测量<em&gt;体外</em&gt; HIV-1 Preintegration配合物的整合活动

摘要

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

摘要

HIV-1包膜蛋白的接合靶细胞表面，这导致病毒细胞膜融合，随后通过释放病毒衣壳（CA）的芯的进入细胞质上的同源受体。接着，病毒逆转录酶（RT），如一个同名核蛋白复合物的一部分被称为反转录复合物（RTC），转换病毒单链RNA基因组中的双链DNA拷贝（VDNA）。这导致了另一个核蛋白复合物中的生物合成，称为集成预复合物（PIC），所述VDNA和相关病毒蛋白和宿主因素组成。在PIC相关病毒整合酶（IN）的编排一体化VDNA成在时间上和空间上调节两步骤过程宿主染色体DNA。首先，在IN处理VDNA的3'端在细胞质中，第二，在PIC投放到细胞核后，它介导的加工VDNA整合到染色体DNA中。太平洋岛国隔离从急性感染HIV-1的靶细胞在体外功能，因为它们有能力相关VDNA集成到一个外源添加的异源靶DNA。这种PIC-基于体外整合实验已显著贡献描绘逆转录病毒整合的机械细节和发现IN抑制剂。在这份报告中，我们在阐述一个更新的HIV-1检测PIC，它采用嵌套实时定量聚合酶链反应（定量PCR）为基础的策略，用于测量分离的天然太平洋岛国的体外整合活动。

引言

在靶细胞中HIV-1复制涉及多个步骤，大致分为两个阶段:早期和晚期的事件。当HIV-1顺序地结合靶细胞表面受体CD4和两个共同受体（CCR5或^CXCR4）1的一个早期的事件开始。因此，该病毒细胞膜熔丝，病毒衣壳（CA）的芯被释放到细胞质^2。在CA芯含有病毒基因组的单链RNA（ssRNA）和几种蛋白质，包括病毒和起源细胞。在CA相关病毒蛋白包括逆转录酶（RT）和整合酶（IN），在病毒复制的早期事件介导的关键步骤的两种酶。 RT和在核蛋白复合体，即反转录复合物（RTC）和一体化的预复合物（PIC），分别为^3，4，5的上下文功能<^SUP>，6。所述病毒ssRNA基因组海港末端重复（R）相邻的元件以特有的序列U5（在5'端）和U3（在3'端）的端部。 RTC的转换病毒ssRNA基因组中双链（DS）的DNA拷贝（VDNA）。此逆转录过程也导致U5和U3序列的重复，从而产生在VDNA ^7,8的两端长末端重复序列（LTR）。接着，在PIC相关中催化两个顺序的生化反应，使所述VDNA的整合到宿主染色体^{9，10，11。}首先，在细胞质中，在多聚体接合两者的LTR ¹²和从每个3'-末端的裂解二核苷酸。此3'末端加工在每个3'端的VDNA的（CA _OH）产生羟基。接着，PIC投放到细胞核，其中IN使用VDNA CA _OH作为亲核切断染色体DNA的两条链以交错的方式。同时，在协调拼接的VDNA两端在染色体DNA上的相反链所得到的磷酸二酯键。以下这个链转移步骤，所述宿主细胞机器在整合位点的连接点除去在VDNA的5'端和修理随后的单链缺口两个未配对核苷酸。因此，早期事件达到高潮与建立的HIV-1基因组的集成DNA拷贝（前病毒）。原病毒提供了高效的病毒基因表达，从而启动后的事件，包括病毒编码的蛋白质的表达的合适的环境;未成熟病毒的组装;而崭露头角，释放和成熟为感染性病毒体^13。

纯化的重组逆转录病毒在有资格进行， 在体外 ，两个3'-末端加工和链转移活动外源提供的LTR状衬底的DNA。使用这样的纯化的重组中的生化研究已经揭示VDNA积分^{14，15，16，17}的关键方面。然而，不同于在天然感染，这在体外生化反应不支持基板DNA导入靶DNA的两端的协调一致的集成。与此相反，从急性感染的细胞中分离逆转录病毒的PIC协调一致内源性VDNA两端整合到异源靶DNA。这导致了广泛的采用和I N体外集成（IVI）测定后续改进使用分离的天然照片。

在首次报道逆转录病毒的IVI测定法，从感染了重组小鼠细胞胞质提取物白血病病毒（MLV）窝藏在其LTR 大肠杆菌supF基因担任活动的源，和一个突变λ噬菌体缺陷在裂解生长作为目标的DNA外源提供的DNA中。重组MLV的DNA成功整合复制到噬菌体DNA和随后supF表达导致的重组噬菌体的噬斑形成能力的恢复。然而，该实验策略是一种间接的方式费力和措施集成。为了解决这样的警告，一个Southern印迹间接末端标记测定法，其中量化的PIC-相关联的IVI活性内源性VDNA纳入外源线性噬菌体phiX174的DNA的量度，被开发^{6，7，18。}虽然这种方法提供了积分事件的直接量度，需要较高量的PIC的准备，这仍然是一个技术挑战性努力。为了规避这一点，只需要适量的PIC的巢式PCR为基础的测定法开发的^{4，5，19。}

在这份报告中，我们描述的更新版本基于PCR技术在设计来概括自然感染过程中出现的HIV-1 PIC介导的整合活动体外方法嵌套。这种方法使用的HIV-1感染靶细胞的胞质提取物作为内源性的PIC活性的源，其与实时定量聚合酶链式反应（qPCR的）测量。隔离PIC和测量它们的整合活动的程序改编，经过修改，从由恩格尔曼实验室²⁰发表协议。在该方法中，在PIC相关积分活性是通过提供外源的线性靶DNA ^21，并从得到的DNA产物发起这种融合反应中纯化，并用作用于基于PCR的随后的量化的起始原料。在第一轮常规PCR，病毒靶DNA结是通过使用合适的引物扩增。在第二轮的qPCR，特定LTR-引物用于特异性富集来自第一轮PCR产物的VDNA人口。请参见该方法的详细描述的协议部分。

在用反转录病毒的PIC 体外研究已经导致显著进展中的逆转录病毒DNA整合机制的理解以及在抑制剂的开发。根据最近的更加注重映射HIV-1的整合位点，确定的病毒和宿主因子的HIV-1整合的作用，并朝向打击抗药性发展新的抗病毒药物，我们设想以增加的兴趣，并广泛使用的IVI测定的一样，本报告中所述的。这反过来会导致在该方法将来精炼，从而多样化其应用的范围。

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研究方案

1.病毒生产

注意:为了产生感染性的HIV-1的高滴度，使用活化基于树枝状大分子转染试剂转染与感染HIV-1的分子克隆的人类胚胎肾（HEK）细胞系293T。已经观察到，磷酸钙转染方法产生可比较的结果。

1. 在生物安全等级2（BSL2）实验室中，种子3×10 ^6个 293T细胞每10cm培养皿中8的Dulbecco补充有10％胎牛血清（FBS），青霉素和链霉素改良的Eagle培养基（DMEM）中的溶液。培养细胞在设置在37℃的培养箱中5％的CO ₂ O / N。
2. 第二天，在每个10cm皿转染细胞，稀释8微克pNL4-3质粒DNA（见材料数据表 ）的对的DMEM 300微升的缺乏血清和抗生素的最终体积。加入80微升转染试剂，吹打拌匀，并在室温孵育5 - 10分钟的转染复合物的形成。
3. 吸取下菜中，每含有血清和抗生素的DMEM新鲜菜加7毫升。
4. 添加1毫升含DMEM血清和抗生素的对转染复合物，通过移液混合，并将该混合物添加到细胞中。轻轻地摇晃菜方便，甚至转染复合物的分布。
5. 立即将细胞转移到BSL3实验室地点中的CO ₂设定在37℃和5％的培养箱，并培养所述细胞48小时。
6. 收集用吸管含有病毒的组织培养上清液中，然后将其转移到一个离心管中。离心机在300×g离心5分钟以沉淀细胞和碎片，然后用0.45μm孔径的注射器过滤器过滤上清液。
7. 以消除在此无细胞病毒制备任何夹带的质粒DNA，在37℃下处理用DNA酶1（20微克/毫升）1小时。
8. 量化HIV-1的效价，可使用特定的p24-酶联免疫吸附测定（ELISA），因为它是常规使用²²迅速并且易于方法。
   注意:应该指出的是，p24的ELISA测量物理滴度（病毒颗粒的数量）。另外，测量病毒相关的RT活性（外源性RT法）或病毒感染（TZM-BL-基于线指示细胞感染性测定）将提供感染性病毒颗粒的独家读数。

2. SUP-T1细胞病毒感染（BSL3实验室）

1. 在一个BSL2实验室中，保持SUP-T1细胞1细胞1.0和2.0之间×10 ^{6×10 6} / mL的罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）补充有10％热灭活的FBS，青霉素培养基，链霉素（分流比2，每2 - 3天）。汇集SUP-T1细胞从培养瓶中，吹打混匀，并通过使用血细胞计数器和台盼蓝排除ST确定活菌数癌宁方法。
   1. 制备所需数目的50毫升锥形离心管中80×10 ^6个细胞（每病毒感染）的等分试样。
   2. 离心在吊桶式转子的细胞以500 xg离心和25℃下5分钟。不去除细胞培养基，含有沉淀的细胞在管转移到BSL3实验室用于进一步处理。小心吸从管细胞培养基而不干扰细胞沉淀。
2. DNA酶I处理过的病毒接种物的适量添加到管中的细胞，并通过温和移液拌匀。为80×10 ^6个细胞，使用30毫升DNA酶I处理过的病毒（p24的相当于病毒的50微克）的。
   注:太平洋岛国功能的分离需要与感染非常高的多重性（MOI）感染靶细胞。
3. 均匀分布两个6孔组织培养板（ 即 12×2.5毫升等分试样的混合物;使用每个侵染2板离子）。
4. 为spinoculation，放置用在480 xg离心吊桶式转子和25℃2小时的板载体和离心机的培养板中。
5. 孵育spinoculated细胞在37℃和5％的CO ₂ 5小时。

3.收获和裂解感染的细胞（BSL3实验室）

1. 池对应于从培养板放入50毫升锥形离心管中的每个感染（总共30毫升〜）细胞。
2. 收获离心细胞在300 xg离心和25℃下进行10分钟。小心吸从管的上清液（可替代地，可使用移液管）。
3. 以除去任何残留的病毒颗粒，通过加入缓冲的K 2毫升洗涤各细胞沉淀^{- / -} （150毫米氯化钾，20mM的HEPES，pH值7.6，5mM的MgCl ₂的），并离心分离，在300 xg离心样品和25℃下10分钟。然后，在不干扰颗粒，小心地取出通过抽吸或通过使用移液管的上清液。
4. RepeaT高低3.3。
5. 小心通过使用微量除去任何残余缓冲液。重悬每个细胞沉淀在2ml冰冷的裂解缓冲液的K ^{+ / +（}缓冲^的 K ^- / ^-补充有0.025％毛地黄皂苷，1毫摩尔DTT，20微克/毫升抑肽酶），混合通过温和移液的内容，并转移到2毫升离心管中。

4.准备细胞质的PIC（BSL3实验室）

1. 岩石上在RT旋转振荡器10分钟的样品。
2. 离心样品，用预冷却至4℃的转子，在1500 xg离心和4℃下进行4分钟。
3. 不干扰沉淀，小心地将上清液转移到新的微量离心管中并离心以16,000 xg离心和4℃1分钟。
4. 小心地将上清液转移到新的微量离心管中。添加RNA酶A（20毫克/毫升），以20微克/毫升（2微升2毫升的PIC）的终浓度和孵育在室温的内容为30分钟（无摇摆）。
5. （ ^{- / -}在缓冲ķ60％重量/体积）加入蔗糖至7％的终浓度，并通过温和移液拌匀。制备的PIC的等分试样（ 例如，200微升）在微量离心管，闪光冷冻在液氮中，并发生在-80℃冷冻用于长期存储。

5. 在体外集成（IVI）分析使用HIV-1图片

1. 准备用特制的引物，phiX174-F和phiX174-R从PCR的phiX174质粒DNA扩增2.0 kb的区域在IVI试验使用的目标DNA。
   1. 组装如表1中描述的PCR混合物中。使用表2中建议的热循环条件在热循环仪进行PCR。凝胶纯化用凝胶纯化试剂盒（按照制造商推荐的协议）的PCR产物，并在-80℃下将纯化的靶DNA作为等份储存直至使用。
2. 加入靶DNA的600毫微克至200 - ＆＃181;太平洋岛国L的等份，混合均匀，在37℃孵育45分钟。
   注:IVI反应省略目标DNA或包括整合酶抑制剂（如雷特格韦）推荐的控制反应。
3. 通过添加SDS，EDTA和蛋白酶K至0.5％，8毫米，和0.5毫克/毫升，终浓度分别停止IVI反应。充分混合反应的内容和孵育过夜在56℃。
4. 第二天，净化从通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀的IVI反应的总DNA。开展16000 XG和RT所有离心步骤。
5. 酚等体积添加到脱蛋白质样品，通过涡旋剧烈混合，并离心2分钟。小心取出上层水相，并将其转移至新管。
6. 重复步骤5.5。上层水相转移至新管。
7. 加1的等体积:1的苯酚:氯仿混合物中，通过涡旋剧烈混合，并离心FOR 2分钟。上层水相转移至新管。
8. 添加氯仿等体积的，通过涡旋剧烈混合，并离心2分钟。上层水相转移至新管。
9. 沉淀的DNA，0.1微克/微升，醋酸钠3 M的最终浓度添加糖原到0.3M的最终浓度，和2.5体积的100％乙醇（冰冷）的。涡旋混合，短暂离心，收集的内容，并将该管在-80℃CO / N。
10. 第二天，离心样品30分钟，以16,000 xg离心4℃30分钟。小心取出上清液，而不会干扰颗粒。
11. 添加80％乙醇（冰冷），以沉淀和离心的500μL的16000 xg离心4℃10分钟。在RT风干的DNA沉淀，并在不含核酸酶的水加入50μL彻底重悬。在-20℃保存DNA样本。

6. PCR方法量化PIC活动

注:整合到靶DNA是由采用2套引物和2个连续两轮PCR的巢式PCR策略定量HIV-1的DNA的拷贝数。

1. 使用引物（分别为LTR和phiX174引物）靶向病毒LTR和phiX174的DNA扩增整合的HIV-1的DNA的结执行第一轮常规PCR。
   1. 组装如表3中描述的第一轮PCR混合物。组装不含模板DNA所有组件的主结构，取45微升等分到单独的PCR管，并添加5μL模板DNA或无核酸酶水（对照）。
   2. 使用表4中建议的热循环条件在热循环仪进行PCR。
2. 执行使用侧翼病毒LTR（LTR-R和LTR-U的引物）的一个短区域的引物，以选择性地扩增从第一ロ集成VDNA序列第二轮的qPCRUND PCR产物。以确定集成VDNA拷贝数，生成通过使用已知拷贝数的10倍系列稀释的标准曲线（ 例如，10 ⁰ - 10 ^8）的HIV-1的分子克隆。
   1. 组装，如表5中描述的第二轮的qPCR混合物。组装不含模板DNA的所有部件的主混合物，小心地分配25μL的等分试样到96孔PCR反应板孔的适当数量，然后添加未纯化的第一轮的5微升PCR产物或无核酸酶水（控制）。一式三份执行所有的qPCR反应。
   2. 加载PCR板放入实时PCR仪，并使用表6中所建议的循环条件进行定量PCR。
   3. 使用合适软件进行数据分析。

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结果

HIV-1图片的分离

用于HIV-1图片由急性感染SUP-T1细胞分离协议的原理图如图1所示。这个协议是从由恩格尔曼等人描述的方法得到。 ^19，20。的HIV-1 PIC可被组装在感染的细胞和被包括在逆转录VDNA的核蛋白复合物，病毒蛋白，和细胞因子

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讨论

逆转录病毒的PIC的生化分析提供了重要的见解逆转录病毒DNA整合的机制。逆转录病毒的PIC的融合活性的测定可通过空斑形成试验，Southern印迹分析，和嵌套的qPCR来实现。空斑试验的实验策略是费力并且利用测量积分^6，7，18的间接方法。 Southern印迹的检测方法衡量直接集成，但需要较大量的PIC ^...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate-buffered Saline (PBS) (1x)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase 1	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Sup-T1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2 - 7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100x)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/mL ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/mL solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	S7899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’ First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	---
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’ Second round Taqman probe:  5’-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	---
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862