Un método de aislamiento de células reconocidas a través del vidrio funcionalización de la superficie

Resumen

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Resumen

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

Introducción

De sobremesa enfoques actuales de separación de células (por ejemplo, de células activada por fluorescencia ^1, captura por láser micro-disección ^2, inmuno-magnética separación del grano ¹⁾ puede tomar varias horas de preparación y de clasificación. Estas grandes escalas de tiempo pueden afectar los niveles de respuesta y fisiológicos de expresión, lo que resulta en análisis que no son representativos de la respuesta fisiológica ^3. Sistemas que se necesitan rápida y eficiente puede aislar determinados tipos de células sin interrumpir los receptores de los niveles de la superficie celular con el fin de mejorar el aislamiento de células y el enriquecimiento para aplicaciones biomédicas. Por lo tanto, la razón de nuestro enfoque es el desarrollo de un enfoque suave para el aislamiento de células.

El "laboratorio en un chip" concepto ofrece la promesa de órdenes de magnitud más rápido aislamiento de células (horas-minutos-a), y con mayor frecuencia implica la captura de células sobre una superficie y células o conte intracelular liberaciónn id a través física ^4,5 o ⁶ métodos químicos. Aunque estos enfoques ofrecen algunas ventajas tales como la identificación de la expresión de proteína ^7,8, la identificación de la expresión del ARN ^9-11, o incluso proporcionar células para el cultivo in vitro ^12,13, muchas de estas técnicas no pueden ser traducidos a los diagnósticos, tales como perfiles de receptor de la célula debido a sus entornos no fisiológicas. Agentes de elevación enzimáticos tales como colagenasas también pueden afectar a los receptores de estas cantidades, es decir, ^14,15 técnicas de cuantificación del receptor de células que usan estos agentes de elevación no generará datos fisiológicos precisos. Lisis celular previene la diferenciación entre los receptores de la superficie nativas, y las que se internaliza previamente ^16. Este protocolo describe un enfoque rápido y suave para el aislamiento de células.

Protocolo

1. Limpieza de la superficie del vidrio y Preparación de Reactivos

1. Colocar una superficie de vidrio en una máquina de plasma de oxígeno durante 5 minutos a 50% de potencia para limpiarlo.
2. Preparar 2,5 ml 2% reconstituido (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) solución, mediante la adición de 50 l de APTES y 2,45 ml de etanol en un tubo cónico.

2. APTES y funcionalización OSD

1. Añadir solución APTES a las superficies. Pipetear 150 l por pocillo para placas de 8 pocillos. Pipeta 100 l por pocillo de placas de 24 pocillos. Pipetear 1,1 ml de platos de cristal de 60 x 15 mm. Cubrir las superficies para evitar la evaporación y la distribución desigual de la solución APTES. Colocar las superficies en un agitador de plataforma durante 50 min a temperatura ambiente, lo que crea una distribución uniforme de la capa de APTES.
   NOTA: APTES es un aminosilano que forma la primera capa de la superficie. Si se utiliza una superficie diferente, heurísticamente determinar el volumen de solución necesario para cubrir la superficie.
2. Seleccione la temperatura para el horno, mientras que las superficies están en el agitador: Calentar a 55 ° C durante 2 h para las placas 8 pocillos y placas de 24 pocillos. vidrio de calor sólo platos a 90 ° C durante 1 hora.
3. Enjuague las superficies con etanol.
   1. Administrar la cantidad de etanol requerida haciendo referencia basado en la superficie utilizada. Añadir 150 l de etanol a cada pocillo para placas de 8 pocillos. Añadir 125 l de etanol a cada pocillo para placas de 24 pocillos. Añadir 1,1 ml de etanol para los platos de vidrio.
   2. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Enjuague dos veces más el uso de etanol.
      NOTA: Si cualquiera de los pocillos con fondo de cristal tienen cualquier plástico en ellos, no calentarlos por encima de 65 ° C, ya que el plástico que comenzará a derretirse y la deformación.
4. Secar con gas 100% de nitrógeno dispensado desde un tanque. Coloque las superficies de la juntaVen.
5. Preparar 2,5 ml de la solución de d-destiobiotina (DSB) mediante la combinación de 1,5 mg / ml OSD en 37,5 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO), y 5 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) en 2462.5 l de la (6 pH) tampón de hidrato de ácido 4-morfolinoetanosulfónico M 0,1 (MES). A continuación, combinar ambas soluciones.
6. Añadir 1 l de mercaptoetanol 2-β, después de 15 min, en la solución para detener la reacción entre DSB y EDC. Retire APTES calientes funcionalizados superficies de vidrio del horno. Espere 5-10 minutos para las superficies de vidrio se enfríe.
7. Añadir tampón MES la superficie para enjuagar, el uso de cantidades en base a la superficie. Añadir 150 ml de tampón MES a cada pocillo para placas de 8 pocillos. Añadir 125 l de tampón MES a cada pocillo para placas de 24 pocillos. Añadir 1,1 ml de tampón MES para los platos de cristal.
8. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamenteen la superficie. Enjuague dos veces más con tampón MES.
9. Aplicar la solución OSD a las superficies para que puedan incubar. Añadir 150 solución OSD l por pocillo para placas de 8 pocillos. Añadir una solución de 100 OSD l por pocillo de placas de 24 pocillos. Añadir 1,1 ml de solución de vidrio platos OSD.
10. Coloque las superficies de vidrio OSD cubiertos sobre una toalla de papel húmeda en el interior de una caja de Petri. Cubrir e incubar en una nevera C 4 ° durante 18-24 horas.

3. La funcionalización estreptavidina

1. Enjuague cada superficie de vidrio tres veces con 1 ml de 1,0x salina tamponada con fosfato (PBS). Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Diluir la solución de estreptavidina (SAV) stock a 0,4 mg / ml (recomendado).
   NOTA: PBS es isotónica para que pueda ser utilizado como un medio para la dilución y lavado. PBS se usa como un disolvente para el SAv, y por lo tanto, no afectará a la capacidad de la SAV a unirse a la superficie.
2. Aplicar 0,4 mg / ml de solución de SAv de manera uniforme a las superficies de manera que una capa delgada de formas en la parte inferior de la copa, seleccionar la cantidad de solución basada en la superficie. Para placas de 8 pocillos, añadir solución SAv 150 l 0,4 mg / ml por pocillo. Para placas de 24 pocillos, añadir solución SAv 100 l 0,4 mg / ml por pocillo. Para los platos de vidrio, añadir solución Sav / ml 1,1 ml 0,4 mg.
3. Tapar y mover las placas a una placa de Petri de 14 cm para retener la humedad. Incubar la placa de Petri en el refrigerador durante 18-24 horas.
   NOTA: Es esencial utilizar volúmenes consistentes de APTES, OSD, y sav en cada superficie.
4. Enjuague cada superficie de vidrio tres veces con 150 ml de PBS para eliminar SAv. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie.
5. Moje una toalla de papel wITH agua desionizada y coloque la toalla de papel plana en 14 cm placa de Petri que rodea las placas para retener la humedad en los pocillos. Cubrir la placa de Petri que contiene los pozos. Incubar la placa de Petri en el nivel 1 (BSL-1) refrigerador 4 ° C hasta que se necesite Bioseguridad.

4. Captura y liberación de la célula

1. Comience con el frasco (s) T175 de células destinados para el experimento. Aspirar los medios de comunicación del frasco (s). Lave el resto del soporte con 5 ml de PBS temperatura ambiente. Aspirar PBS del matraz (s).
2. Añadir 10 ml de agente de elevación no enzimática, tales como la célula de disociación de soluciones, en el matraz T-175 de las células. Poner el matraz en la incubadora durante 6 minutos para permitir la elevación de las células del matraz.
3. Después de 6 minutos, añadir 10 ml de solución salina equilibrada de Hank fría (HBSS; Ver Lista de Materiales) para inactivar el agente de elevación. Sacar 20 l de células para contar el número de células en solución utilizando un hemacitómetro.
   NOTA: Dependiendo de la funcsuperficies utilizadas en el experimento de captura de titucionalizado, el número de células necesario varía. Para funcionalizados 8 placas de pocillos, utilice 300.000 células por pocillo. Para los platos de vidrio funcionalizadas, utilizar 1,1 millones de células. Para funcionalizados placas de 24 pocillos, se recomienda a 125.000 células. Más información sobre el recuento de células se encuentra en el Suplemento.
4. Repetir los pasos 4.1- 4.3 para otro matraz de células, si un menor número de células están presentes de lo necesario para el experimento. Combinar las suspensiones de células y células de recuento para obtener el número total de células en solución.
5. Centrifugar la suspensión de células en una centrífuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para obtener un pellet de las células concentradas. Encontrar la cantidad apropiada de HBSS para añadir a la suspensión celular para obtener una concentración de 1 x 10 ⁶ células por ml, a continuación, aspirar el sobrenadante de las células se centrifugaron, y añadir el volumen calculado. Este volumen se puede calcular utilizando las ecuaciones presentadas en el suplemento.
6. Pipeta hacia arriba y abajo (triturado) para volver a suspender THcélulas correos en solución y esto reduce la agregación celular en una solución que puede reducir la unión del anticuerpo. Dividir la solución celular en el control separado y soluciones experimentales. Ver el fichero suplementario para componentes y cálculos.
7. Añadir los anticuerpos con biotina a las respectivas soluciones celulares como se describe en el archivo suplementario. Incubar durante 30 minutos a 4 ° C en un mezclador extremo sobre-fin.
   NOTA: Para las células MCF7GFP, 0,5 mg / ml o anticuerpos hIgG / ml HLA-ABC 0,5 mg se recomiendan. Para los macrófagos RAW, se recomienda 1 mg / ml mCD11b a la mitad del volumen para dar cuenta de las diferencias de dilución. Para las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), 0,5 mg / ml se recomienda hCD31.
8. Lavar la superficie de vidrio funcionalizada con HBSS. Para este experimento, se aconseja una placa 8 también.
   1. Añadir 150 l HBSS a cada pocillo para placas de 8 pocillos. Enjuague dos veces más con HBSS. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo.Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Mantener frío a 4 ° C.
9. Añadir las soluciones de células a los pocillos y esperar 45 minutos para que las células se incuban en hielo en el agitador. Hacer que la solución de biotina en HBSS estéril mediante el uso de volúmenes calculados como se describe en el Suplemento.
10. Retire la solución de células de los pozos de vidrio mediante el uso de HBSS.
    1. pipetear suavemente 150 l HBSS en cada pocillo. A continuación pipetear el HBSS. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie.
    2. Repetir dos veces más. Después del lavado, añadir HBSS a los pocillos para mantener las células en húmedo.
11. Añadir 150 ml de solución de biotina 20 mM a cada versión respectiva bien, y luego esperar 20 minutos para permitir la reacción.
12. Se acuerden de células no específicamente unidos de un lavado con HBSS como se ha dicho, y luego, si el uso de células marcadas con fluorescencia, proceder a la fluorescencia de imagen de las células. También las células vivas de la imagen en un frasco (como control, para comparar con las células en el pozo). Si el uso de células transfectadas proteína fluorescente verde (GFP), la excitación será 470 nm, y la emisión será 515 nm.

5. Anticuerpo Optimización: Titulación de anticuerpos

1. Empezar por el levantamiento de las células de la T75 o T175 matraz como se explica en el paso 4.1- 4.3.
   NOTA: Estos volúmenes están calibrados para placas de 24 pocillos, pero se pueden cambiar para adaptarse a cualquier superficie de vidrio funcionalizada a través de pruebas heurístico. Una valoración de anticuerpos representativo se muestra en la Figura 1.
2. Recuento de células utilizando el hemocitómetro, y luego girar hacia abajo la solución de células en un tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir las células de 1 millón de células por ml, usando los cálculos descritos en el Suplemento.
3. Dividir el 1 mcélulas illones por ml de solución en seis soluciones diferentes de 500 l en diferentes tubos de centrífuga para el anticuerpo (Ab) soluciones.
   1. Diluir la solución de anticuerpo de stock a 10 mg / ml, 1 g / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Crear los controles mediante el uso de 100 l de la mancha de Buffer (PBS + 1% de azida de sodio + 1% de BSA), y 500 l de células para el control sin Ab en ella. Para el blanco de control (n Ab y sin células), utilizan una solución de 300 l de PBS.
      NOTA: ATENCIÓN: La azida sódica es extremadamente tóxico, explosivo, y un cuidado extremo se debe tomar cuando se la usa. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) y utilizar el equipo de seguridad apropiado.
4. Combinar e incubar las soluciones Ab con las soluciones de células en el mezclador de extremo sobre extremo a 4 ° C durante 30 min. Enjuagar las placas de 24 pocillos funcionalizados con HBSS tres veces. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantenga la pipette en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie.
5. Alícuotas de 125 l de cada solución de muestra en las APTES apropiadas, OSD, y Sav funcionalizados también. Se incuba a 4 ° C o en hielo durante 45 min sobre la superficie de vidrio. Enjuague la superficie con HBSS tres veces para eliminar las células unidas no específicamente. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. No se enjuague la fila inferior, ya que esos son los controles.
6. Añadir 150 ml de HBSS a cada lavó bien, poner las placas de 24 pocillos en hielo, y luego usar un lector de placas para medir la fluorescencia de las células GFP (excitación 485 nm / emisión 528 nm).

6. Optimización de la célula: Titulación Celular

1. Levante las células como se ha mencionado en los pasos 4.1 -4.3.
2. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar las células de modolución en tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir las células a 1 millón de células por ml.
   NOTA: Más información sobre el uso de la hemocitómetro se puede encontrar en el suplemento.
3. Pipetear 1,6 ml de la solución de células para la población de 1,6 millones de células y colocar en un tubo cónico. Pipetear 800 l de células a partir de la solución de células para la población de 800.000 células y colocar en un tubo cónico. Pipeta de 80 l de la población de células de la población de 80.000 células y colocar en un tubo cónico. Pipeta de 8 l de la población celular de 8.000 células de valores y colocar en un tubo cónico.
   NOTA: Las concentraciones se dan por 8 mediciones de placa así, repetir según sea necesario. Un ejemplo de salida de la placa se muestra en la Figura 2.
4. Tome las cuatro soluciones madre y girar en una centrífuga a 500 g durante 5 min a 4 ° C. Vuelva a suspender todas las soluciones madre en 400 l de HBSS.
5. Añadir 1,6 l de 100 ng de anticuerpo / ml al stock 1.600.000 celular, 0,8 μl al stock de 800.000 células, y 0,5 l a todas las demás poblaciones. Incubar el anticuerpo durante 30 minutos en el mezclador de extremo sobre extremo durante 30 minutos a 4 ° C. Lavar la superficie de vidrio funcionalizada con HBSS tres veces.
   NOTA: Se recomienda que la placa de 8 funcionalizado para la cuantificación de microscopía, mientras que se recomienda la placa así funcionalizado 24 para lector de placas de cuantificación. La concentración de anticuerpo de 8.000 celular stock no se redujo para permitir que el factor limitante de la superficie de captura a no ser la falta de anticuerpos en solución, sino más bien las propiedades de captura de la superficie.
6. Aplicar 150 l de las soluciones de muestra a cada pocillo. Aplicar la población de 1,6 millones de células a la primera columna de pocillos de la izquierda. Aplicar la población de 800.000 celda a la segunda columna de la izquierda. Aplicar la población de 80.000 células a la tercera columna desde la izquierda. Finalmente aplicar la acción de 8.000 celda a la última columna. Incubar durante 45 minutos a 4 ° C en el agitador.
   NOTA: El 1,6 millonescelular stock sirve como la mayor concentración a ensayar, y es el doble de la cantidad de células que se utiliza típicamente en los experimentos de separación celular (600.000 células por pocillo) El stock de 800.000 células sirve como control para el experimento, ya que es la concentración celular típica que se utiliza en los experimentos de separación celular (3.000.000 de células por pocillo). El stock de 80.000 células sirve como una dilución de diez veces para la prueba de concentraciones más bajas para la captura celular (30.000 células por pocillo). El stock de 8.000 celular sirve como una dilución centenar de veces que se utiliza como una prueba para comprobar el límite inferior de la separación celular (3.000 células por pocillo).
7. Enjuague con HBSS tres veces. Enjuague la superficie mediante la descarga y el dibujo del líquido desde un punto fijo, como la esquina del pozo. Mantener la pipeta en un ángulo de 70 ° para que la punta no está orientado directamente en la superficie. Recoger todos los lavados.
8. Imagen de las células en un microscopio de fluorescencia, si se utilizan placas 8, así, tomar fotos de cada uno surcara, y se aplica biotina 150 l a cada superficie durante una hora a 4 ° C en el agitador. Después de una hora, enjuague pozos de liberación de biotina con HBSS 3 veces como antes. Recoger todos los lavados de los pozos para contar con el hemocitómetro y la imagen de los pozos de liberación.
9. Aplicar 150 l de solución de biotina exceso de 20 mM a los pocillos apropiados de liberación de biotina durante 1 hora, si el uso de placas de 24 pocillos, y luego enjuague aquellos pocillos 3 veces con HBSS. Cuantificar placas de 24 pocillos utilizando un lector de placas. Utilice un hemacitómetro para contar las células de todos los lavados así recogidos.

Análisis 7. Imagen

Nota: Se recomienda el paquete de software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para el análisis de imágenes. Inicialmente, las imágenes se convirtieron en la imagen en escala de grises, y luego el brillo / contraste se modificó para permitir llevar a cabo las células.

1. Cargar la imagen, y convertir a escala de grises haciendo clic en la pestaña de la imagen a continuación, desplazarse hacia abajo para "Tipo" y luego haciendo clic4; 8 bit ".
2. Aumentar el contraste de la imagen haciendo clic en la pestaña de imagen y luego desplazarse a "Ajuste". Haga clic en "Brillo y contraste", y luego usar las barras de desplazamiento para hacer que las células se destacan. Si el uso de imágenes de fluorescencia, invertir las imágenes para que las células sean más definidos.
3. Cargar un plugin en ImageJ llama ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) para analizar las imágenes.
4. Abrir ITCN. Cuando aparezca un cuadro de diálogo que pide al usuario con varios parámetros para estimar el tamaño de la celda, establecer el ancho mínimo de la primera célula de interés. Haga clic en la opción "Detectar picos oscuros" si la imagen es fluorescente y se oscurecen las células.
5. Establecer el valor umbral en el 2 al principio, y luego pulsa el botón "Count". Una versión recién contado de la imagen aparecerá con puntos rojos que delimitan donde se han contado las células.
6. Ajustar el parámetro de umbral y el ancho para obtener datos más precisos celulares por defining del tamaño de una "célula". Nota: El número de células contadas estará en un cuadro de diálogo de la derecha. Modificación de los parámetros darán diferente número de células contadas.
7. Continuar para recorrer los parámetros de umbral y de anchura hasta que se alcanza una buena estimación para el número de células.

Resultados

El uso de este protocolo se muestra la captura de células (Figura 3A) y la liberación de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, así como controles de células vivas (Figura 4). Se cuantificó la captura de células en un 60% y el 80% fueron puestos en libertad (Figura 3C). Cuando nos extendió este enfoque a una mezcla de RAW 264.7 macrófagos y células MCF7GFP, 50% de los macrófagos RAW fueron capturados

Discusión

Las mejoras en las técnicas de aislamiento de células promueve estudios científicos en las relaciones estructura-función en la neurociencia ^18, la programación celular en biología regenerativa, y la señalización angiogénica en la biología vascular ^{19 de} vástago. De hecho, cultivo celular primario ²⁰ (por ejemplo, HUVECs) en biología vascular se realiza principalmente a través del uso de técnicas de aislamiento de células. Aislamiento de células también fue utili...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Acros Organics	919-30-2	Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico	Diener	Model 1	Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)	Sigma	D20655	Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	British Drug Houses (BDH)	BDH1115-1LP	Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Thermo-Scientific	5g: 22980 25g: 22981	Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide	BD Falcon	Case of 24: 354118 Case of 96: 354108	Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates	MatTek	P24G-0-13-F	Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol	Science Lab	60-24-2	Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%)	Fisher Scientific	AC172590250	Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven	Thermo Scientific	11-475-153	Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker	Heidolph	13-889-420	Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]	Proteo Chem	9013-20-1	Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish	Fisher Scientific	08748A	Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover	Sigma-Aldrich	Z717231	Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells	Cell Biolabs	AKR211	Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages	ATCC	TIB-71	Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE	Life Technologies	12605036	Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	50003PC	Supplier: Corning
Nonessential amino acids	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	25-025-CI	Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper	Fisher Scientific	12-565-58	Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution	Corning	MT-25-056CI	Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer	Hausser	02-671-54	Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin	Amresco	58-85-5	Used to release cells from surface.
HBSS	Created from Recipe	N/A	Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody	BioLegend	311402	Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody	BioLegend	HP6017	Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells	Cell Biolabs	AKR-211	Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals	Thermo-Scientific	15mL: 12-565-268	50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)	Fisher Scientific	05-450-127	Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)	Zeiss	N/A	Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns	Thermo-Scientific	PI-87770	Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit	Thermo- Scientific		Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader	BioTek	Synergy HTX Multimode Reader	Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.