在多孔介质中使用电子顺磁共振成像客体分子扩散的原位监测

摘要

A protocol for the in situ monitoring of the diffusion of guest molecules in porous media using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging is presented.

摘要

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with nitroxide spin probe 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (IPSL) as a guest inside the periodic mesoporous organosilica (PMO) aerogel UKON1-GEL as a host and ethanol as a solvent is used as an example to describe the protocol. Data is shown from a previous publication, where the protocol has been applied to both IPSL and Tris(8-carboxy-2,2,6,6-perdeutero-tetramethyl-benzo[1,2-d:4,5-d′]bis(1,3)dithiole) methyl (Trityl) as guest molecules and UKON1-GEL and SILICA-GEL as host systems.

A method is shown to prepare aerogel samples that cannot be synthesized directly in the sample tube for measurement due to a size change during synthesis. The aerogel is attached to sample tubes using heat shrink tubing and a pressure cooker to reach the necessary temperature without evaporating the solvent in the process. The method does not assume a clearly defined initial distribution of guest molecules at the start of the measurement. Instead, it requires a reservoir on top of the aerogel and experimentally determines the influx rate during data analysis.

The diffusion is monitored continually over a period of 20 hr by recording the 1d spin density profile within the sample. The spectrometer settings for the imaging experiment are described quantitatively. Data analysis software is provided to take the resonator sensitivity profile into account and to numerically solve the diffusion equation. The software determines the macroscopic translational diffusion coefficient by least square minimization of the difference between the experiment and the numerical solution of the diffusion equation.

引言

多孔材料发挥在实际应用中，如催化和层析¹的主要作用。通过添加表面基团以及调整孔尺寸和表面特性，所述材料可以根据所需的应用程序^2,3。多孔材料的功能关键取决于细孔内客体分子的扩散性能。在多孔材料，必须区分微观平移扩散常数D _微 ，它描述在一方面分子长度规模和宏观平移扩散常数D _宏扩散之间进行 另一方面，这是由扩散通过多个细孔，晶界，扭曲和材料的不均匀性的影响。

有几种磁共振方法可用来研究扩散，每个适合的一部分icular尺度。在毫米刻度，核磁共振（NMR）成像⁴和电子顺磁共振（EPR）成像（如在此协议提交）都可以使用。较小尺度成为通过使用核磁共振脉冲磁场梯度以及EPR实验^5,6的访问。在纳米尺度，EPR谱可以通过观察自旋探针^7,8之间海森堡交换作用的变化来使用。使用EPR成像范围从工业催化剂支持平移扩散， 例如，氧化铝^9，研究各向异性取得高分子凝胶¹²流体^10,11，药物释放系统^{- 14}和膜模型^15。

该协议使用EPR成像监测圆柱形spin探测器的宏观动扩散，多孔介质在原地的做法提出了一个。它展示了由日的主机 - 客户系统Ë氮氧spin探测器3-（2-Iodoacetamido）-2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷（IPSL）作为周期性中孔有机二氧化矽内客（PMO）UKON1-GEL气凝胶作为主机和乙醇作为溶剂。该协议已成功以前使用¹⁶比较_维宏 作为测定用的EPR成像以D _微主机材料UKON1 -凝胶和硅胶和旅客的物种IPSL和三（8-羧基-2,2,6,6- perdeutero四甲基苯并〔1,2-D :4,5-D']双（1,3）二硫）甲基（三苯甲基），参见图1。

在基于连续波（CW）的EPR成像¹⁷的其它方法，扩散需要分光计以外的地方。与此相反，在这里提出的方法在原位方法使用。一系列的一维自旋密度分布_ρ1d的快照（T，γ）是记录一段数小时。在此期间，一个快照是在其他之后拍摄并提供具有约5分钟的时间分辨率的实时扩散图案。

UKON1-GEL和硅胶已在3毫米内径的样品管被合成在文献中描述^。16,18,19的UKON1 -凝胶和硅胶合成导致样品的收缩。将样品置于一个热缩管，以防止客体分子从气凝胶和样品管的壁之间移动的内部。这一附加步骤是没有必要的，可以直接在样品管进行合成而不改变它们的大小的样品。气凝胶样品崩溃时，他们干出来的，所以他们必须在溶剂中在任何时候都被淹没。所需要的热缩管的温度比在环境压力的乙醇的沸点。因此该协议描述了使用高压锅的提高沸腾的乙醇点。

该协议包括预先为EPR成像实验和用于监视IPSL自旋探头扩散分光计设置合成UKON1-GEL的样品制备。进行数据分析，在本地编写的软件提供并且描述其使用。从分光计的原始数据可以直接装载。软件计算的空间1d中的自旋密度分布_{ρ1D（T，γ），}并考虑到谐振器灵敏度分布。用户可以选择的气凝胶和一个时间窗口，在其上扩散常数将被确定的区域。然后，该软件确定基于选择扩散方程的边界条件，解决了扩散方程。它支持最小二乘拟合找到_维宏其中数值解的实验数据的最佳匹配的值。

该协议可以用不同的宾主材料调整用作只要样品整个样品不改变的横截面面积，即_{ρ1D（T，γ）}给出直接访问的浓度，并且不通过样品的横截面的变化的影响。对于_维宏访问值的范围 估计¹⁶ 10 7 /秒之间^-12米² /秒和·10 ^-9 m ²以下。

研究方案

注意:使用前请咨询所有相关的材料安全数据表（MSDS）。如果吞入或吸入酒精是有害的，它是易燃的。

1.优化的连续波（CW）EPR参数

1. 在1mM的浓度制备的乙醇IPSL的40微升（PA）。
2. 取吸管控制器和填充的毛细管与IPSL溶液至2厘米的填充高度。溶液1厘米进一步拉入毛细管使得存在的溶液下方的空气间隙。密封与毛细管密封胶两端的毛细血管。气隙可以防止密封剂的成分扩散到样品。
3. 以1cm从毛细管的上下端部的距离环绕毛细管约5厘米长的聚四氟乙烯（PTFE）胶带的两个条带。
4. 把毛细管导入的EPR样品管（4内径）。确保PTFE带保持毛细管固定在样品管的中心轴。推毛细管下降到样品管的底部。
5. 把样品到谐振器和中心谐振器内的自旋标记物溶液。
6. 调通过以下在光谱仪说明手册分光计为临界耦合。
7. 初步光谱仪设置
   1. 使用微波频率设置中心场B使用下式
      
      其中g≈2.003为不成对自由基在氮氧化物自旋标记的g因子的粗略估计，h是普朗克常数和_μB是玻尔磁。
   2. 建立一个新的实验"field_sweep"与磁场为横坐标，信号强度为纵坐标。使用下面的参数:Centerfield如在先前步骤中，扫描宽度计算值:400 G，modulati振幅:0.8 G，调制频率:100kHz，微波衰减30分贝点数:2048，扫描次数:1，扫描时间:80秒，时间常数:50毫秒。
   3. 激活设置扫描模式。对于设置扫描时间常数，选择最低值，光谱仪的优惠。调节接收机增益的值，其中所显示的信号填充显示强度范围的80％，因此，即使有噪声没有数据点具有比最大的80％的较高的强度。禁用设置扫描之后。
   4. 按"运行"按钮。
   5. 读出的过零点，从得到的频谱的中心峰的字段值。中间字段设置为该值。
   6. 就拿水平线工具，测量从点谱宽，其中最左边的峰值开始上升基线水平之上的地步，最右边的峰值返回到基线水平。
   7. 设置扫描宽度的三倍光谱宽度。
8. 重新计算谱仪参数
   1. 计算扫描时间:扫描宽度/扫描速度。使用5 G /秒的扫描速度。
   2. 计算数据点的最小数目:10 *扫描宽度/线条宽度。
   3. 计算转换时间:扫描时间/数据点的数目。
   4. 计算时间常数:0.1 *行宽*扫描时间/扫描宽度。
9. 衡量一个饱和曲线，以确定最佳微波功率
   1. 将微波衰减为10 dB，按步骤1.7.3描述调节接收机增益。
   2. 设置微波衰减到50分贝，记录光谱。如果信噪比低于5:1，增加扫描次数。重复此步骤直到信噪比为5:1或更大。
   3. 创建新的实验"饱和"使用磁场为横坐标1，微波功率为横坐标2和信号强度作为纵轴。从日复制所有设置E"field_sweep"的实验步骤1.9.2。为横坐标2，微波衰减的开始值设置为10分贝的增量的值为1 dB和点至41以覆盖范围为10分贝至50分贝数。运行实验。
   4. 创建饱和曲线的电子表格。插入以dB微波衰减到第一列。
   5. 计算出微波功率的平方根中的Au在与式第二列
      
      其中x是从第一塔以dB微波衰减。
   6. 使用分光计软件来测量峰峰值为在实验中每个微波衰减的中心谱线的强度。编写强度到电子表格中的第三列。
   7. 绘制对峰峰值强度（针对2栏第3栏）的微波功率的平方根以获得饱和曲线。 Inclu在德积原点（0,0）。
   8. 识别饱和曲线的线性状态。最佳微波功率是最高的微波功率是仍处于线性状态。使用相应的衰减设置为所有进一步的实验。

2.确定磁场梯度强度和时间分辨率

1. 创建与磁场为横坐标1和信号强度作为纵轴分光计软件新的实验。使梯度线圈控制。
2. 从在1.8和1.9.8确定之前的实验复制所有光谱仪的设置。
3. 设置磁场梯度强度170克/厘米的朝上样品轴的方向。
4. 计算扫描宽度SW = SW ₀ + FOV·G，其中SW ₀是在1.8.4在不存在磁场梯度的确定的扫描宽度，FOV 是视场（2.5厘米）和G是磁场梯度强度。
5. 计算估计像素尺寸=线宽/ G，采用在不存在磁场梯度的记录在1.9.3频谱的线宽。
6. 计算扫描时间= SW /扫描速度。使用相同的扫描速度为1.8.1。
7. 计算需要使用更高的值的数据点的最小数量
   我。N + ₁ = 10 *扫描宽度/线宽
   二，N ₂ = 10 *视图/（G *像素大小）的领域。
8. 计算转换时间:扫描时间/数据点的数目。
9. 计算时间常数:0.1 *线宽*扫描时间/扫描宽度或更低。
10. 通过2.9设置2.3计算参数，并按下"运行"按钮。
11. 测量基准的噪声电平以及峰值强度的峰与垂直线工具的中心线。计算出的信噪比。
12. 如果信噪比低于5:1，加倍扫描数在光谱仪的参数的"扫描"面板，并重复步骤2.1.3至2.11。

3.准备样本

注意:戴安全防护眼镜。

注:请溶剂在任何时候都完全淹没气凝胶。参见图2的照片和示意图。

1. 填充直径为10厘米，用乙醇（PA）的培养皿高达5mm的高度。
2. 把气凝胶入培养皿和圆柱形一块5毫米切断为1厘米的长度。
3. 准备一块热缩管的比所述气凝胶筒长约1厘米。
4. 使用玻璃管切刀突破200内径的样品管创建4个厘米长的两件。两件应该有两个开口端。
   注意:操作热风枪时，应戴防护眼镜和合适的手套。不要直接对皮肤或衣服气流和易燃材料保持它拿走。
5. 插入该样品管件5 mm深入热缩管的一端中的一个。使用加热枪小心加热热缩管的这一端，而不管的其余部分缩小。该热缩管现在应该固定在玻璃管中。
   1. 浸没在气凝胶的培养皿玻璃管和热缩管的这种组合。小心地从步骤3.2推片气凝胶到热缩管的开口端。
6. 填用乙醇（PA）的试管至7厘米的高度。从培养皿转移样品放入试管。虽然这样做，确保热缩管的开口端是面向上方。确保气凝胶在乙醇中完全淹没。
7. 插入第二个4厘米长片从步骤3.4到热缩管的开放端的试样管。不适用的力，重力应该足以关闭气凝胶和样品管段之间的间隙。把试管用样品放入烧杯中。
8. 填写一个压力锅至少500毫升乙醇中并加入搅拌棒。
9. 把含在高压锅内脚架样品的烧杯中。
   注意:执行通风橱内的下一步，继续戴安全防护眼镜。
10. 库克和搅拌样品在上述的磁力搅拌器环境压力1巴的压力设置。温度必须至少达到90℃。让它尽快达到的压力和压力阀释放乙醇蒸汽冷却。如果热缩套管没有缩水，重复此步骤。
    注:立即清洁压力锅用水，以尽量减少乙醇对密封阀的作用。在这一点上，所制备的样品可以储存在乙醇塞弗拉尔个月。

4.准备光谱仪

1. 创建使用磁场为横坐标1 2d的实验，时间为横坐标2和信号强度为纵坐标，以使得磁场扫描记录每个时间步长。使梯度线圈控制。
2. 测量之间的时间延迟设置为零。如在第2组点为时间轴的数量确定为20小时/扫描时间设置其他参数。设置微波桥每个切片扫描后执行微调。
3. 按照1.7节的步骤调整光谱仪的空谐振器。

5.准备测量样本

注意:此协议的唯一时间关键步骤是5.3至6.2，它是从与另外的自旋标记物，直到在光谱仪中的数据采集开始时的扩散过程的开始。执行这些步骤，而不会引入任何延误。

1. 把一个手指在样品的顶部从第3保持乙醇溶液从底部流出。然后使用注射器从底部5毫米较低的采样管的移除一些乙醇和密封以管密封化合物这一目的。确保有2毫米的高度密封化合物上方的气泡。
2. 从除于3 mm只用巴斯德毛细吸管气凝胶上述气凝胶上述样品管中取出所有乙醇。
3. 注入20微升的自旋标记物溶液中乙醇对气凝胶的顶部。确保不上气凝胶的顶部创建一个气泡。标记当前时间作为扩散过程的开始。
4. 放置在样品中有4个内径的样品管中。使用PTFE带居中样本。
5. 使用毡尖笔在68毫米气凝胶的上边缘上方的位置来标记所述外样品管中。这有助于在谐振器正确地定心在样品和所说的C谐振器的输入气凝胶的上边缘低于1毫米。

6.执行扩散实验

1. 放置在样品中的谐振器，以使从5.5对准与谐振器和调分光计为如在分光计的操作手册中描述了临界耦合的聚四氟乙烯支架的顶部标记。
2. 使用设置扫描模式，如1.7.3所述，而梯度线圈仍然关闭，设置接收机增益。
3. 启动已成立了第4节写下当前时间的实验。要么等待20小时的实验，以完成或停止实验时所记录的信号不超过4小时以上的过程中发生变化。保存结果。

7.执行数据分析所需的附加实验

注:扩散试验后直接和不与莫相同的样品进行实验，在7.1和7.2咏样品。

1. 记录为反卷积点扩散函数
   1. 从步骤1.7.2切换到"扫场"实验。复制在步骤6从实验的所有设置。
   2. 记录的光谱和测量的信噪比。如果它小于20:1，增加扫描次数，并重复此工序。否则，保存光谱。
2. 执行2D成像实验
   1. 创建与磁场分光计新实验为横坐标1，磁场梯度为横坐标2的角度和信号强度作为纵轴。的参数从步骤6.成像平面设置于YZ平面，这是包括静态磁场B ₀的方向和样品轴的平面复制。
   2. 设置渐变方向到N = FOV /所需的像素尺寸或更高氮角度的数量。
   3. 开始测量并保存结果。
   4. 重复次7.1Ë步骤，并保存结果。
3. 测量谐振器灵敏度分布
   1. 通过重复步骤1.1至1.5制备在溶液旋探针的另一样品，但这次加入4厘米溶液进入毛细管代替2厘米。
   2. 跟随在第2步骤记录的样品的光谱与样品轴的方向的磁场梯度。对于步进2.3，使用的角度为3厘米的字段。保存结果。
   3. 重复测量在不存在磁场梯度的和保存的结果。

8.数据分析

1. 重建二维成像实验
   1. 从装载7.2.3二维成像实验到光谱仪软件的主视窗。
   2. 从装载7.2.4实验到光谱仪软件的二次视口。
   3. 去处理>变换>解卷积，选择切片:所有并点击适用于执行反卷积。
   4. 去卷积的数据保存到磁盘。
   5. 用下面的命令使用免费提供的图像重建软件^20:重建--input result_from_8_1_4.DSC --output reconstructed_image.DSC --steps 100 --size 256
   6. 从8.1.5加载结果到光谱仪的软件以供日后参考。
2. 分析记录的扩散试验
   1. 启动数据分析软件，进入到图3中所示的软件的"装载"标签。从步骤6.3下"扩散试验"装入扩散实验。负载下的"扩散试验W / O梯度"步骤7.1.2对应的点扩散函数。从步骤7.3.2下的"谐振器简介实验"并从步骤7.3.3下的"谐振腔轮廓EXP W / O梯度"的结果，将结果。
   2. 转到图4中所示的谐振器敏感度标签使用7.3.3点扩散函数从实验7.3.2执行数据的卷积。降低噪声功率值，直到结果是嘈杂，然后将其抬，直到噪音刚好消失。
   3. 去，以便从7.1去卷积使用实验记录在6.2每个场扫描为点扩展函数在图5所示的一维的自旋密度分布标签。降低噪声功率值，直到结果是嘈杂，然后将其抬，直到噪音刚好消失。
   4. 切换到如图6所示的作物面积选项卡，选中完全位于气凝胶在那里旋转探头正要从上面在该地区的第一时间步进入和内部扩散热图的区域。如果有疑问，从8.1.6加载重建图像光谱仪软件，以帮助识别气凝胶的确切位置。
   5. 从步骤8.2在样品的向下方向增加的区域，使得没有自旋概率Ë到达的区域的实验时间内的下边界。参见图6，以供参考。
   6. 切换到图7和压配合所示的涌入标签。左边的面板显示剪切区域从8.2.5沿位置轴的积分。
   7. 验证中间面板所示的曲线从零开始，并立即开始上升。如果不是的话，回去8.2.5。
   8. 验证中间面板中显示的红线后面的黑色数据点。
3. 模拟一维自旋浓度随时间和合适的扩散系数
   1. 切换到扩散系数选项卡，压配合。
   2. 等待的计算的结果。
   3. 验证左侧所示的实验数据显示在右边的数字数据相匹配。
   4. 阅读翻译宏观扩散系数D _宏的值是DISPLAYED在屏幕上。

结果

收缩管内的气凝胶的照片和示意图示于图2a和2b。在图2c的二维EPR图像清楚地显示了气凝胶的上边缘。气凝胶上述样品管内_ρ1d的强度是低虽然自旋探针的浓度是在至少高达气凝胶内。然而，垂直于图象平面的样本深度是由于样品管的小内径小得多。注意，EPR图像还示出在该样品管无气泡和气凝胶似乎不具有热收缩管的收?...

讨论

该协议允许顺位分子的扩散的监控。一维成像方法已被选中，是因为它允许较高的时间分辨率相比，2D或3D成像。一维方式需要样品的恒定横截面面积，因为所获得的一维图像的强度不仅取决于浓度，而且在样品上的横截面面积。该方法还要求在样品内的自旋探头的EPR谱只在强度上而不是在形状改变。否则更耗时的谱空间成像，必须使用，这是本方案的范围之外。该方法也只限于系统，其中...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Band spectrometer	Bruker	E580
Spectrometer software	Bruker	Xepr 2.6b.108
gradient coil system	Bruker	E540 GCX2
imaging resonator	Bruker	TMHS 1007
micro-classic pipette controller	Brand	25900
microcapillary ringcaps 50 µl	Hirschmann	9600150	inner diameter 0.5 mm
EPR sample tube 2 mm inner diameter	Bruker	ER 221TUB/2
EPR sample tube 4 mm inner diameter	Bruker	ER 221TUB/4
heat-shrink tubing DERAY-IB	DSG-Canusa	2210048952	4.8 mm/2.4 mm, 2:1, 95 °C - 200 °C
heat gun	Bosch	PHG 600-3
PTFE  band	VWR	332362S	width 12 mm
test tube			length 16 cm, diameter 1.5 cm
beaker			250 ml, height 9 cm, diameter 7 cm
capillary tube sealing	Fisher Scientific	02-678
pressure cooker, 3l with trivet	Beem	Vital-X-Press V2, F1000675
magnetic stirrer with heating element
ethanol (p.a.)
ethanol (techn.)
syringe	Hamilton	1705	0.05 ml, custom length: 20 cm,
Pasteur capillary pipette			length 23 cm
data analysis software	homemade		Available for download at http://www.uni-konstanz.de/drescher/software. Requires Matlab.
UKON1-GEL	kindly provided by Prof. Sebastian Polarz, Martin Wessig and Andreas Schachtschneider		See references 16, 18, 19 for the synthesis