מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

Summary

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Abstract

חלבוני מעטפת HIV-1 לעסוק קולטנים מאותו מקור על פני תא היעד, מה שמוביל היתוך קרום ויראלי תאים ואחריו שחרורו של קפסיד ויראלי (CA) הליבה לתוך הציטופלסמה. בהמשך לכך, transcriptase ההפוכה ויראלי (RT), כחלק ממכלול nucleoprotein שם כינתה את השעתוק לאחור המורכב (RTC), ממיר את גנום RNA חד-גדילי ויראלי לתעתיק פעמי גדילי דנ"א (vDNA). זה מוביל biogenesis של אחר מורכבי nucleoprotein, כינה את המורכבות ואינטגרציה-מראש (PIC), מורכבת vDNA וחלבוני הווירוס קשור וגרם מארח. Integrase ויראלי הקשורים PIC (IN) מנצח על אינטגרציה של vDNA לתוך דנ"א כרומוזומלי המארח תהליך בן שני שלבים מוסדר temporally מרחבית. ראשית, בתהליכים הקצוות "3 של vDNA בציטופלסמה, ושנית, לאחר PIC traffics לגרעין, שהוא מתווך אינטגרציה של vDNA מעובד לתוך ה- DNA כרומוזומלי. התמונות מבודדותמתאי היעד נגועים בחריפות עם HIV-1 הם פונקציונליים במבחנה, כפי שהם המוסמכות לשלב את vDNA הקשורים לתוך ה- DNA היעד אקסוגני הוסיף Heterologous. PIC מבוסס כאלה מבחני אינטגרציה במבחנה תרם תרומה משמעותית לתחום את הפרטים מכניסטית של אינטגרצית retroviral וכדי לגלות לפי מעכבים. בדו"ח זה, אנו לפרט על ב assay עודכן HIV-1 PIC המעסיקה תגובת שרשרת פולימראז כמותיים מקוננת בזמן אמת (qPCR) אסטרטגיה מבוססת למדידת פעילות האינטגרציה חוץ גופייה של תמונות יליד מבודדות.

Introduction

HIV-1 שכפול בתא היעד כרוך שלבים מרובים, מקובצים באופן כללי לשתי שלבים: אירועים מוקדמים ומאוחרים. האירועים מוקדם להתחיל כאשר ברצף HIV-1 נקשר לקולטן תא המטרה CD4 ואחד משני הקולטנים-שיתוף (CCR5 או CXCR4) ^1. כתוצאה מכך, את פתיל ממברנות תאי וירוס, ואת קפסיד ויראלי (CA) ליבה הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה ^2. ליבת CA מכיל את רנ"א חד-גדילי גנומית ויראלי (ssRNA) וכמה חלבונים, הן ויראליות הסלולר במקורם. החלבונים ויראלי קשורים CA כוללים transcriptase ההפוכה (RT) ואת אינטגראז (IN), שני אנזימים אשר מתווכים שלבים קריטיים במהלך אירועים מוקדם בשכפול נגיף. קל RT ו בתפקוד בהקשר של מתחמי nucleoprotein, כלומר מורכבים שעתוק לאחור (RTC) ואת מורכבות מראש אינטגרציה (PIC), בהתאמה ^{3, 4, 5 , 6. הקצות חוזרות מסוף נמל הגנום הנגיפי ssRNA (R) אלמנטים סמוכים אל U5 הרצפים הייחודי (ב 5 'בסוף) ו- U3 (על 3' בסוף). RTC ממיר את הגנום ssRNA ויראלי לתעתיק פעמיים גדילי דנ"א (DS) (vDNA). תהליך השעתוק לאחור זה גם גרם שכפול של רצפי U5 ו- U3, ובכך לייצר חוזר מהסוף ארוך (LTR) בשני הקצוות של vDNA 7, 8. כתוצאה מכך, לפי קשור PIC מזרז שתי תגובות ביוכימיות רציפות המאפשרות את האינטגרציה של vDNA לתוך כרומוזום מארח 9, 10, 11. ראשית, בציטופלסמה, לפי multimers לעסוק הן Ltrs 12 וידבק dinucleotide מכל הקצוות 3'-סופנית. עיבוד 3'-סוף זה מפיק קבוצת הידרוקסיל בכל 3'-end (CA _OH) של vDNA.לאחר מכן, PIC traffics לגרעין, שבו לפי משתמשת CA vDNA _OH בתור נוקלאופיל לחתוך שני הגדילים של ה- DNA כרומוזומלי בצורה מדורגת. במקביל, מתואם שזור בשני הקצוות של vDNA אל קשר פוספודיאסטרי וכתוצאה מכך על גדילים השניים של דנ"א כרומוזומלי. בעקבות צעד העברת גדיל זה, מנגנון תא המארח מסיר את שני נוקלאוטידים מזווגים בקץ '5 של vDNA ומתקן את הפערים חד גדילים שהתפתחו בצומת של אתר האינטגרציה. האירועים מוקדם ובכך לשיאה עם הקמת עותק דנ"א משולב (provirus) של הגנום HIV-1. Provirus מספק סביבה מתאימה עבור ביטוי גנים ויראלי יעיל, אשר יוזם אירועים מאוחרים יותר, כולל את הביטוי של חלבונים המקודדים וירוס; הרכבה של וירוס לא בשלה; ניצנים, שחרור, והתבגרות לתוך virions זיהומיות 13.}

לפי retroviral רקומביננטי מזוכך מוסמךלבצע, במבחנה, פעילויות 3'-end עיבוד גדיל העברה הן מסופקות אקסוגני DNA מצע LTR דמוי. מחקרים ביוכימיים באמצעות IN רקומביננטי מזוכך כגון חשפו היבטים קריטיים של אינטגרציה vDNA ^{14, 15, 16, 17.} עם זאת, שלא כמו זיהום טבעי, תגובה ביוכימית במבחנה זה אינו תומך אינטגרציה מתואמת של שני הקצוות של DNA המצע לתוך ה- DNA היעד. לעומת זאת, התמונות retroviral מבודד תאים נגועים בחריפות המטפלים יחדיו לשלב את שני הקצוות של vDNA אנדוגני לתוך ה- DNA היעד Heterologous. זה הוביל את האימוץ הנרחב והחידודים הבאים של לי n אינטגרצית Vitro (IVI) מבחנים באמצעות תמונות יליד מבודדות.

בחודש הראשון דיווח assay IVI retroviral, תמציות ציטופלסמית מתאים נגועים Murine רקומביננטיוירוס לוקמיה (MLV) מחסה הגן coli supF א ב LTR שלה ששימשו כמקור הפעילות, ואת ה- DNA של הפאג למבדה מוטציה פגום בצמיחה ממס סופק אקסוגני כמו ה- DNA היעד. השתלבות מוצלחת של ה- DNA MLV רקומביננטי להעתיק לתוך ה- DNA הפאג והביטוי supF שהתפתח הוביל לשיקום היכולת להרכיב פלאק של לפאגים רקומביננטי. עם זאת, אסטרטגיה זו ניסיוני הוא שילוב מייגע צעדים בדרך עקיפה. כדי לטפל אזהרות כאלה, assay תיוג-הסוף עקיף דרום מבוסס כתם, אשר מכמת את פעילות IVI הקשורים PIC כאמצעי של vDNA אנדוגני משולב DNA phiX174 בקטריופאג לינארית אקסוגניים, פותח ^{6, 7, 18.} למרות בשיטה זו מספקת מדידה ישירה של אירועי אינטגרציה, כמויות גבוהות יחסי של הכנת PIC נדרשות, אשר נשארה מאתגר מבחינה טכניתמַאֲמָץ. כדי לעקוף זאת, מבחני PCR מבוססי מקוננות המחייב רק כמויות צנועות של תמונות פותחו ^{4, 5, 19.}

בדו"ח זה, אנו מתארים גרסה מעודכנת של PCR מבוסס מקוננות שיטה במבחנה המציאה כדי לשחזר את פעילות אינטגרצית HIV-1 PIC בתיווך המתרחשת בזמן הדבקה טבעית. שיטה זו משתמשת תמציות cytoplasmic של תאי יעד HIV-1-נגועים כמקור פעילות PIC האנדוג'ינוס נמדד עם תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת (qPCR). הנהלים לבידוד תמונות מדידים פעילויות האינטגרציה שלהם מותאמים, עם שינויים, מתוך פרוטוקולים שפורסמו על ידי מעבדת אנגלמן ^20. בשיטה זו, פעילות האינטגרציה הקשורים PIC היא שיזמה מתן DNA היעד ליניארי אקסוגניים ^21, ואת מוצרי DNA הנובעיםתגובת שילוב הזה הוא מטוהר ושמשה החומר המוצא של כימותים מבוססים PCR הבא. בשנות ה PCR קונבנציונאלי בסיבוב הראשון, הצמתים DNA הנגיפי-היעד הם מוגבר באמצעות פריימרים מתאימים. ב-הסיבוב השני qPCR, פריימרים ספציפיים LTR משמשים להעשרת האוכלוסייה vDNA במיוחד מן המוצרים PCR-בסיבוב הראשון. נא עיין בסעיף פרוטוקול תיאור מפורט של שיטה זו.

במחקרים במבחנה עם התמונות retroviral הובילו להתקדמות משמעותית להבנתנו את מנגנון האינטגרציה DNA retroviral ו בפיתוח מעכבי IN. בהתבסס על ההתמקדות ההולכת וגוברת לאחרונה באתרי אינטגרציה HIV-1 מיפוי, בקביעת התפקיד של גורמים נגיפיים המארח אינטגרצית HIV-1, ופיתוח תרופות אנטי חדשות כלפי במאבק עמיד לתרופות, אנחנו מדמיינים התעניינות מוגברת ואת שימוש נרחב של מבחני IVI , כמו זה המתואר בדו"ח זה. זה, בתורו, יביאחידודים בעתיד בשיטה, ובכך לגוון את טווח היישומים שלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפקת וירוס 1.

הערה: כדי ליצור כותרות גבוהות של HIV-1 זיהומיות, transfect כליה עוברית האנושי (HEK) שורת התאים 293T עם שיבוט מולקולרי זיהומיות HIV-1 באמצעות מגיב transfection מבוסס dendrimer מופעל. זה נצפה כי שיטת סידן פוספט transfection מניבה תוצאות דומות.

1. בתוך 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL2) במעבדה, זרע 3 x 10 ⁶ 293T תאים לכל 10 צלחת ס"מ 8 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), פניצילין, סטרפטומיצין. התרבות התאים להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ O / N.
2. למחרת, עבור transfecting תאים בכל צלחת 10 ס"מ, לדלל 8 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד pNL4-3 (ראה לוח חומרים) לנפח סופי של 300 μL של DMEM חסר בסרום ואנטיביוטיקה. הוסף 80 μL של מגיב transfection, ומערבבים היטב על ידי pipetting ו דגירה ב RT עבור5 - 10 דקות להיווצרות מורכבת transfection.
3. הוצא את המדיה המנות על ידי שאיפה ולהוסיף 7 מ"ל לכל צלחת של DMEM טריים המכילה סרום ואנטיביוטיקה.
4. הוסף 1 מ"ל של DMEM המכילה סרום ואנטיביוטיקה למתחם transfection, ומערבבים על ידי pipetting, ולהוסיף את התערובת אל התאים. מערבולת בעדינות את המנה כדי להקל חלוקה שווה של קומפלקסים transfection.
5. מיד להעביר את התאים במעבדה BSL3, מקום להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, והתרבות התאים למשך 48 שעות.
6. אסוף את supernatant תרבות רקמה המכילה וירוס בעזרת פיפטה ולאחר מכן להעביר אותו צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות עד גלולה התאים ופסולת, ולאחר מכן לסנן את supernatant דרך פילטר מזרק 0.45 מיקרומטר נקבוביות בגודל.
7. על מנת להפחית את פלסמיד דנ"א שריד כהכנה וירוס תא ללא זה, לטפל עם DNase 1 (20 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
8. כדי לכמת אתכייל HIV-1, השתמש Assay immunosorbent Enzyme-linked ספציפי-p24 (ELISA), כפי שהוא שיטה מהירה נוחה לשימוש שגרתי ^22.
   הערה: יצוין כי p24 ELISA מודד את כייל הפיזי (מספר חלקיקי נגיף). לחלופין, מדידת פעילות RT הקשורים וירוס (assay RT אקסוגניים) או infectivity וירוס (TZM-bl תא מחוון קו מבוססי מבחני infectivity) תספק ההודעה הבלעדית של חלקיקי נגיף מדבק.

2. וירוסים זיהום של תאים Sup-T1 (Lab BSL3)

1. במעבדה BSL2, לשמור על תאים Sup-T1 בין 1.0 x 10 ⁶ ו 2.0 x 10 ⁶ תאים / מ"ל מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני בתוספת 10% חום מומת FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (ביחס פיצול של 1 : 2 כל 2 - 3 ד). פינת התאים Sup-T1 מן צלוחיות תרבות, ומערבבים היטב על ידי pipetting, ולקבוע את ספירת תאי קיימא באמצעות hemocytometer ואת הרחקה כחול trypan staining שיטה.
   1. הכן את המספר הדרוש של aliquots של 80 x 10 ⁶ תאים (מחיר זיהום בנגיף) ב 50 מבחנות צנטריפוגה חרוטי מ"ל.
   2. צנטריפוגה התאים ב הרוטור מתנדנד דלי XG ב 500 ו 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מבלי להסיר את תרבית תאים הבינונית, להעביר את הצינורות המכילים תאי pelleted למעבדת BSL3 לעיבוד נוסף. בזהירות לשאוב את מדיום תרבית תאים מהצינור מבלי להפריע גלולת התא.
2. הוספת כמות מתאימה של בידוד וירוס שטופל אני DNase אל התאים בצינור ומערבב היטב על ידי pipetting העדין. עבור 80 x 10 ⁶ תאים, השתמש 30 מ"ל של DNase וירוס אני שטופלו (50 מיקרוגרם של וירוס p24-שווה ערך).
   הערה: בידוד של תמונות פונקציונליות דורש הדבקה של תאי היעד עם multiplicities גבוהה מאוד של זיהום (משרד פנים).
3. פזר את התערובת באופן שווה בין שתי צלחות תרבית הרקמה 6-היטב (כלומר 12 x aliquots 2.5 מ"ל; להשתמש 2 צלחות לכל להדביקיוֹן).
4. לקבלת spinoculation, במקום צלחות תרבות בנשאיות צלחת צנטריפוגות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד ב 480 XG ו -25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
5. דגירת תאי spinoculated ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 5 שעות.

קציר 3. תמוגה של תאים נגועים (מעבדת BSL3)

1. לרכז את התאים המתאימים לכל זיהום מהצלחות תרבות לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל (~ 30 מ"ל בסך הכל).
2. קציר התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 ו 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בזהירות לשאוב supernatant מהצינור (לחילופין, להשתמש פיפטה).
3. למען הסר חלקיקים נגיפיים שיורית, לשטוף כל גלולה התא על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ K ^{- / -} (150 מ"מ KCl, 20 HEPES מ"מ, pH 7.6, 5 מ"מ MgCl ₂₎ ו צנטריפוגה מדגם XG ב 300 ו 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דק. ואז, מבלי להפריע גלולה, להסיר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה או באמצעות פיפטה.
4. Repeat צעד 3.3.
5. מוציאים בזהירות כל חיץ שיורית באמצעות micropipette. Resuspend כל גלולה תא 2 מ"ל של K חיץ תמוגה קר כקרח ^{+ / +} (Buffer K ^- / ^- השלימו עם digitonin 0.025%, 1 מ"מ DTT, 20 מיקרוגרם / מ"ל aprotinin), לערבב תוכן על ידי pipetting עדין, ומעבירים צינור 2 מ"ל microcentrifuge.

4. הכנת תמונות cytoplasmic (מעבדת BSL3)

1. רוק דגימות על שייקר רוטרי ב RT במשך 10 דקות.
2. צנטריפוגה דגימות, עם הרוטור precooled עד 4 מעלות צלזיוס, ב 1500 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
3. מבלי להפריע גלולה, בזהירות להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות microcentrifuge טריים XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
4. להעביר בזהירות את supernatant לצינור microcentrifuge טרי. הוסף RNase (20 מ"ג / מ"ל) לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​(2 μL עבור 2 מ"ל של התמונות) דגירה את התוכן ב RT במשך 30 דקות (לא נדנדה).
5. הוספת סוכרוז (60% w / v במאגר K ^{- / -)} לריכוז סופי של 7% ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. הכן aliquots (למשל, 200 μL) של התמונות צינורות microcentrifuge, פלאש להקפיא בחנקן נוזלי, ומניחים במקפיא -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

5. שילוב Vitro (IVI) מבחני שימוש HIV-1 תמונות

1. הכן את ה- DNA היעד בשימוש assay IVI ידי הגברה אזור 2.0 kb מ- DNA פלסמיד phiX174 עם PCR באמצעות פריימרים מחוייט, phiX174-F ו phiX174-R.
   1. הרכב את תערובת PCR כמתואר בטבלה 1. בצע PCR ב Cycler תרמית באמצעות תנאי רכיבת התרמית מומלצים בטבלה 2. ג'ל לטהר את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת ג'ל לטיהור (בעקבות פרוטוקול יצרן מומלץ), ולאחסן את ה- DNA היעד המטוהר כמו aliquots ב -80 ° C עד שימוש.
2. להוסיף 600 ננוגרם של DNA היעד ל -200 - & #181; aliquot של תמונות L, לערבב היטב, דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
   הערה: תגובות IVI השמטת DNA היעד או כוללות מעכבי אינטגראז (למשל, Raltegravir) מומלצות תגובות שליטות.
3. עצור את התגובה IVI ידי הוספת SDS, EDTA, ו proteinase K לריכוזים סופי של 0.5%, 8 מ"מ, ו -0.5 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. מערבבים את התוכן תגובה ביסודיות דגירה לילה בשעה 56 ° C.
4. למחרת, לטהר את ה- DNA הכולל מן התגובה IVI על ידי מיצוי פנול / כלורופורם משקעים אתנול. לבצע את כל הפעולות צנטריפוגה ב XG 16,000 ו RT.
5. הוסף נפח שווה של פנול מדגם deproteinized, לערבב נמרצות על ידי vortexing, צנטריפוגות במשך 2 דקות. מוציא בזהירות את השלב מהימי העליון ולהעביר אותו צינור טרי.
6. חזור על שלב 5.5. מעביר את השלב מהימי העליון לצינור טרי.
7. הוסף נפח שווה של 1: פנול 1: תערובת כלורופורם, לערבב נמרצות על ידי vortexing, צנטריפוגות FO r 2 דקות. מעביר את השלב מהימי העליון לצינור טרי.
8. הוסף נפח שווה של כלורופורם, לערבב נמרצות על ידי vortexing, צנטריפוגות במשך 2 דקות. מעביר את השלב מהימי העליון לצינור טרי.
9. כדי לזרז DNA, להוסיף גליקוגן לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μL, 3 M של נתרן אצטט לריכוז סופי של 0.3 M, ו 2.5 כרכים של 100% אתנול (קרים כקרח). וורטקס לערבב, בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את התוכן, ולמקם את הצינור ב -80 ° CO / N.
10. למחרת, צנטריפוגות מדגם למשך 30 דקות ב XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה.
11. הוספת 500 μL של 80% אתנול (קרים כקרח) על גלולה ו צנטריפוגות ב XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אוויר יבש גלולה DNA ב RT וביסודיות resuspend ב 50 μL של מים nuclease חינם. אחסן את דגימות ה- DNA ב -20 ° C.

6. מבחני PCR עבור פעילות כימות PIC

= "Jove_content"> הערה: העותק מספר HIV-1 DNA משולב לתוך ה- DNA היעד הוא לכימות על ידי אסטרטגיה מקוננת PCR המעסיקה 2 סטים של פריימרים ו -2 סיבובים רציפים של PCR.

1. בצעו את PCR קונבנציונאלי בסיבוב הראשון באמצעות פריימרים מיקוד LTR ויראלי והדנ"א phiX174 (פריימרים LTR ו phiX174, בהתאמה) כדי להגביר את צמתים של דנ"א HIV-1 משולב.
   1. הרכב את התערובת בסיבוב הראשון PCR כמתואר בטבלה 3. להרכיב תערובת אמן של כל הרכיבים למעט ה- DNA תבנית, לוותר aliquots 45 μL לתוך צינורות PCR נפרד, ולהוסיף 5 μL של תבנית ה- DNA או מים חופשי nuclease (שליטה).
   2. בצע PCR ב Cycler תרמית באמצעות תנאי רכיבת התרמית מומלצים בטבלה 4.
2. בצע את הסיבוב השני qPCR באמצעות פריימרים כי האגף אזור קצר של LTR ויראלי (LTR-R ו- פריימרים LTR-U) כדי להגביר את רצפי vDNA משולב באופן סלקטיבי מן-ro הראשוןמוצרי und PCR. כדי לקבוע את vDNA משולבת להעתיק מספרים, ליצור עקומה רגילה באמצעות 10x דילולי סדרה של מספרי עותק ידועים (למשל, 10 10 - ^{0 8)} של השיבוט המולקולרי HIV-1.
   1. הרכב את התערובת בסיבוב השני qPCR כמתואר בטבלה 5. להרכיב תערובת אמן של כל הרכיבים למעט ה- DNA תבנית, לוותר בקפידה 25 aliquots μL לתוך המספר המתאים של בארות בצלחת התגובה 96-היטב PCR, ולאחר מכן להוסיף 5 μL של מוצרי ה- PCR בסיבוב הראשון unpurified או nuclease ללא מים (לִשְׁלוֹט). בצע את כל התגובות qPCR בשלושה עותקים.
   2. טען את הצלחת ה- PCR לתוך מכשיר PCR בזמן אמת ולבצע qPCR באמצעות התנאים אופניים מומלץ בטבלה 6.
   3. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בידוד של HIV-1 תמונות

סכמטי של הפרוטוקול המשמש לבידוד של תמונות HIV-1 מ בחריפות נגוע בתאי Sup-T1 מתואר באיור 1. פרוטוקול זה נגזר השיטות שתוארו על ידי אנגלמן et al. ^19,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ניתוחים ביוכימיים של התמונות retroviral סיפקו תובנות קריטיות לתוך מנגנון של אינטגרציה DNA retroviral. מדידה של פעילות האינטגרציה של תמונות retroviral יכולה להיות מושגת על ידי assay היווצרות הפלאק, ניתוח כתם דרום המקונן qPCR. האסטרטגיה ניסיון של assay פלאק היא מייגע מנצלת שיטה עקיפה למדידת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate-buffered Saline (PBS) (1x)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase 1	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Sup-T1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2 - 7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100x)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/mL ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/mL solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	S7899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’ First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	---
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’ Second round Taqman probe:  5’-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	---
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862