别是小干扰RNA（siRNA）。原本在秀丽隐杆线虫鉴定，RNA干扰是用于先天防卫厅一个保守的内源性细胞过程对病毒NSE以及基因调节^36,37。序列特异性的siRNA结合后，mRNA的降解通过RISC发生（RNA诱导的沉默复合物），导致特异性基因沉默或击倒^38。在这项研究中，将siRNA用于靶向两个主机的蛋白质，RAB5A和Rab7A，这是内吞途径的重要调节剂。沉默的效应易位RAB5A和Rab7A的影响是用C.确定burnetii pBlaM-CBU0077。 CBU0077被选定为它以前被证明由¹⁷ 贝氏的点/ ICM分泌系统易位。

同时利用siRNA的基因沉默和这里所描述的fluorescencebased易位检测，我们开始建立的效应蛋白通过在贝氏的易位宿主因素的作用。这种方法可以适用于宽范围的具有类似secretio细胞内和细胞外的细菌N个系统负责效应蛋白的易位。

研究方案

注:所有涉及贝氏柯克斯体 RSA439 NMII的生长或操作过程应在物理遏制二级实验室，并在遵守当地指南的生物安全柜中进行。下面描述的反向转染和易位试验工作流程的示意图示于图2。

1. C.制备burnetii文化表达CBU0077融合到β-内酰胺酶（pBlaM-CBU0077）（第1天）

1. 准备1X ACCM-2 ^6:
   1. 结合表1中列出的组分。调整用6M的NaOH pH至4.75和过滤消毒（不高压灭菌）。 ACCM-2是稳定储存在4℃下约三个星期。
2. C.生成burnetii pBlaM-CBU0077股票。
   1. 感染的HeLa细胞229与C. burnetii株携带pBlaM-CBU0077和通道，直到大vacuolES是在大多数细胞观察。
      1. 成长C. burnetii应变在5％CO _{2，2.5％O 2}的携带pBlaM-CBU0077在20ml ACCM-2含3微克/ ml氯霉素与7天排气帽的75cm ²的组织培养瓶中，在37℃。
      2. 离心机C. burnetii pBlaM-CBU0077培养以15,000×g下在室温下15分钟。
      3. 重悬在20毫升的DMEM + 10％胎牛血清（FCS）+3微克/毫升氯霉素（维持培养基）的颗粒。从50％汇合75cm ²的烧瓶的HeLa细胞229的取出介质。加入重悬C. burnetii到海拉细胞229。孵育2天，在37℃在5％CO _2，以允许的HeLa 229细胞的感染来建立。
      4. 单元格拆分为175厘米²组织培养瓶。
         1. 从75cm ²的烧瓶中除去介质和用10毫升的预温热的PBS洗单层两次。
         2. 加入1毫升邻˚F0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液，并发生细胞在37℃+ 5％CO ₂的3 - 5分钟以分离细胞。
         3. 重悬的细胞在10ml维持培养基的。加2ml重悬细胞到含38毫升维持培养基的175 cm ²的烧瓶中。
         4. 孵育在37℃下在5％CO ₂再3 - 5天，直到达到100％汇合和大液泡观察。
   2. 收集从175 ^平方厘米烧瓶上清液，加入10 mL的dh ₂ O以覆盖感染的HeLa 229细胞孵育15分钟，以裂解感染的细胞。
   3. 结合的上清液和溶解的细胞和沉淀，15,000×g下在室温下15分钟。
   4. 重悬在10毫升卫生署₂ O.颗粒裂解细胞进一步通过反复经过重新悬浮，通过附连到10ml的注射器的至少20倍23G针。粒料在500×g下5分钟以除去细胞碎片。
   <李>删除和沉淀上清液15,000× 克在室温下15分钟，收集C. burnetii。
   5. 重新暂停C. burnetii在DMEM + 10％FCS和量化细菌作为每4的数。稀释使用DMEM + 10％FCS + 10％二甲亚砜（DMSO）中，分装50μl的股成微量离心管并储存于-80℃1×10 ⁹的基因组/毫升。
3. 接种10毫升预热ACCM-2含3微克/ ml氯霉素的20微升℃。 burnetii pBlaM-CBU0077 ¹⁷株（从保存在-80℃下1.2生成库存量）与排气帽的25cm ²组织培养瓶。生长细菌培养7天，在37℃在5％CO _{2，2.5％ 的} O _2。

2的siRNA的反向转和HeLa的播种229细胞（第4天）

1. 当使用试验的siRNA首次准备所述siRNA如下:
   1. 短暂离心冻干的siRNA，以确保该siRNA沉淀在试管底部收集。
   2. 吹打1倍的siRNA缓冲液（ 表2）的适当体积再悬浮沉淀的siRNA至最终储存浓度为20μM。
   3. 吸取的溶液上下3 - 5次在RT在轨道混合器混合并进行30分钟，颠倒试管每5 - 10分钟。
   4. 短暂离心所述管，以确保该siRNA是在管的底部收集。
   5. 分装siRNA导入在微量离心管中并储存50微升等分在-20℃下直到需要。
   6. 要产生1μM工作的siRNA浓度，吸管950微升1X的siRNA缓冲到50微升等份的股票（20μM）必要时。注:此1μM工作浓度可冻融多次重复转染。
2. 放置DMEM + 10％FCS，0.05％胰蛋白酶-EDTA和PBS在37℃水浴（或等同物）30分钟，以在使用前预热。
3. 染组分的制备:
   注意:以下协议已经在黑壁平底，透明底96孔微孔板为海拉优化229细胞。转染试剂的量最优化，细胞接种的siRNA浓度和密度可能有必要对不同的细胞系。
   1. 对于每个孔，使用0.1微升转染试剂，15.9微升减少血清培养基（用于转染最小基本介质，请参阅材料表 ）和4微升1μM的siRNA（导致40纳米的最终的siRNA浓度）。使用OTP，PLK1，RAB5A和Rab7A独立的离心管。衡量一式三份每个检测条件。一个96孔板布局的一个例子示于图3。
      注:此协议包括使用两个控件:OTP和PLK1。 OTP是已经优化，减少脱靶效应，从而OTP用作负，非瞄准控制四台汇集的siRNA组成。加扰的siRNA也可以用作阴性对照。通过诱导促凋亡途径，因此，PLK1的siRNA被用作用于转染，其中细胞死亡关联到转染效率的阳性对照在广泛的细胞死亡，PLK1的表达的结果在许多细胞系中的损失。
      1. 每个实验的siRNA转染，在个体中离心管结合0.4微升转染试剂和63.6微升减少血清培养基。涡所有离心管并允许组件复为室温下5分钟。
      2. 16μl每个实验的siRNA添加到含有转染复合物的相应离心管。涡孵育在室温下20分钟。注意:不超过30分钟，这是重要的，因为转染效率将降低。
4. 在20分钟INCubation（2.3.1.2）添加转染试剂的20微升+降低血清培养基+混合的siRNA进入无菌黑色，扁平透明底96孔盘的适当的孔。
5. 只要20分钟孵育期结束后，种子的HeLa 229细胞以3.92×10 ³细胞/孔的密度。
   1. 收获的HeLa从汇合或亚汇合75cm ²的组织培养瓶229细胞在预热DMEM + 10％FCS和重新悬浮细胞以4.9×10 ⁴细胞/ ml的根据标准方法的最终密度。为了确保转染效率不受损害，在20分钟的潜伏期（2.3.1.2）准备细胞。
      1. 用10毫升的预温热的PBS洗涤HeLa细胞的单层229细胞两次。
      2. 加入1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液和地点的HeLa 229细胞，在37℃+ 5％CO ₂的3 - 5分钟以分离细胞。
      3. 收集细胞的9ml预热DMEM + 10％的FC的S.计数使用血球细胞和制备细胞使用DMEM + 10％FCS的4.9×10 ⁴细胞/ ml的终密度。
   2. 吸移管80微升的HeLa 229细胞以4.9×10 ⁴细胞/ ml的密度到包含转染试剂+还原血清培养基+的siRNA混合各孔中。这对应于3.92×10 ^3个细胞的细胞密度/孔。
      注:需要为布拉姆衬底背景减法。
      1. 不要添加细胞或siRNA以"空白"井（ 图3）。相反，添加80μl的DMEM + 10％FCS中的这些孔中，一式三份建立。
   3. 在37℃+ 5％CO ₂孵育24小时。

3.更改媒体（第五天）

1. 24小时后，取出使用连接到一个真空源或手动用多通道移液器多信道适配器介质，并用100微升新鲜prewarm的替换编DMEM + 10％FCS中。
2. 在37℃+ 5％CO ₂孵育另外48小时。
3. 在这一点上，检查细胞的存活率视觉上使用标准的光学显微镜。如果反向转染已经成功，显著细胞死亡将在含有PLK1 siRNA的孔观察相比OTP的siRNA。

使用qPCR 4. 贝氏柯克斯体 pBlaM-CBU0077应变的定量（第7天）

1. 后在5％CO _{2，2.5％O 2（1.3），}离心机10毫升C. 7天37℃生长在ACCM-2的burnetii pBlaM-CBU0077培养以15,000×g下在室温下15分钟。
2. 重悬在10ml预热的DMEM + 10％FCS中的细菌沉淀。准备1:10 1:100稀释使用DH ₂ O.文化（样品）
3. 建立起来用于定量PCR所需的组件。
   注意:可以提前执行的gDNA提取并储存在-20℃下UNT金正日要求。
   1. 标准的准备工作:
      1. 从在5％CO _{2，2.5％ 的} O ₂中ACCM-2在37℃下生长使用7天的gDNA提取试剂盒，按照制造商的说明贝氏柯克斯体 RSA439 NMII野生型菌株中提取基因组DNA。
      2. 测量在260吸光度使用NanoDrop（或同等学历）的基因组DNA浓度（g /微升）。
      3. 计算基因组拷贝的数目每微升使用以下以下公式，并转换为的基因组/毫升数。
         
      4. 在使用DH ₂ O一个新的离心管调节的基因组/毫升数到10 ⁹ /毫升（在100μl的最终体积）这可煮10分钟，直到需要在-20℃下储存。
      5. 在感染当天，生成10倍连续的10 ^8个基因组/毫升至10 ⁵基因组/毫升，从10 ⁹基因组稀释液S / ml的股票。
         1. 移取10微升⁹基因组/毫升到90微升的dh ₂ O的生成10 ⁸基因组/毫升。旋涡混合。移取10微升10 ⁸基因组/毫升到90微升的dh ₂ O的生成10 ⁷基因组/毫升。涡和重复，直到10 ⁵基因组/毫升。
   2. 建立qPCR实验。创建一个主结构25井占到任何移液误差。对于每个孔，使用10微升的qPCR预混; 2微升的ompA引物混合物（4.3.2.2）和3微升的dh ₂ O的
      注意:外膜蛋白A是C的外膜蛋白^burnetii'39和一个高度保守的区域内的82个碱基对部分被选择为用作探针如前面⁴⁰所描述。
      1. 设置每个标准（DH ₂ O，10 ^{5，10 6，10 7，10 8，10 9}基因组/毫升）和样品（1:10和1:100稀释）在96孔PCR分别撕离板（非裙）一式两份或一式三份。加入5微升样品或标准的到适当的孔中。
      2. 使用DH ₂ O稀释两者的ompA正向引物（5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3'）和OMPA反向引物（5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3'），以4μM的终浓度和结合到相同的离心管。
         注意: 的ompA引物混合物可以预先制备并且直到需要在-20℃下储存。
      3. 结合250微升定量PCR预混液，50微升的ompA引物混合，75微升卫生署₂ O和旋涡混匀。加入15微升该预混含有任何标准或样品井。
      4. 放置8盖的PCR条帽到PCR管，以确保所有被收集在管底部的适当的孔中和脉冲离心机。
      5. 设置以下程序的定量PCR马折角:50℃2分钟，95℃进行10分钟，接着为1秒45个循环的95℃和60℃20秒（ 图4A）。
   3. 分析从定量PCR的Ct（周期阈）值:
      1. 转移Ct值使用该程序的导出功能的电子表格。
      2. 通过对¹⁰⁹基 ​​因组/毫升（表示为log值）创建标准¹⁰⁵基因组/ ml的散点图。丢弃三份样品之间的任何明显的异常值。产生的对数的趋势线，并确定该图的方程。
      3. 通过使用在4.3.3.2所产生的方程计算样品中的基因组/毫升的总数。不要忘了占初始稀释:样品（1:10和1 100）。

5.逆向感染转染细胞（第7天）

1. 在C.计算总基因组/毫升后柏迪用于感染netii pBlaM-CBU0077培养，调整再悬浮细菌培养在300 MOI在50μl/孔用预热的DMEM + 10％FCS的终体积来感染细胞。
   注意:种子的HeLa 229细胞与后72小时的正常倍增时间的预期密度是3.136×10 ^4个细胞/孔。在300 MOI感染所需的细菌的量为9.408×10 ⁶在50μl，相当于1.88×10 ⁸细菌/毫升。
   1. 使用从定量PCR（基因组/毫升）计算值（4.3.3.3）的值，使用预热的DMEM + 10％FCS中以2毫升的最终体积来感染反向转染的细胞稀释再悬浮细菌。
2. 从空白删除现有的媒体和反向转染的细胞。
3. 加入50μl的稀释细菌（1.88×10 ⁸细菌/毫升）到适当的孔中。加入50微升DMEM + 10％FCS的这两个空白和uninfected井。
4. 在37℃+ 5％CO ₂孵育24小时。

6.增加布拉姆底物确定易位的水平（第8天）

1. 准备用于BLAM基板6倍加载溶液的解决方案。
   注:溶液A，B和C的布拉姆底物试剂盒（请参阅材料表 ）中提供。溶液B可以形成在RT沉淀。温热此溶液至37℃，使用前将沉淀应该溶解。
   1. 当使用第一次的试剂盒，添加DMSO中185微升（与BLAM底物试剂盒提供）到干燥的溶液A.接着，存储所述再悬浮溶液A在-20℃。
   2. 在-20准备在1毫升等分提前和存储0.1M的丙磺舒解决方案°C，直到需要。
      1. 准备0.4 M氢氧化钠（100毫升卫生署₂ O1.6克）。
      2. 制备的100mM磷酸钠缓冲液pH 8（1.56克的NaH ₂ PO ₄ .2H _{2 O 1.41克Na 2 HPO 4在100毫升卫生署2 O）。}
      3. 溶解1.25克丙磺舒的在22ml的0.4M的NaOH剧烈搅拌。
      4. 加22毫升100mM的磷酸钠缓冲液pH 8（溶液会变成混浊）并搅拌以溶解沉淀物形成。
      5. 调节pH至8（如果需要）使用1M的NaOH / HCl中。
      6. 剧烈搅拌和轻度发热（<50℃），直到解决方案主要是明确的。
      7. 过滤器（孔径0.2μm），并等分试样在1毫升体积。商店等分于-20℃。
2. 对于每个孔，使用0.06微升解决方案A，0.54微升B溶液，7.9微升C液和1.5微升0.1M的丙磺舒。首先在离心管相结合的解决方案A的1.8微升和16.2微升溶液B一起创建了30口井的主结构。拌匀，用旋涡。加入C液237微升和45微升0.1M的丙磺舒的。涡所有组合的直流电阻TS。
   注意:6×加载溶液是稳定长达4小时（在黑暗中），但应尽可能接近在使用前制备。
3. 加10μl的6倍样溶液直接进入所有的空白和反向转染井而不删除现有的媒体。
4. 孵育在室温在板在黑暗中2小时。
5. 为了确定易位的水平，用酶标仪量化荧光的量。
   注:以下步骤是特定于ClarioSTAR酶标仪。等效酶标仪也可以使用。
   1. 创建使用端点读数模式新的荧光强度的协议。
   2. 调整基本参数如下:
      1. 选择96孔微量。
      2. 在光学设置中，选择2 multichromatics具有以下用户定义的设置:（1）输入410-10纳米激发和520-10 nm发射。 （2）输入410-10 nm激发和450-10 nm发射。保证良好MULTichromatics被选中。
      3. 选择具有直径为3毫米的轨道平均。
      4. 在光纤中，选择底部光学元件。
      5. 在速度和精度，选择精确。这对应于每孔八个区域。
   3. 通过选择适当的孔中作为样本调整板布局。
   4. 选择开始测量。
   5. 拆下盖板，将托盘放入酶标仪。避免达到最大荧光值，确保增益值被调整。要做到这一点，就已经与OTP的siRNA被反向转染感染井之一进行增益调整。这对应于最高预期易位。
   6. 选择开始测量，测量使用荧光底所有适当的井在410纳米的激发和发射都450 nm和蓝色和绿色荧光520纳米，分别。

7.结果分析:

1. 计算比例的450纳米至520纳米（蓝绿色），对所有的样品下列空白减少，并表示相对于未感染的OTP样品。
   注意:提供一个简单的电子表格程序下面的分析步骤。
   1. 在酶标仪使用导出函数，转移为520纳米和450纳米的发射波长（6.5）到电子表格中获得的原始荧光值。
   2. 通过将原料520纳米的荧光值并通过井的数量除以计算"空白"读数（媒体只，无细胞）为520纳米波长的平均值（3）。重复使用空白450nm的波长的值。这些值表示背景荧光，由于96孔板和介质。
   3. 减去背景荧光。利用在7.1.2中获得的值从所有样品520nm处的荧光值中减去空白520纳米波长的平均值。重复的450纳米波长值。
   4. 要获得450:520纳米比使用空白修正值（7.1.3）。除以其对应的520纳米值每个样品450纳米荧光值。
   5. （从7.1.4）520纳米比率值和通过孔（3）的数量除以:通过添加450计算未感染的OTP比率值的平均值。
   6. 通过平均在7.1.5计算出的未感染的OTP比值在7.1.4计算520nm处比:通过将450计算相对于未感染的OTP样品的比例。

8.增加核染色的易位检测后确定细胞数（第8天）

1. 以下荧光的定量，取出含有使用连接到一个真空源或手动用多通道移液器多信道适配器所有孔中任一6×加载溶液介质。
2. 加入50微升4％PFA（多聚甲醛）解决方案在PBS所有适当的水井修复细胞。孵育在室温20分钟。
3. 除去4％PFA的PBS溶液（按照8.1）中，用75微升的PBS洗涤细胞两次。
4. 加入50μl的细胞可渗透核染色，例如DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基），每个孔中。获取图像用荧光显微镜和量化使用适当的图像分析软件，如ImageJ的⁴¹存在于每个细胞核siRNA处理后井的数量。

结果

对于这项研究中，C.被选定burnetii pBlaM-CBU0077菌株作为CBU0077先前已经证明是贝氏点/ ICM分泌系统¹⁷的易位效应。在感染前，的基因组/毫升在七天C.总数burnetii pBlaM-CBU0077培养，使用qPCR列举。 图4展示了循环阈值的一个例子来自标准和样品定量PCR如下预期（CT）的值。如在4.3.3中描述的Ct值（在扩增曲线（ ?...

讨论

分泌系统，以及细菌效应蛋白这些系统输送到宿主细胞的细胞质中，是许多致病性细菌利用独特复制壁龛内建立的感染的重要毒力的组成部分。许多研究小组的重点是研究细菌效应和宿主蛋白和宿主细胞通路的影响，这些效应都之间的相互作用。非常有限的研究，如果有的话，已研究了宿主蛋白是必要成功细菌效应易位的潜力。

在这项研究中，我们使用了专，细胞内病原体

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Citric acid	Sigma	C0759	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Calbiochem	442611	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Fisher	S93248	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852	ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone	BD	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	Fisher	BP1424	ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin	Sigma	C4555	ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax	ThermoFisher Scientific	61870-036	ACCM-2 medium component
Chloramphenicol	Sigma	C0378	For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)	Dharmacon	D-001810-10-05	Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool	Dharmacon	M-003290-01-005	Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool	Dharmacon	M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool	Dharmacon	M-010388-00-0005
5X siRNA buffer	Dharmacon	B-002000-UB-100	Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent	Dharmacon	T-2001-01	For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	51985-034	Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10567-014	For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)	Thermo Scientific	SH30071.03	Can use alternate equivalent product
DMSO	Sigma	D8418	For storage of Coxiella strain
PBS			For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA	ThermoFisher Scientific	25300-054	For cell culture
dH2O			For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep	ZYMO Research	D3007	Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Bioline	BIO-98020	Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM	Invitrogen	K1032	For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide	Merck	106469	Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic	Sigma	71505	Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate	Merck	106586	Probenicid solution component
Probenicid	Sigma	P8761	Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62251	Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS	Sigma	P6148	Fixing solution for HeLa 229 cells
25cm2 tissue culture flask with vented cap	Corning	430639	For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile	Corning	3603
75cm2 tissue culture flask with vented cap	Corning	430641	For growth of HeLa 229 cells
175cm2 tissue culture flask with vented cap	Corning	431080	For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer			For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates	4titude	4ti-0750/TA	For qPCR reaction
8-Lid chain, flat	Sarstedt	65.989.002	For qPCR reaction
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge	Eppendorf	5810 R	For pelleting bacterial culture
Nanodrop			For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine	Aligent Technologies	401456	For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader	BMG LabTech		For measurement of fluorescence