電子常磁性共鳴イメージングを使用した多孔質体でゲスト分子の拡散の場の監視で

要約

A protocol for the in situ monitoring of the diffusion of guest molecules in porous media using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging is presented.

要約

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with nitroxide spin probe 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (IPSL) as a guest inside the periodic mesoporous organosilica (PMO) aerogel UKON1-GEL as a host and ethanol as a solvent is used as an example to describe the protocol. Data is shown from a previous publication, where the protocol has been applied to both IPSL and Tris(8-carboxy-2,2,6,6-perdeutero-tetramethyl-benzo[1,2-d:4,5-d′]bis(1,3)dithiole) methyl (Trityl) as guest molecules and UKON1-GEL and SILICA-GEL as host systems.

A method is shown to prepare aerogel samples that cannot be synthesized directly in the sample tube for measurement due to a size change during synthesis. The aerogel is attached to sample tubes using heat shrink tubing and a pressure cooker to reach the necessary temperature without evaporating the solvent in the process. The method does not assume a clearly defined initial distribution of guest molecules at the start of the measurement. Instead, it requires a reservoir on top of the aerogel and experimentally determines the influx rate during data analysis.

The diffusion is monitored continually over a period of 20 hr by recording the 1d spin density profile within the sample. The spectrometer settings for the imaging experiment are described quantitatively. Data analysis software is provided to take the resonator sensitivity profile into account and to numerically solve the diffusion equation. The software determines the macroscopic translational diffusion coefficient by least square minimization of the difference between the experiment and the numerical solution of the diffusion equation.

概要

多孔質材料は、触媒反応およびクロマトグラフィー¹などの実用的なアプリケーションにおいて主要な役割を果たしています。表面基を付加すると、細孔サイズおよび表面特性を調整することにより、材料が所望の用途^2,3に合わせることができます。多孔質材料の機能が決定的に細孔内部にゲスト分子の拡散特性に依存します。多孔性材料では、区別が一方では、分子長さスケールと巨視的な並進拡散定数D _マクロの拡散を説明微視的並進拡散定数Dの _マイクロ 、との間でなされなければなりません 複数の細孔、粒界、屈曲及び材料の不均一性を通って拡散することによって影響を受ける一方、。

部品の各適切な拡散を研究するために利用可能ないくつかの磁気共鳴方法がありますicular長さスケール。ミリメートルスケールで、核磁気共鳴（NMR）イメージング⁴および電子常磁性共鳴（EPR）画像が（このプロトコルで提示されるように）を使用することができます。小さ ​​いスケールは、パルスNMRでの磁場勾配と同様にEPR実験^5,6を使用することによってアクセス可能になります。ナノメートルスケールで、EPR分光法は、スピンプローブ^7,8の間にハイゼンベルグの交換相互作用の変化を観察することによって使用することができます。 ¹⁴モデル膜^{15 -} 例えば工業触媒担体からEPR撮像範囲を使用して、並進拡散、酸化アルミニウム⁹の研究は、高分子ゲル¹²からなる流体^10,11、薬物放出システムを異方性します。

このプロトコルは、円筒状、多孔質媒体のスピンプローブの巨視的な並進拡散を監視するために、EPRイメージングを用いてin situ法で示します。これは、番目からなるホスト - ゲストシステムについて実証されていますホストやエタノールなどの定期的なメソポーラス有機シリカ（PMO）エアロゲルUKON1-GEL内部ゲストとして電子ニトロキシドスピンプローブ3-（2-ヨードアセトアミド）-2,2,5,5テトラメチル-1-ピロリジニ（IPSL）溶媒。このプロトコルは、正常D _マクロを比較するために、以前に^16使用されてい^ます。 ホスト材料UKON1-GELとシリカゲルとゲスト種IPSLとトリス（8-カルボキシ-2,2,6,6- perdeuteroテトラメチルベンゾ[1,2-dのためのDの _マイクロとEPRイメージングで決定されるように：4,5-D ']ビス（1,3）ジチオール）メチル（トリチル）、 図1を参照してください。

連続波（CW）EPR画像¹⁷に基づいて、他の方法では、拡散は、分光計の外部で行われます。これとは対照的に、ここで紹介する方法は、その場でのアプローチを使用しています。 1dのスピン密度分布_ρ1dの一連のスナップショット（トン、γ）があります数時間にわたって記録しました。この間、あるスナップショットは、他の後に採取し、約5分の時間分解能でリアルタイム拡散パターンを実現しています。

文献に記載されているようUKON1-GELとシリカゲルを3mmの内径と試料管に合成された^。16,18,19 UKON1-GEL、シリカゲル合成は、試料の収縮をもたらします。サンプルは、エアロゲルと試料管の壁との間に移動するゲスト分子を防止するために、熱収縮チューブの内部に配置されています。この追加のステップは、それらのサイズを変更することなく、サンプル管中で直接合成することができるサンプルのために必要ではありません。エアロゲル試料の崩壊、彼らが完全に乾くので、彼らはすべての回で溶媒中に沈めなければなりません。熱収縮チューブのために必要とされる温度は、周囲圧力で、エタノールの沸点よりも高いです。したがって、プロトコルは、上昇させる圧力鍋の使用を記載していますエタノールの沸点。

プロトコルは、EPRイメージング実験とIPSLスピンプローブの拡散を監視するために使用されている分光計の設定のために事前に合成しUKON1-GELのサンプル調製をカバーしています。データ解析のために、局所的に書かれたソフトウェアが提供され、その使用が記載されています。分光計からの生データを直接ロードすることができます。ソフトウェアは、空間1dのスピン密度分布_ρ1dを （トン、γ）を算出し、アカウントに共振器の感度プロファイルをとります。ユーザは、拡散定数が決定されるその上エアロゲルと時間窓の領域を選択することができます。ソフトウェアは、その選択に基づいて拡散方程式の境界条件を決定し、拡散方程式を解きます。これは、数値解が最高の実験データと一致するD _マクロの値を見つけるために、最小二乗フィッティングをサポートしています。

プロトコルがある限り、サンプルの断面積は、サンプル全体変更されないように、異なるゲストのための調整やホスト材料と一緒に使用することができ、それはρ部 _1d（トン、γ）であるに直接アクセスすることができます濃度は、試料断面の変化に影響されません。 D _マクロのアクセス可能な値の範囲 ^{16 -9 10・2} /秒と7メートル^-12 10の間メートル² /秒と推定されます。

プロトコル

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。飲み込んだり、吸入するとエタノールは有害であり、それは可燃性です。

1.連続波（CW）EPRパラメータを最適化

1. 1 mMの濃度でエタノール中IPSL40μlの（PA）を準備します。
2. ピペットコントローラーを取り、2センチメートルの充填高さにIPSL溶液でキャピラリーを埋めます。解決策以下のエアギャップがあるようにキャピラリーに1センチメートルさらなるソリューションを引き出します。シーリングコンパウンド毛細管と両端にキャピラリーをシール。エアギャップは、試料中にシーリング材の成分の拡散を防止します。
3. キャピラリーの上下端1センチ間隔でキャピラリーの周り約5cmの長さのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）テープの2つのストリップを包みます。
4. EPR試料管（4ミリメートル内径）にキャピラリーを入れてください。 PTFEテープは、キャピラリを保持していることを確認してください試料管の中心軸に固定されています。試料管の底にキャピラリを押し下げます。
5. 共振器内に試料を入れて、共振器内のスピン標識ソリューションを中央に配置します。
6. チューン分光計のマニュアルの手順に従って、臨界結合のための分光計。
7. 予備的な分光計の設定
   1. 式を用いて、中心磁場Bを設定するためにマイクロ波周波数を使用
      
      グラム ≈2.003はニトロキシドスピンラベル内の不対ラジカルのg因子のための概算であり、hはプランク定数であり_、Bはボーア磁子ですμ。
   2. 横軸として、磁場、縦ような信号強度を持つ新しい実験「field_sweep」を設定します。次のパラメータを使用します。Centerfieldを、掃引幅、前のステップで計算した：400 G、modulati振幅に：0.8 G、変調周波数：100 kHzの、マイクロ波減衰：30デシベル、ポイント数：2048、スキャン数：1、スキャン時間：80秒、時定数：50ミリ秒。
   3. セットアップスキャンモードを有効にします。コンスタントセットアップスキャン時間については、分光計が提供する最も低い値を選択します。表示信号が表示された強度範囲の80％を満たす場合、値に受信機の利得を調整してもノイズがないデータ点が最大の80％よりも高い強度を有していないようにします。その後、セットアップのスキャンを無効にします。
   4. 「実行」ボタンを押してください。
   5. 得られたスペクトルからの中心ピークのゼロクロスのフィールド値を読みます。その値に中央のフィールドを設定します。
   6. 水平ラインツールを取り、左端のピークがベースラインレベルに右端のピークが戻る点にベースラインレベルを超えて上昇し始める点からスペクトル幅を測定します。
   7. 3倍のスペクトル幅に掃引幅を設定します。
8. 分光器のパラメータを再計算
   1. 掃引幅/掃引速度：掃引時間を計算します。 5 G /秒のスイープ速度を使用してください。
   2. データ点の最小数を計算する：10 *掃引幅/線幅。
   3. 変換時間を計算する：掃引時間/データ点の数。
   4. 0.1 *線幅*スキャン時間/掃引幅：時定数を計算します。
9. 最適なマイクロ波電力を決定するために彩度カーブを測定します
   1. 10デシベルにマイクロ波減衰を設定し、ステップ1.7.3で説明したように、受信機の利得を調整します。
   2. 50デシベルにマイクロ波減衰を設定し、スペクトルを記録します。信号対雑音比が5未満の場合：1、スキャンの数を増やします。 1以上：信号対雑音比が5になるまで、この手順を繰り返します。
   3. 縦として、横軸1のように、横軸2のようなマイクロ波電力と信号強度を磁場を使用して、新しい実験「彩度」を作成します。目からすべての設定をコピーします。ステップ1.9.2からのE "field_sweep」実験。横軸2の場合、10デシベルから50デシベルまでの範囲をカバーするために41に10デシベル、1デシベルとポイント数に増分値にマイクロ波減衰の開始値を設定します。実験を実行します。
   4. 飽和曲線のためのスプレッドシートを作成します。最初の列にデシベルでのマイクロ波減衰を挿入します。
   5. 式と2列目にauの中でマイクロ波電力の平方根を計算します
      
      ここで、xは、最初の列からdBでのマイクロ波の減衰があります。
   6. 実験では、各マイクロ波減衰のための中央スペクトル線の強度をピークにピークを測定するための分光器ソフトウェアを使用してください。スプレッドシートの3列目にその強度を書きます。
   7. 飽和曲線を得るために、ピーク強度（カラム2に対する列3）にピークに対して、マイクロ波電力の平方根をプロットします。院生プロットの原点（0,0）デ。
   8. 飽和曲線の線形領域を特定します。最適なマイクロ波電力は、線形領域にまだある最も高いマイクロ波電力です。すべてのさらなる実験のために、対応する減衰設定を使用します。

2.磁場勾配強度と時間分解能を決定します

1. 横軸1と磁場、縦ような信号強度を持つ分光計ソフトウェアの新しい実験を作成します。勾配コイルのコントロールを有効にします。
2. 1.8と1.9.8で決定されるように前の実験から、すべての分光器の設定をコピーします。
3. 上向きサンプル軸の方向に170 G / cmで傾斜磁場強度を設定します。
4. 掃引幅SW = SWを計算₀ + FOV・SW _0は磁場勾配の非存在下で、1.8.4で決定掃引幅であるG、FOV 視野（2.5センチ）であり、Gは、傾斜磁場の強さです。
5. 磁場勾配の非存在下での1.9.3に記録されたスペクトルの線幅を用いて、推定画素サイズ=線幅/ Gを算出します。
6. 掃引時間= SW /掃引速度を計算します。 1.8.1と同じ掃引速度を使用してください。
7. より高い値を使用して、必要なデータ点の最小数を計算します
   私。N ₁ = 10 *掃引幅/線幅
   ビュー/（G *画素サイズ）のII。N ₂ = 10 *フィールド。
8. 変換時間を計算する：掃引時間/データ点の数。
9. 0.1 *線幅*スキャン時間/掃引幅以下：時定数を計算します。
10. 2.9を介して2.3で計算されたパラメータを設定し、「実行」ボタンを押してください。
11. ピーク強度にベースラインのノイズレベルと同様にピークを測定します垂直ラインツールで中心線の。信号対雑音比を計算します。
12. 信号対雑音比が5未満である場合：1、分光器パラメータの「スキャン」パネルでスキャン数を倍増し、リピートは2.11を通して2.1.3を繰り返します。

3.サンプルを準備

注意：安全メガネを着用してください。

注：完全にすべての回で、溶媒中に沈めエアロゲルを保管してください。写真と回路図については、 図2を参照してください。

1. 5ミリメートルの高さまでエタノール（PA）で直径10cmのペトリ皿を埋めます。
2. ペトリ皿にエアロゲルを入れ、長さ1cmに5ミリメートルの円筒状の部分を切り落としました。
3. エアロゲルのシリンダーよりも約1cm長くなる熱収縮チューブの作品を準備します。
4. 4cm長さの2つの作品を作成するために2ミリメートル、内径のサンプル管を破壊するためにガラス管カッターを使用してください。どちらの作品には、2つの開口端を持っている必要があります。
   注意：ヒートガンを操作する際、安全眼鏡、適切な手袋を着用してください。皮膚や衣服に向かって空気の流れを指示し、可燃性物質から離して保管しないでください。
5. 熱収縮チューブの一方の端部に深さ5mmの試料管片の1を挿入します。慎重にチューブの残りの部分を縮小することなく、熱収縮チューブのこの端を加熱するためにヒートガンを使用してください。熱収縮チューブは現在、ガラス管に固定してください。
   1. エアロゲルのペトリ皿にガラス管と熱収縮チューブの組み合わせを水没。慎重に熱収縮チューブの開放端にステップ3.2からエアロゲルの一片を押してください。
6. 7センチメートルの高さまでエタノール（PA）で試験管を記入してください。試験管にシャーレから試料を移します。そうする間に、熱収縮チューブの開放端が上に向いていることを確認してください。エアロゲルは、完全にエタノールに浸漬されていることを確認します。
7. の第二の長さ4cmの部分を挿入します熱収縮チューブの開放端にステップ3.4からサンプル管。力を加えないでください、重力は、エアロゲルおよびサンプル管片の間のギャップを埋めるために十分であるべきです。ビーカーに試料を用いて試験管を入れてください。
8. 少なくとも500ミリリットルのエタノールで圧力鍋を記入し、攪拌棒を追加します。
9. 圧力鍋内部の五徳にサンプルを入れたビーカーを置きます。
   注意：ヒュームフードの下で次のステップを実行し、安全メガネを着用し続けています。
10. コックおよびマグネチックスターラー上で、周囲圧力より1バールの圧力設定でサンプルをかき混ぜます。温度は少なくとも90℃に到達しなければなりません。それは、すぐに圧力が到達し、圧力弁は、エタノール蒸気を解放されるようにクールダウンしてみましょう。熱収縮チューブが縮小しなかった場合は、この手順を繰り返します。
    注：直ちにシールバルブに対するエタノールの影響を最小限にするために水で圧力鍋をきれいに。この時点で、調製した試料は、セベエタノールに格納することができますRALヶ月。

4.分光計を準備

1. 横2として、2D横軸1の磁場を用いた実験、時間を作成し、磁場掃引は、各時間ステップのために記録されるように、縦座標としての信号強度。勾配コイルのコントロールを有効にします。
2. ゼロに測定間の時間遅延を設定します。 20時間/掃引時間に、時間軸のためのポイント数を設定部2で決定されるような他のパラメータを設定します。各スライススキャン後に微調整を行うためにマイクロ波ブリッジを設定します。
3. チューニングし、空の共振器の分光器を1.7節の手順に従ってください。

5.測定のためのサンプルを準備します

注：このプロトコルの唯一の時間の重要なステップは、スピン標識を付加した拡散プロセスの開始からの時間まで分析計着工のデータ収集である、6.2を介して5.3です。導入することなく、次の手順を実行任意の遅延。

1. 底部に流出エタノール溶液を維持するためにセクション3からの試料の上に指を置きます。そして、下側の試料管の底5ミリメートルからいくつかのエタノールを除去し、チューブシーリング化合物とその端をシールするために注射器を使用しています。シーリングコンパウンド上記の高さが2mmの気泡が存在することを確認します。
2. ちょうどパスツールキャピラリーピペットを用いて、エアロゲル上記3ミリメートル以外のエアロゲル上記のサンプル管からすべてのエタノールを除去。
3. エアロゲルの上にエタノールでスピン標識溶液20μlを注入します。エアロゲルの上に気泡を作成しないようにしてください。拡散プロセスの開始と現在の時刻をマークします。
4. 4ミリメートル、内径と試料管にサンプルを置きます。サンプルを中央にPTFEテープを使用してください。
5. エアロゲルの上端上記の68ミリメートルの位置で外試料管をマークするためにフェルトペンを使用してください。これは正しく、共振器内のサンプルを中心に役立ちますと、cを置きます共振器のエアロゲルの上端以下の1ミリメートルを入力します。

6.拡散実験を行い

1. 5.5共振器のPTFEホルダーの頂部と整合してチューニング分光器の操作マニュアルに記載されているように、重要な結合のための分光器からマーキングするように共振器内にサンプルを配置します。
2. 傾斜磁場コイルの電源がオフのままになっている間に1.7.3で説明したように、受信機の利得を設定するために、セットアップスキャンモードを使用してください。
3. 現在の時刻を書き留め部4に設定されている実験を開始します。いずれかが記録された信号は、4時間以上にわたって変化しない場合、実験を終了または停止する実験のために20時間を待ちます。結果を保存します。

7.データ解析に必要な追加実験を行います

注：直接拡散実験後の同じ試料を用いて7.1および7.2で実験を行うとなしMOサンプルをレイムス。

1. デコンボリューションのための点広がり関数を記録
   1. ステップ1.7.2から「フィールドスイープ」の実験に切り替えます。ステップ6での実験から、すべての設定をコピーします。
   2. スペクトルを記録し、信号対雑音比を測定します。それが20未満である場合：1、スキャンの数を増やすと、この手順を繰り返します。それ以外の場合のスペクトルを保存します。
2. 2Dイメージング実験を行います
   1. 横軸1と磁場との分光器に新しい実験、横軸2のような磁場勾配の角度、縦軸として信号強度を作成します。静磁場B ₀の方向と試料の軸を含む平面であるYZ面に撮像面を設定し、ステップ6からパラメータをコピー。
   2. N N = FOV /所望の画素サイズ以上に勾配方向の角度の数を設定します。
   3. 測定を開始し、結果を保存します。
   4. 繰り返し番目7.1での電子の手順と結果を保存します。
3. 共振器の感度プロファイルを測定します
   1. 1.5を介して手順1.1を繰り返すことによって、溶液中のスピンプローブの別のサンプルを準備するが、今回は代わりに2センチメートルのキャピ​​ラリーに溶液4センチ追加します。
   2. サンプル軸方向の磁場勾配でサンプルのスペクトルを記録するためにセクション2の手順に従ってください。ステップ2.3の場合は、3センチメートルの視野を使用します。結果を保存します。
   3. 磁場勾配が存在しない状態で測定を繰り返し、その結果を保存します。

8.データ解析

1. 2Dイメージング実験を再構築
   1. 分光器ソフトウェアの主要なビューポートに7.2.3からの2D画像化実験をロードします。
   2. 分光器ソフトウェアの二次ビューポートに7.2.4から実験をロードします。
   3. 処理>変換へ行く>デコンボリューション、スライス選択：すべてをクリックデコンボリューションを実行するために適用されます。
   4. ディスクにデコンボリューションデータを保存します。
   5. 再構築--input result_from_8_1_4.DSC --output reconstructed_image.DSC --steps 100 --size 256：次のコマンドを使用して、自由に利用できる画像再構成ソフトウェア^20を使用します
   6. 8.1.5から後で参照するために分光計ソフトウェアに結果をロードします。
2. 録画拡散実験を分析
   1. データ解析ソフトウェアを起動し、 図3に示されているソフトウェアの「ロード」タブに移動します。「拡散実験」の下にステップ6.3から拡散実験をロードします。 「拡散実験W / O勾配」の下にステップ7.1.2から対応点広がり関数をロードします。 「共振器プロファイル実験」の下のステップ7.3.2および「W / O勾配EXP共振器プロファイル」の下のステップ7.3.3の結果から結果をロードします。
   2. 図4に示した共振器の感度]タブに移動しますは、点広がり関数として7.3.3を用いた実験7.3.2からのデータのデコンボリューションを実行します。ノイズがちょうど消えるまで結果がノイジーになるまで、雑音電力値を下げて、それを上げます。
   3. 点広がり関数として7.1から実験を使用して6.2に記録された各フィールドのスイープをデコンボリューションするために、 図5に示す1dのスピン密度プロファイル]タブに移動します。ノイズがちょうど消えるまで結果がノイジーになるまで、雑音電力値を下げて、それを上げます。
   4. 図6に示すクロップエリアのタブに切り替えます。完全にエアロゲルの内側にあるとスピンプローブは、その領域の最初の時間ステップで上から入力するだけではここで拡散ヒートマップの領域を選択します。疑わしい場合は、エアロゲルの正確な位置を識別するための分光計ソフトウェアの8.1.6からの再構成画像をロードします。
   5. サンプルの下方向にステップ8.2から面積を増やしていないスピンPROBように、eは実験の時間内の領域の下限に達します。参考のため、図6を参照してください。
   6. 図7と圧入に示す流入タブに切り替えます。左側のパネルには、位置の軸に沿って8.2.5から切り出された領域での積分を示しています。
   7. 中央のパネルに示す曲線は、0から始まり、すぐに上昇し始めていることを確認します。それ以外の場合は、8.2.5に戻ります。
   8. 中央のパネルに示す赤い線が黒のデータ点を、以下のことを確認します。
3. 時間が経つにつれて1dのスピン濃度をシミュレートし、拡散係数をフィット
   1. 拡散係数のタブと圧入に切り替えます。
   2. 計算の結果を待ちます。
   3. 左に示す実験データが右に示す数値データと一致することを確認します。
   4. displaある巨視的な並進拡散係数D _マクロの値を読みます画面上YED。

結果

収縮チューブ内のエアロゲルの写真および概略図は 、 図2Aおよび2Bに示されています。 図2cに2D EPRイメージは明らかにエアロゲルの上端を示します。スピンプローブの濃度は、エアロゲル内と少なくとも同じ高いがエアロゲル上のサンプル管内_ρ1dの強度が低くなります。しかし、画面に垂直なサンプ?...

ディスカッション

プロトコルは、常磁性ゲスト分子の拡散を監視できます。それは2Dまたは3Dイメージングと比較してより高い時間分解能を可能にするため、1Dイメージングアプローチが選択されています。得られ1dの画像の強度は濃度にもサンプルの断面積にだけでなく、依存しているため1dのアプローチは、サンプルの一定の断面積を必要とします。この方法はまた、サンプル内のスピンプローブのEPRスペク...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Band spectrometer	Bruker	E580
Spectrometer software	Bruker	Xepr 2.6b.108
gradient coil system	Bruker	E540 GCX2
imaging resonator	Bruker	TMHS 1007
micro-classic pipette controller	Brand	25900
microcapillary ringcaps 50 µl	Hirschmann	9600150	inner diameter 0.5 mm
EPR sample tube 2 mm inner diameter	Bruker	ER 221TUB/2
EPR sample tube 4 mm inner diameter	Bruker	ER 221TUB/4
heat-shrink tubing DERAY-IB	DSG-Canusa	2210048952	4.8 mm/2.4 mm, 2:1, 95 °C - 200 °C
heat gun	Bosch	PHG 600-3
PTFE  band	VWR	332362S	width 12 mm
test tube			length 16 cm, diameter 1.5 cm
beaker			250 ml, height 9 cm, diameter 7 cm
capillary tube sealing	Fisher Scientific	02-678
pressure cooker, 3l with trivet	Beem	Vital-X-Press V2, F1000675
magnetic stirrer with heating element
ethanol (p.a.)
ethanol (techn.)
syringe	Hamilton	1705	0.05 ml, custom length: 20 cm,
Pasteur capillary pipette			length 23 cm
data analysis software	homemade		Available for download at http://www.uni-konstanz.de/drescher/software. Requires Matlab.
UKON1-GEL	kindly provided by Prof. Sebastian Polarz, Martin Wessig and Andreas Schachtschneider		See references 16, 18, 19 for the synthesis