Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

Resumo

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Resumo

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

Introdução

De bancada abordagens de separação de células atuais (por exemplo, de células activadas por fluorescência ^1, captura a laser micro-dissecção ^2, talão de separação imuno-magnética ¹⁾ pode levar várias horas de preparação e triagem. Estes grandes escalas de tempo podem afetar os níveis de resposta e expressão fisiológicos, resultando em análises que não são representativas da resposta fisiológica ^3. São necessários sistemas que podem rapidamente e eficientemente isolar tipos de células específicas, sem perturbar os níveis de receptor de superfície celular a fim de melhorar o isolamento de células e de enriquecimento para aplicações biomédicas. Portanto, a justificativa para nossa abordagem é desenvolver uma abordagem suave para o isolamento de células.

O "laboratório em um chip" conceito oferece a promessa de ordens de magnitude mais rápido isolamento de células (horas-a-minutos), e mais frequentemente envolve a captura de células em uma superfície e células ou conte intracelular liberandoNTS através física ^4,5 ou métodos químicos ^6. Embora estas abordagens oferecem algumas vantagens, tais como a identificação de expressão de proteína de ^7,8, identificando a expressão do ARN de ^9-11, ou mesmo proporcionar células para a cultura in vitro ^12,13, muitas destas técnicas não pode ser traduzido para o diagnóstico, tais como perfis de receptor de células devido aos seus ambientes não-fisiológicos. Agentes de elevação enzimáticos, tais como colagenases podem também afectar essas quantidades de receptores de ^14,15, ou seja, técnicas de quantificação receptor celular que usam esses agentes de elevação não irá gerar dados fisiológicos precisos. Lise celular impede a diferenciação entre os receptores de superfície nativas, bem como as que foram anteriormente internalizado ^16. Este protocolo descreve uma abordagem rápida e suave para isolamento de células.

Protocolo

1. Limpar a superfície de vidro e preparação de reagentes

1. Colocar uma superfície de vidro numa máquina de plasma de oxigénio durante 5 min a 50% de potência para o limpar.
2. Prepare reconstituída (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) solução de 2,5 ml de 2%, por adição de 50 ul de APTES e 2,45 ml de etanol num tubo cónico.

2. APTES e DSB funcionalização

1. Adicionar solução APTES para as superfícies. Pipete 150 pi por poço para 8 placas de poços. Pipetar 100 ul por poço de placas de 24 poços. Pipetar 1,1 ml para pratos de vidro de 60 x 15 mm. Cobrir as superfícies para evitar a evaporação e distribuição desigual de solução APTES. Coloque as superfícies num agitador de plataforma durante 50 min à temperatura ambiente, o que cria uma distribuição uniforme da camada de APTES.
   NOTA: APTES é um aminosilano que forma a primeira camada de superfície. Se utilizar uma superfície diferente, heuristicamente determinar o volume de solução necessário para cobrir a superfície.
2. Seleccionar a temperatura para o forno, ao passo que as superfícies estão no agitador: Aquece-se a 55 ° C durante 2 h para as placas de poços e 8 placas de 24 poços. vidro de calor apenas pratos a 90 ° C durante 1 hora.
3. Lavar as superfícies com etanol.
   1. Administrar a quantidade de etanol necessária referenciando baseado na superfície usado. Adicionar 150 ul de etanol a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de etanol a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de etanol para pratos de vidro.
   2. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Lavar mais duas vezes com etanol.
      NOTA: Se qualquer um dos vidro placas bem inferior têm todo o plástico em si, não aquecê-los acima de 65 ° C, como o plástico vai começar a derreter e deformar.
4. Seco com gás de azoto a 100% dispensado a partir de um tanque. Coloque as superfícies no oven.
5. Preparar 2,5 ml de uma solução de d-destiobiotina (DSB) através da combinação de 1,5 mg / ml de DSB em 37,5 ul de dimetil sulfóxido (DMSO), e 5 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) em 2462,5 ul da 0,1 M de 4-morpholinoethanesulfonic hidrato de ácido (MES) (6 pH) tampão. Em seguida, combinar as duas soluções.
6. Adicionar 1 ml de 2-mercaptoetanol β, após 15 min, à solução para extinguir a reacção entre OSC e EDC. Remover APTES quentes funcionalizados superfícies de vidro do forno. Aguarde 5-10 min para as superfícies de vidro para esfriar.
7. Adicionar tampão MES a superfície de lavar, utilizando-se quantidades com base na superfície. Adicionar 150 mL de tampão MES a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de tampão MES a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de tampão MES para pratos de vidro.
8. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não está apontado directamentena superfície. Lavar mais duas vezes com tampão MES.
9. Aplicar a solução ORL-se às superfícies para permitir a incubar. Adicionar 150 ul de solução de DSB por poço para 8 placas de poços. Adicionar 100 ul de solução de DSB por poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de solução de pratos DSB vidro.
10. Coloque as superfícies de vidro DSB cobertos em uma toalha de papel úmido dentro de uma placa de Petri. Cobrir e incubar em um 4 ° C geladeira por 18-24 horas.

3. Estreptavidina funcionalização

1. Lavar cada superfície de vidro três vezes com 1 ml de 1,0 x tampão fosfato salino (PBS). Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Diluir a solução estreptavidina (SAv) estoque para 0,4 mg / ml (recomendado).
   NOTA: PBS é isotónica para que ele possa ser utilizado como um meio de diluição e de enxaguamento. PBS é utilizado como um solvente para o SAv, e, portanto, não afecta a capacidade do SAV para se ligar à superfície.
2. Aplicar 0,4 mg / ml de solução SAv uniformemente às superfícies de modo a que uma fina camada de formas na parte inferior do vidro, seleccionar a quantidade de solução base na superfície. Para 8 placas de poços, adicionar solução SAv 150 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para placas de 24 poços, adicionar solução SAv 100 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para pratos de vidro, adicione 1,1 ml 0,4 mg solução SAv / ml.
3. Cubra e mover as placas para uma 14 centímetros de Petri para reter a umidade. Incubar a placa de Petri na geladeira por 18-24 horas.
   NOTA: É essencial utilizar volumes consistentes de APTES, DSB, e SAv em cada superfície.
4. Lavar cada superfície de vidro três vezes com 150 ul de PBS para remover SAv. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
5. Umedeça uma toalha de papel wom água deionizada e coloque a toalha de papel plana em 14 centímetros de Petri em torno das placas de reter a umidade nos poços. Cobrir a placa de Petri contendo os poços. Incubar a placa de Petri em um 4 ° C Nível de Biossegurança 1 (BSL-1) geladeira até ser necessário.

4. Captação celular and Release

1. Comece com balão T175 (s) de células destinadas para a experiência. Aspirar a mídia do frasco (s). Lavar a mídia restante com 5 ml de temperatura ambiente PBS. Aspirar PBS do frasco (s).
2. Adicionam-se 10 ml de agente de elevação não-enzimática, tal como células de dissociação da solução, para o frasco T-175 de células. Colocar o frasco no incubador durante 6 min para permitir a elevação de células a partir do frasco.
3. Após 6 min, adicionar 10 ml de solução salina equilibrada fria de Hank (HBSS; Veja Lista de Materiais) para inactivar o agente de elevação. Retire 20 uL de células para contar o número de células em solução, utilizando um hemacitómetro.
   NOTA: Dependendo do funcsuperfícies utilizadas na experiência de captura tionalized, o número de células necessário varia. Para funcionalizados 8 placas de poços, usar 300.000 células por poço. Para pratos de vidro funcionalizadas, usar 1,1 milhões de células. Para funcionalizados placas de 24 poços, 125000 células são recomendados. Mais informações sobre a contagem de células é encontrada no suplemento.
4. Repita os passos 4.1- 4.3 para outro frasco de células, se menos células estão presentes do que o necessário para o experimento. Combinar as suspensões de células e as células contam à obter o número total de células em solução.
5. Girar suspensão de células numa centrífuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para obter um pellet de células concentradas. Localizar a quantidade apropriada de HBSS para adicionar à suspensão de células para obter uma concentração de 1 x 10 ⁶ culas por ml, em seguida, aspirar o sobrenadante das células centrifugadas, e adicionar o volume calculado. Este volume pode ser calculada usando as equações no suplemento.
6. Pipeta cima e para baixo (triturado) para voltar a suspender the células em solução e reduzir a aglomeração celular na solução que pode reduzir a ligação do anticorpo. Dividir a solução celular no controle separado e soluções experimentais. Ver Arquivo Suplementar para componentes e cálculos.
7. Adicionar os anticorpos biotinilados às respectivas soluções de células como descrito no ficheiro suplementar. Incubar durante 30 min a 4 ° C num misturador de extremidade-sobre-extremidade.
   NOTA: Para as células MCF7GFP, 0,5 mg / ml de hlgG ou anticorpos / ml de HLA-ABC 0,5 mg são recomendados. Para macrófagos RAW, 1 mg / ml mCD11b são recomendados pela metade do volume para explicar as diferenças de diluição. No caso de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), 0,5 mg / ml de hCD31 é recomendado.
8. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS. Para esta experiência, uma placa de 8 também é aconselhável.
   1. Adicionar 150 uL de HBSS a cada poço para 8 placas de poços. Lavar mais duas vezes usando HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço.Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Manter frio a 4 ° C.
9. Adicionar soluções de células aos poços e esperar 45 minutos para as células a incubar em gelo no agitador. Adicione a solução de biotina em HBSS estéril usando volumes calculados como descrito no suplemento.
10. Remover a solução de células dos poços de vidro usando HBSS.
    1. Gentilmente pipeta 150 uL de HBSS a cada poço. Em seguida, pipetar a HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
    2. Repita mais duas vezes. Após lavagem, adiciona-se aos poços de HBSS para manter as células húmidas.
11. Adicione 150 ml de solução de biotina 20 mM a cada liberação respectivo bem, e depois esperar 20 min para permitir a reação.
12. Recordar células não-especificamente ligados por lavagem com HBSS como indicado acima, e em seguida, se usando células marcadas por fluorescência, proceder a fluorescência das células imagem. Também imagem de células vivas em um recipiente de vidro (como um controlo, para comparar com as células no poço). Se utilizando células transfectadas verdes proteína fluorescente (GFP), a excitação vai ser 470 nm, e a emissão será 515 nm.

5. Anticorpo Optimization: Antibody Titulação

1. Começar por levantar as células do frasco T75 T175 ou como explicado no passo 4.1- 4.3.
   NOTA: Estes volumes são calibrados para placas de 24 poços, mas pode ser alterado para se adequar a qualquer superfícies de vidro funcionalizadas através de testes heurística. Uma titulação de anticorpos representativo é mostrado na Figura 1.
2. Contagem de células usando o hemacitómetro, e depois girar a solução de células num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml, utilizando os cálculos descritos no suplemento.
3. Dividir a 1 milhões células por ml de solução em seis soluções diferentes de 500 ul em diferentes tubos de centrifugação para o anticorpo (Ab) soluções.
   1. Dilui-se a solução stock de anticorpo de 10 ug / mL, 1 ug / mL, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Criar os controles, utilizando 100 ul de tampão de coloração (PBS + 1% de azida de sódio + BSA a 1%), e 500 ul de células de controlo sem Ab nele. Para o controlo em branco (n AB e não células), utilizar uma solução de 300 ul de PBS.
      NOTA: CUIDADO: A azida de sódio é extremamente tóxico, explosivo e extremo cuidado deve ser tomado quando usá-lo. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) e usar o equipamento de segurança apropriado.
4. Combinar e incubar as soluções ab com as soluções de células no misturador de extremidade-sobre-extremidade a 4 ° C durante 30 min. Lavar as placas de 24 poços funcionalizados com HBSS três vezes. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Segure o pipette num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
5. Alíquotas de 125 ul de cada solução de amostra para os APTES apropriadas, DSB, e SAv funcionalizado bem. Incubar a 4 ° C ou sobre gelo durante 45 min sobre a superfície de vidro. Lavar a superfície com HBSS três vezes para remover as células não especificamente ligados. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Não lave a linha de fundo, como aqueles são os controles.
6. Adicionar 150 mL de HBSS a cada poço lavado, coloque as placas de 24 poços em gelo, e então usar um leitor de placas para medir a fluorescência das células GFP (excitação 485 nm / emissão de 528 nm).

Optimization 6. celular: Titulação celular

1. Levantar as células como mencionado nas etapas 4.1 -4,3.
2. Contagem de células utilizando um hemacitómetro. Spin down celular paralução num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml.
   NOTA: Para mais informações sobre a utilização do hemacitómetro pode ser encontrado no suplemento.
3. Pipeta de 1,6 ml da solução de células para o estoque de 1,6 milhões de células e coloque em um tubo cônico. Pipetar 800 ul de células a partir da solução de células para o estoque de 800.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 80 mL do estoque de células para o estoque de 80.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 8 mL do estoque de células imagens 8.000 células e coloque em um tubo cônico.
   NOTA: As concentrações são dadas por 8 medições de placa bem, replicar, conforme necessário. Um exemplo de saída da placa é mostrado na Figura 2.
4. Aqui as quatro soluções de reserva e girar num centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Re-suspender todas as soluções estoque em 400 mL de HBSS.
5. Adicionar 1,6 mL de anticorpo ng / ml 100 ao estoque de 1,6 milhões de células, 0,8 μl ao estoque de 800.000 células, e 0,5 l para todas as outras reservas. Incubar o anticorpo durante 30 min no misturador de extremidade-sobre-extremidade durante 30 minutos a 4 ° C. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS três vezes.
   NOTA: A placa de funcionalizado 8 é recomendado para quantificação microscopia, enquanto que a placa de 24 poços funcionalizado é recomendado para quantificação leitor de placas. Concentração de anticorpo para estoque de células 8000 não foi reduzida para permitir que o factor limitante da superfície de captura para não ser a falta de anticorpos em solução, mas as propriedades de captura de superfície.
6. Aplicar 150 ul das soluções de amostra a cada poço. Aplicar o estoque de 1,6 milhões de célula para a primeira coluna de poços à esquerda. Aplicar o banco de 800.000 células para a segunda coluna a partir da esquerda. Aplicar o banco de células de 80.000 para a terceira coluna da esquerda. Finalmente, aplicar o estoque 8000 células para a última coluna. Incubar durante 45 min a 4 ° C num agitador.
   NOTA: O 1,6 milhãoda célula serve como a concentração mais alta a ser testada, e é o dobro da quantidade de células que é utilizado normalmente em experiências de separação de células (600.000 células por poço) O estoque 800000 célula serve como controlo para a experiência, uma vez que é a concentração celular típica que é usada em experiências de separação de células (3.000.000 células por poço). O estoque de 80000 células serve como uma diluição de dez vezes para testar para concentrações mais baixas para captura celular (30.000 células por poço). O estoque de células 8000 serve como uma diluição de cem vezes para usar como um teste para verificar o limite inferior da separação celular (3.000 células por cavidade).
7. Enxágüe com HBSS três vezes. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Colete todas as lavagens.
8. Imagem as células em um microscópio de fluorescência, se utilizando 8 pratos bem, tirar fotos de cada surrosto, e aplicam-se 150 ul a cada superfície biotina durante uma hora a 4 ° C num agitador. Após uma hora, lavar os poços de libertação de biotina com HBSS 3 vezes como antes. Recolha todas as lavagens de poços para contar com o hemocitômetro e da imagem dos poços de libertação.
9. Aplicar 150 mL de solução de biotina excesso de 20 mM a cavidades apropriadas de liberação de biotina, durante 1 hora, se estiver usando placas de 24 poços, e depois enxaguar esses poços 3 vezes com HBSS. Quantificar placas de 24 poços utilizando um leitor de placas. Usar um hemacitómetro para contar as células de todas as lavagens assim recolhidos.

Análise 7. Imagem

Nota: O pacote de software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) é recomendado para análise de imagem. Inicialmente, as imagens foram convertidas em imagem em tons de cinza, e então o brilho / contraste foi alterado para trazer para fora das células.

1. Carregar a imagem, e converter em tons de cinza, clicando na guia imagem, em seguida, role para baixo até "Type" e clicando em4; 8 bit ".
2. Aumentar o contraste da imagem clicando na guia de imagem e, em seguida, deslocando-se para "Ajuste". Clique em "Brilho e Contraste" e use as barras de rolagem para fazer as células se destacam. Se estiver usando imagens de fluorescência, inverter as imagens para tornar as células mais definidos.
3. Carregar um plug-in para ImageJ chamado ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) para analisar as imagens.
4. Abrir ITCN. Quando uma caixa de diálogo que pede ao utilizador com vários parâmetros para estimar o tamanho da célula, defina a largura mínima da célula de interesse em primeiro lugar. Clique na opção "Detectar escuras Peaks" se a imagem é fluorescente e as células são escurecidas.
5. Defina o valor limite a 2, inicialmente, e, em seguida, apertar o botão de "Contagem". A versão recém contados da imagem aparecerá com pontos vermelhos delineando onde as células foram contadas.
6. Ajuste o parâmetro de limite e largura para obter dados mais precisos celulares por defining do tamanho de uma "célula". Nota: O número de células contadas será em uma caixa de diálogo à direita. alteração de parâmetros dará número diferente de células contadas.
7. Continuar a percorrer os parâmetros de limites e de largura até que uma boa estimativa é alcançado para o número de células.

Resultados

Usando este protocolo que mostram captação celular (Figura 3A) e a libertação de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, bem como controlos de células vivas (Figura 4). Foram quantificados a captura celular como 60% e 80% foram liberados (Figura 3C). Quando estendido esta abordagem a uma mistura de RAW 264.7 de macrófagos e células MCF7GFP, 50% de macrófagos RAW foram capturados (Fig. 3D) e 80%...

Discussão

Melhorias nas técnicas de isolamento de células promove estudos científicos em relações estrutura-função em neurociência ^18, caule de programação celular em biologia regenerativa, e sinalização angiogênico em biologia vascular ^19. De facto, a cultura de células primária ²⁰ (por exemplo, células HUVEC) em biologia vascular é feito principalmente por meio do uso de técnicas de isolamento de células. Isolamento celular também foi usada recentemente para o fluxo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Acros Organics	919-30-2	Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico	Diener	Model 1	Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)	Sigma	D20655	Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	British Drug Houses (BDH)	BDH1115-1LP	Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Thermo-Scientific	5g: 22980 25g: 22981	Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide	BD Falcon	Case of 24: 354118 Case of 96: 354108	Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates	MatTek	P24G-0-13-F	Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol	Science Lab	60-24-2	Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%)	Fisher Scientific	AC172590250	Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven	Thermo Scientific	11-475-153	Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker	Heidolph	13-889-420	Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]	Proteo Chem	9013-20-1	Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish	Fisher Scientific	08748A	Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover	Sigma-Aldrich	Z717231	Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells	Cell Biolabs	AKR211	Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages	ATCC	TIB-71	Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE	Life Technologies	12605036	Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	50003PC	Supplier: Corning
Nonessential amino acids	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	25-025-CI	Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper	Fisher Scientific	12-565-58	Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution	Corning	MT-25-056CI	Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer	Hausser	02-671-54	Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin	Amresco	58-85-5	Used to release cells from surface.
HBSS	Created from Recipe	N/A	Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody	BioLegend	311402	Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody	BioLegend	HP6017	Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells	Cell Biolabs	AKR-211	Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals	Thermo-Scientific	15mL: 12-565-268	50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)	Fisher Scientific	05-450-127	Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)	Zeiss	N/A	Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns	Thermo-Scientific	PI-87770	Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit	Thermo- Scientific		Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader	BioTek	Synergy HTX Multimode Reader	Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.