通过玻璃表面功能靶细胞提取方法

摘要

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

摘要

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

引言

当前台式细胞分离方法（ 如荧光活化细胞分选^1，激光捕获显微解剖^2，免疫磁珠分离^1）可能需要几个小时的准备和排序的。这些大的时间尺度可影响生理反应和表达水平，导致在不能代表生理反应³的分析。系统需要能够迅速和有效地分离出特定的细胞类型，而为了提高生物医学应用细胞分离和富集破坏细胞表面受体的水平。因此，我们的做法的理由是开发细胞分离温和的做法。

该"芯片实验室"的理念，提供更快的幅度（小时到分钟）细胞分离的订单的承诺，最经常涉及捕捉到细胞表面和释放细胞或细胞内的小故事通过物理^4,5 NTS或化学方法^6。虽然这些方法提供了一些优点，如鉴定蛋白质^7,8-表达，识别RNA表达^9-11，或甚至提供用于在体外培养^12,13细胞，许多这些技术不能被转换为诊断如细胞受体分析因到它们的非生理环境。酶促起重剂如胶原酶也可影响这些受体数量^14,15，这意味着使用这些起重剂不会产生准确的生理数据细胞受体定 ​​量技术。细胞裂解防止分化的原始表面受体之间，以及那些以前内在^16。本协议描述了细胞分离快速，轻柔的手法。

研究方案

1.清洁玻璃表面和试剂的准备

1. 放置一个玻璃表面在氧等离子体机，在50％的功率进行清洁5分钟。
2. 制作2.5毫升2-％重构（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，加入APTES 50微升并在锥形管2.45毫升乙醇中。

2. APTES和DSB功能化

1. 添加APTES溶液到表面。每孔吸取150微升8孔板。每孔移液器将100μl24孔板中。吸取1.1毫升60×15毫米的玻璃菜肴。覆盖表面，防止蒸发和APTES解决分配不均。放置在表面上的平台摇动器在室温下50分钟，它创建一个连APTES层的分布。
   注:APTES是形成表面的第一层的氨基硅烷。如果使用不同的表面，启发式决定的，以覆盖表面所需溶液的体积。
2. 选择用于烤箱的温度，而表面上的摇床:热至55℃2小时的8孔平板和24孔平板中。热玻璃只菜至90℃1小时。
3. 冲洗用乙醇的表面上。
   1. 辖的乙醇通过参考根据所用的表面上所需的量。添加150微升乙醇至每个孔8孔板中。添加125微升乙醇至每个孔24孔板中。加入1.1毫升乙醇玻璃菜肴。
   2. 通过排放和绘图从固定点的液体，如井的拐角冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。冲洗用乙醇两次。
      注意:如果任何玻璃底孔板的在其中有任何塑料，不加热它们高于65℃时，由于塑料会开始熔化和变形。
4. 干与来自罐分配100％的氮气。放置在表面的OVEN。
5. 通过在37.5微升二甲基亚砜（DMSO）的1.5毫克/毫升的DSB组合在2462.5制备2.5的d脱硫生物素（DSB）溶液中，和5毫克/毫升的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的0.1M的4-吗啉乙磺酸水合物（MES）（pH值为6）缓冲液的微升。然后结合这两种解决方案。
6. 加入1μl2-β巯基乙醇，15分钟后，在溶液中以骤冷DSB和EDC之间的反应。删除从烤箱功能化玻璃表面热APTES。等待5-10分钟的玻璃表面冷却。
7. 添加MES缓冲表面冲洗，使用基于表面上的金额。添加150微升的MES缓冲液，以每孔8孔板中。添加125微升的MES缓冲液，以每孔24孔板中。加入1.1毫升MES缓冲玻璃菜肴。
8. 通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向入面。冲洗更多的MES缓冲两次。
9. 申请所述DSB溶液到表面，以允许他们孵育。加入每孔150微升DSB解决方案8孔板。添加每孔100μl的DSB溶液中24孔板中。添加1.1毫升玻璃菜DSB解决方案。
10. 放置DSB覆盖玻璃表面上的培养皿内的湿纸巾。盖上盖子，在4℃冰箱孵育18-24小时。

3.链霉亲和功能化

1. 冲洗每个玻璃表面三次用1ml 1.0倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。稀释链亲和素（SAV）原液0.4毫克/毫升（推荐）。
   注:PBS等渗因此它可以用作用于稀释和冲洗的介质。 PBS被用作为SA的溶剂v和因此，不会影响到SAV的结合到表面的能力。
2. 均匀地涂0.4毫克/毫升的SAV溶液到表面，使得在玻璃的底部的形式的薄层，选择的溶液基于表面的量。对于8孔板，每孔加入150微升0.4毫克/毫升SAV解决方案。对于24孔板，每孔加入100微升0.4毫克/毫升SAV解决方案。对于玻璃菜，加1.1毫升0.4毫克/毫升SAV解决方案。
3. 覆盖和移动板到14厘米培养皿中保持水分。孵育在冰箱培养皿18-24小时。
   注:重要的是要利用每一个表面上的APTES，DSB和SAV一致卷。
4. 冲洗每个玻璃表面用150微升的PBS三次以除去SAV。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。
5. 湿纸巾W¯¯第i个去离子水，并放置在纸巾平在围绕板中的孔中，以保持水分14厘米培养皿。覆盖包含井培养皿。直到需要孵化培养皿在4℃生物安全水平1（BSL-1）的冰箱。

4.细胞捕获和释放

1. 开始与旨在用于实验的细胞T175烧瓶（多个）。从烧瓶（多个）吸媒体。洗出剩余介质用5ml室温PBS中。抽吸PBS从烧瓶（多个）。
2. 加入10 mL的非酶起重剂，如细胞解离溶液，对细胞的T-175烧瓶中。把该烧瓶在孵化6分钟，以允许从烧瓶的细胞的升降。
3. 6分钟后，加入10毫升冷汉克的平衡盐溶液（HBSS;见材料清单）灭活解除代理。取出20微升细胞计数使用血细胞计数器细胞在溶液中的数量。
   注:根据FUNCtionalized在捕获实验中所用的表面，所需的细胞数量不同而不同。对于官能8孔板，使用每孔30万细胞。对于功能化玻璃餐具，使用110万细胞。对于官能化24孔板，推荐125000细胞。对细胞计数的更多信息补充协议中找到。
4. 重复步骤4.1- 4.3为细胞另一个烧瓶中，如果较少的细胞存在比需要的实验。结合细胞悬浮液和验票细胞获得在溶液中的细胞总数。
5. 降速细胞悬浮液在离心机中，在500×g离心5分钟，在4℃以获得浓缩的细胞的沉淀。找到的HBSS适量添加到细胞悬浮液以获得每毫升1×10 ^6个细胞的浓度，然后从纺丝向下细胞吸出上清液，并添加计算量。这个体积可使用在补充的公式计算。
6. 移液器上下（磨碎）重悬日E细胞在溶液中并且降低的解决方案，可以减少抗体结合的细胞聚集。拆分移动解决方案到独立的控制和实验方案。查看组件和计算补充文件。
7. 添加生物素化的抗体在补充文件描述的各个小区的解决方案。在4℃孵育30分钟上的端过端混频器。
   注:对于MCF7GFP细胞，0.5毫克/毫升hIgG或0.5毫克/毫升HLA-ABC抗体建议。对于RAW巨噬细胞，1毫克/毫升mCD11b以一半体积推荐占稀释差异。对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC），0.5毫克/推荐毫升hCD31。
8. 用HBSS洗官能玻璃表面。对于这个实验中，一个8孔板被劝告。
   1. 添加150微升HBSS至每个孔8孔板中。用HBSS清洗两次。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。冷保存在4℃。
9. 添加细胞溶液至孔，等待45分钟的细胞上的振动筛冰上孵育。通过使用如在补充所述计算的体积使得在无菌HBSS生物素的溶液中。
10. 通过使用HBSS除去从玻璃井细胞溶液。
    1. 轻轻吸取150微升HBSS到每个孔中。然后吸取了HBSS。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。
    2. 重复两次以上。清洗后，加入HBSS到孔，以保持湿润的细胞。
11. 加入150微升20毫米生物素溶液各有关释放好，然后等待20分钟，以便反应。
12. 回忆非特异性结合的细胞如上所述S按用HBSS洗涤，然后如果使用荧光标记的细胞，进行荧光图像的细胞。此外，在一烧瓶图像活细胞（作为对照，以与孔中的细胞比较）。如果使用绿色荧光蛋白（GFP）转染的细胞中，激励将470纳米，和发射将515纳米。

5.抗体优化:抗体滴定

1. 通过解除从T75或T175烧瓶中的细胞作为在步骤4.1- 4.3解释开始。
   注意:这些卷校准24孔板，但可以改变，以适应通过启发式检测任何玻璃官能表面。代表性抗体滴定如图1所示。
2. 算使用血细胞计数器细胞，然后在500 xg离心在4℃下降速细胞溶液中的圆锥形管5分钟。重组细胞每毫升1-百万细胞，使用在补充所述的计算。
3. 拆分1米100万年细胞每毫升溶液注入500微升在不同离心管的抗体（抗体）溶液六个不同的解决方案。
   1. 稀释抗体原液至10微克/毫升，1微克/毫升，100纳克/毫升，10纳克/毫升，1毫微克/毫升。通过使用100微升染色缓冲液（PBS + 1％叠氮化钠+ 1％BSA）中，并加入500μl的细胞与没有抗体在它的控制创建控件。对于空白对照（无Ab和无细胞），使用300微升的PBS中的溶液。
      注意:注意:叠氮化钠是剧毒，易爆，并格外小心，必须使用时服用。请参考材料安全数据表（MSDS），并使用适当的安全设备。
4. 结合，并在4℃下孵育，在最终过端混合器的电池溶液的抗体溶液30分钟。冲洗用HBSS三次官能24孔板中。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的拐角冲洗表面。按住PI佩特以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。
5. 分装125微升每种样品溶液到相应的APTES，DSB和SAV功能化的很好。孵育在4℃下或在冰上在玻璃表面上45分钟。用HBSS冲洗表面三次以除去非特异性附着的细胞。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。不要冲洗底部的行，因为这些是对照。
6. 添加150微升的HBSS每个充分洗涤后，把24孔平板在冰上，然后用读板器测量GFP细胞（励磁485纳米/发射528纳米）的荧光。

6.单元优化:细胞滴定

1. 提起细胞步骤4.1 -4.3提及。
2. 算使用血细胞计数器细胞。降速细胞等等lution在500×g离心5分钟，锥形管在4℃下。重组细胞每毫升1-百万个细胞。
   注:更多关于使用血细胞计数器的信息可以在补充协议中找到。
3. 吸取从锥形管的160万股票的细胞和地点细胞溶液1.6毫升。从锥形管800,000细胞股票和地点细胞溶液吸取800微升细胞。吸管从细胞股票80微升了在锥形管80,000个细胞股票和地点。移液器从8000细胞股票和地点细胞股票8微升的锥形管。
   注:浓度是每8孔板测量给出，根据需要进行复制。板输出的一例示于图2。
4. 采取四种储备液，并在4℃下以500 xg离心在离心机中旋转5分钟。重新暂停所有股票的解决方案，400微升HBSS的。
5. 加入1.6微升100毫微克/毫升抗体，以1.6亿的股票，0.8μl至80万细胞原液，0.5微升到所有其他股票。温育30分钟，抗体在最终过端混合器在4℃，30分钟。洗用HBSS三倍官能玻璃表面。
   注:建议显微镜定量的官能8孔板，同时建议酶标仪定量功能化的24孔板。对于8000细胞库存抗体浓度没有降低，以允许捕获表面的限制因素，以不缺乏溶液抗体，而是表面的捕获性能。
6. 应用150微升样品溶液的各孔中。应用160万细胞库存到孔在左边的第一列。申请800,000细胞库存从左侧的第二列。申请80,000细胞库存从左侧第三列。最后套用8000细胞股票的最后一列。在4℃下孵育45分钟的摇动。
   注:160万细胞库存作为待测试的最高浓度，并且是通常用于细胞分离的实验（每孔600,000个单元格）800,000细胞库存用作实验中的控制，因为它是在典型的蜂窝浓度细胞的双重量即在细胞分离实验中使用的（每孔3000000细胞）。 80000细胞库存用作稀释10倍，以测试较低浓度为蜂窝捕获（每孔30,000个细胞）。 8000细胞库存用作百倍稀释到作为测试来检查细胞的分离的下限（每孔3000个细胞）。
7. 用HBSS三次冲洗。通过排放和绘图从固定点的液体，如井的角落冲洗表面。握住吸管以大约70°角，以便尖端不直接指向到表面。收集所有的洗涤。
8. 图象上荧光显微镜的细胞，如果使用8孔板，取各拍照河畔面，并在4℃下在摇动器应用150微升生物素以每面为一小时。一小时后，冲洗生物素释放孔用HBSS 3倍之前。收集井全部用于洗涤与血球和图像释放井计数。
9. 应用150微升的20mM过量的生物素的溶液，以适当的生物素释放孔1小时，如果使用24孔板，然后用HBSS冲洗这些油井的3倍。定量用酶标仪24孔板中。使用血球到所有收集以及洗涤细胞计数。

7.图像分析

注意:斐济软件包（http://fiji.sc/Fiji）被推荐用于图像分析。最初，图像转换成灰度图像，然后将该亮度/对比度改变为带出的细胞。

1. 加载图像，并转换通过单击图像选项卡，然后向下滚动到"类型"，然后单击灰度4，8位"。
2. 通过单击图像选项卡，然后滚动到"调整"增加图像的对比度。点击"亮度和对比度"，然后使用滚动条，使细胞中脱颖而出。如果使用荧光图像，反转图像，使更多的定义的细胞。
3. 加载插件ImageJ的上称为ITCN（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html）来分析图像。
4. 打开ITCN。当出现一个对话框，提示与多个参数的用户估计单元的尺寸，第一组感兴趣的细胞的最小宽度。如果图像是荧光灯和将细胞变暗点击"检测暗峰"选项。
5. 初始设定为2的阈值，然后打"计数"按钮。画面的一个新版本的计会出现红点划定在哪里细胞已被计算在内。
6. 调整阈值和宽度参数度日defini更准确的蜂窝数据纳克"小区"的大小。注意:计算将在右边的对话框细胞的数目。更改参数将给予不同数量的计数的细胞。
7. 继续通过阈值和宽度参数，直至达到对细胞数目的良好估计迭代。

结果

使用该协议，我们表明细胞捕获（ 图3A）和MCF7GFP细胞的细胞释放（ 图3C）以及活细胞对照（ 图4）。我们量化的细胞捕获为60％和80％被释放（ 图3C）。当我们扩展这种方法的RAW 264.7巨噬细胞和MCF7GFP细胞的混合物，RAW巨噬细胞的50％被捕获（ 图3D）和RAW巨噬细胞有80％是释放用20mM生物素（ 图3B）。...

讨论

在细胞分离技术的进步，进一步加强结构与功能的关系科学的研究在神经科学^18，遏制再生生物学血管生物学¹⁹单元编程和血管生成的信号。事实上，原代细胞培养^20（ 例如 ，内皮细胞）在血管生物学主要通过使用细胞分离技术进行。细胞分离最近还被用于细胞膜受体^{3,14,15,19,21}定量流量（qFlow）仪分析。但是，现有的细胞分离方法，影响细胞表面受体的水平...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Acros Organics	919-30-2	Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico	Diener	Model 1	Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)	Sigma	D20655	Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	British Drug Houses (BDH)	BDH1115-1LP	Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Thermo-Scientific	5g: 22980 25g: 22981	Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide	BD Falcon	Case of 24: 354118 Case of 96: 354108	Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates	MatTek	P24G-0-13-F	Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol	Science Lab	60-24-2	Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%)	Fisher Scientific	AC172590250	Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven	Thermo Scientific	11-475-153	Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker	Heidolph	13-889-420	Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]	Proteo Chem	9013-20-1	Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish	Fisher Scientific	08748A	Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover	Sigma-Aldrich	Z717231	Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells	Cell Biolabs	AKR211	Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages	ATCC	TIB-71	Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE	Life Technologies	12605036	Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	50003PC	Supplier: Corning
Nonessential amino acids	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	25-025-CI	Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper	Fisher Scientific	12-565-58	Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution	Corning	MT-25-056CI	Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer	Hausser	02-671-54	Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin	Amresco	58-85-5	Used to release cells from surface.
HBSS	Created from Recipe	N/A	Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody	BioLegend	311402	Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody	BioLegend	HP6017	Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells	Cell Biolabs	AKR-211	Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals	Thermo-Scientific	15mL: 12-565-268	50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)	Fisher Scientific	05-450-127	Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)	Zeiss	N/A	Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns	Thermo-Scientific	PI-87770	Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit	Thermo- Scientific		Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader	BioTek	Synergy HTX Multimode Reader	Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.