の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

要約

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

要約

HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド（CA）コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素（RT）は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写（RTC）は、二本鎖DNAコピー（vDNA）へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体（PIC）は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ（IN）は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 '末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイで PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。

概要

初期および後期のイベント：標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体（CCR5または^CXCR4）1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド（CA）コアが細胞質²に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素（RT）及びインテグラーゼ（IN）、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写（RTC）とプレインテグレーション複合体（PIC）の文脈で機能^{IN、3、4、5} <^SUP>、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート（R）ユニークな配列の（5時U5 '末端）および（3時U3'末端）に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖（ds）DNAコピー（vDNA）へのウイルスのssRNAゲノムを変換します。この逆転写プロセスは、従ってvDNA ^7,8の両端の長い末端反復（LTR）を生成し、U5及びU3配列の重複をもたらします。その後、PIC-関連INは宿主染色体^9、10、11にvDNAの統合を可能にする2つの連続生化学反応を触媒します。まず、細胞質内で、多量体の両方のLTR ^12に係合および3 '末端のそれぞれからジヌクレオチドを切断します。この3 '末端の処理は、各3'末端vDNAの（CA _OH）にヒドロキシル基を生成します。INは千鳥状に染色体DNAの両方の鎖を切断する求核剤として_OH vDNA CAを使用する、請求次に、PICは、核に入稿。同時に、INは協調染色体DNAの反対の鎖上に得られたリン酸ジエステル結合にvDNAの両端を継ぎ。この鎖の転写工程に続いて、宿主細胞機構は、5 'vDNAの両端と修理に2つの不対ヌクレオチド組み込み部位の接合部に続く一本鎖ギャップを削除します。初期の事象は、このようにHIV-1ゲノムの統合されたDNAコピー（プロウイルス）の設立で絶頂に達します。プロウイルスは、ウイルスにコードされたタンパク質の発現を含む、後のイベントを、開始し、効率的なウイルス遺伝子の発現に適した環境を提供します。未成熟ウイルスのアセンブリ。そして、リリース、および感染性ビリオン¹³への成熟出芽。

精製された組換えレトロウイルスINはに有能ですin vitroで 、行って、両方の3 '末端プロセシングおよび鎖移転活動は、上の外因LTRのような基質DNA供給します。このような精製された組換えINを用いて生化学的研究は、vDNA統合^{14、15、16、17}の重要な側面を明らかにしました。しかし、自然感染とは異なり、このインビトロ生化学反応は、標的DNAに基質DNAの両端の協調統合をサポートしていません。これとは対照的に、急性感染細胞から単離されたレトロウイルスのPICは、協奏異種標的DNAの中に内在性vDNAの両端を統合します。これは、単離された天然のPICを使って広く採用し、I nはインビトロインテグレーション（IVI）アッセイのその後の改良につながりました。

最初に報告されたレトロウイルスIVIアッセイでは、細胞からの細胞質抽出物は、組換えマウスに感染させましたそのLTRに大腸菌supF遺伝子を有する白血病ウイルス（MLV）は、IN活動の源を務め、および溶菌成長の欠損変異体ラムダファージのDNAは、外因的に標的DNAとして供給しました。組換えMLV DNAの統合を成功さは、ファージDNAにコピーして、その後のsupF式は、組換えファージのプラーク形成能力の回復につながりました。しかし、この実験的な戦略は面倒であり、間接的な方法で統合を測定します。このような警告に対処するために、vDNAは外因性の線形化バクテリオphiX174 DNAに組み込まれ、内因性の尺度としてPIC関連IVI活動を定量化するサザンブロットベースの間接末端標識アッセイは^{、18、7、6}開発されました。この方法は、組込み事象の直接的な測定を提供するが、PICの調製の比較的高い量は技術的に困難なままである、必要とされます努力。これを回避するには、写真のわずかな量を必要とするネストされたPCRベースのアッセイは^{、19 5、4}開発されました。

この報告書では、我々は、in vitroの方法で 、ネストされたベースのPCRの更新バージョンを記述自然感染時に発生するHIV-1 PIC媒介統合アクティビティを再現するために考案しました。この方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて測定された内因性のPIC活性の供給源として、HIV-1に感染した標的細胞の細胞質抽出物を使用します。 PICを単離し、それらの統合の活動を測定するための手順は、エンゲルマンの実験室²⁰によって発行されたプロトコルから、修正を加えて、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、外因性の直鎖標的DNA ²¹から得られたDNA産物を提供することによって開始されますこの統合化反応を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。この方法の詳細な説明のためのプロトコルのセクションを参照してください。

レトロウイルスのPICを用いたin vitroの研究では、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムの理解にとINの阻害剤の開発に大きな進歩につながっています。 HIV-1の統合におけるウイルスと宿主因子の役割を決定し、薬剤耐性との闘いに向けて新たな抗ウイルス薬の開発、マッピング、HIV-1の統合サイトでの最近の増加の焦点に基づいて、我々は、IVIアッセイの関心の高まりや広範な使用を想定します、この報告書に記載のものなどがあります。これは、今度は、につながりますそれによって、そのアプリケーションの範囲を多様化する方法で将来の改良、。

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プロトコル

1.ウイルス産生

注：、感染性HIV-1の高力価を生成する活性化されたデンドリマーベースのトランスフェクション試薬を用いて、感染性HIV-1分子クローンによるヒト胎児腎臓（HEK）細胞株293Tをトランスフェクトします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、同等の結果が得られることが観察されています。

1. バイオセーフティレベル2（BSL2）ラボでは、シード8 10cmの皿当たり3×10 ⁶ 293T細胞mLの10％ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の。培養物を37℃に設定したインキュベーター中で細胞を、5％CO _2、O / N。
2. 次の日は、各10cmの皿に細胞をトランスフェクトするために、血清および抗生物質を欠くDMEMの300μLの最終容量まで（ 材料表を参照）pNL4-3プラスミドDNAの8μgのを薄めます。 、トランスフェクション試薬の80μLを加え、ピペッティングによりよく混ぜ、そして室温でインキュベート5 - トランスフェクション複合体形成のための10分。
3. 吸引により皿から培地を除去し、血清および抗生物質を含む新鮮なDMEMのディッシュあたり7 mLを加え。
4. 、トランスフェクション複合体に血清および抗生物質を含むDMEMの1 mLを加え、ピペッティングにより混合し、細胞に、この混合物を追加します。静かにトランスフェクション複合体の均一な分布を容易にするための皿を旋回。
5. すぐにBSL3実験室、37℃に設定したインキュベーター内の場所および5％CO _2、および文化に48時間細胞を細胞を移します。
6. ピペットを使用してウイルスを含む組織培養上清を回収した後、遠心分離管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、細胞および破片をペレット化し、その後、0.45μmの細孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。
7. この無細胞ウイルス調製物中の任意のキャリーオーバーのプラスミドDNAを除去するために、1時間、37℃でDNアーゼ1（20μg/ ml）で処置します。
8. 定量化するために、HIV-1力価、それは日常的な使用²²ための迅速かつ適した方法であるように、p24の固有の酵素免疫測定法（ELISA）を使用します。
   注：p24のELISAは、物理的な力価（ウイルス粒子の数）を測定することに留意すべきです。また、ウイルス関連RT活性（外因性RTアッセイ）またはウイルス感染性（TZM-BL指標細胞ラインベース感染性アッセイ）を測定すると、感染性ウイルス粒子の排他的な読み出しを提供します。

燮-T1細胞の2.ウイルス感染（BSL3研究室）

1. BSL2ラボでは、10％の熱不活性化FBS、ペニシリン、および1のストレプトマイシン（スプリット比を補っロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地中に1.0×10 ⁶及び2.0×10 ⁶細胞/ mLの間のSup-T1細胞を維持します：2毎に2から3 D）。 、培養フラスコから燮-T1細胞をプールピペットでよく混和し、血球計およびトリパンブルー排除STを使用することにより生細胞数を決定しますメソッドをaining。
   1. 50 mLのコニカル遠心管中の（ウイルス感染当たり）80×10 ⁶細胞のアリコートの必要数を準備します。
   2. 500×gで、スイングバケットローターで細胞を遠心分離し、5分間25℃。細胞培養培地を除去することなく、さらなる処理のためBSL3実験室にペレット化した細胞を含むチューブに移します。慎重に細胞ペレットを乱すことなくチューブから細胞培養培地を吸引します。
2. チューブ中の細胞にDNアーゼI処理したウイルス接種物の適切な量を追加し、穏やかにピペッティングによりよく混ぜます。 80×10 ⁶細胞について、DNアーゼI処理ウイルス（P24-同等のウイルスの50μgの）の30ミリリットルを使用します。
   注：機能のPICの単離は、感染の非常に高い多重度（MOI）で標的細胞に感染する必要があります。
3. 2 6ウェル組織培養プレートの間で均等に混合物を分配する（ すなわち、12×2.5-mLのアリコートを、未感染あたり2プレートを使用イオン）。
4. スピノキュレーションのために、2時間、480×gでスイングバケットローターを用いてプレートキャリアと遠心分離機で培養プレートに置き、25℃。
5. 5時間spinoculated 37℃で細胞を、5％CO _2でインキュベートします。

感染細胞の3収穫や溶解（BSL3ラボ）

1. 細胞は50 mLのコニカル遠心チューブ（〜30 mLの合計）に培養プレートから各感染症に対応するプール。
2. 10分間、300×gで、25℃での遠心分離により細胞を回収。慎重に（あるいは、ピペットを使用）チューブから上清を吸引除去します。
3. ^{- / -} （150ミリモルのKCl、20mMのHEPES、pH7.6の、5mMのMgCl _{2）、300×g}で、25°Cのためにサンプルを遠心分離し、残留ウイルス粒子を除去するために、緩衝液Kの2ミリリットルを添加することにより、各細胞ペレットを洗浄10分。その後、ペレットを乱すことなく、慎重に吸引またはピペットを使用して、上清を除去します。
4. Repeaトンのステップ3.3。
5. 慎重にマイクロピペットを使用して、任意の残った液を取り除き。氷冷溶解バッファーのK ^{+ / +（ -} / ^-バッファK 0.025％ジギトニン、1 mMのDTT、20μgの/ mLのアプロチニンを補充した）2mL中に再懸濁各細胞ペレットを、穏やかなピペッティングによって内容物を混合し、への転送2mLのマイクロチューブ。

細胞質のPICの4準備（BSL3ラボ）

1. 10分間室温でロータリーシェーカー上でサンプルをロック。
2. 1,500×gで、4℃に予備冷却回転子を、サンプルを遠心分離し、4分間、4°C。
3. ペレットを乱すことなく、慎重に1分間16,000×gで4℃で新鮮なマイクロ遠心チューブと遠心分離機に上清を移します。
4. 慎重に新しいマイクロ遠心チューブに上清を移します。 30分（なし揺動）をRTで内容を20μgの/ mLの（PICを2mLのための2μL）の最終濃度までのRNase A（20 mg / mlで）を追加し、インキュベートします。
5. 7％の最終濃度にし、穏やかにピペッティングによりよく混ぜ（ ^{- - /}バッファKにワット60％/ v）のスクロースを追加します。長期保存のために-80℃の冷凍庫に微量遠心管、液体窒素中でフラッシュ凍結し、場所でのPICのアリコート（ 例えば、200μL）を準備します。

インビトロの統合5. HIV-1のPICを使う（IVI）アッセイ

1. カスタムメイドのプライマー、phiX174-FとphiX174-Rを用いたPCRでphiX174プラスミドDNAから2.0キロバイトの領域を増幅することにより、IVIアッセイで使用した標的DNAを準備します。
   1. 表1に記載されているようにPCR混合物を組み立てます。 表2に推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。 （メーカー推奨のプロトコルに従って）ゲル精製キットを用いて、PCR産物をゲル精製し、そして使用するまで-80℃でアリコートとして精製された標的DNAを保存します。
2. 200に標的DNAの600 ngの追加 - ＆＃181;のPICのLアリコートを、よく混ぜ、45分間37℃でインキュベートします。
   注：インテグラーゼ阻害剤（ 例えば、ラルテグラビル）を標的DNAを省略したりなど、IVIの反応はコントロール反応を推奨しています。
3. 0.5％、8 mMの、それぞれ0.5 mg / mlでの最終濃度までSDS、EDTA、及びプロテイナーゼKを添加することにより、IVI反応を停止させます。反応内容物を完全に混合し、56℃で一晩インキュベートします。
4. 翌日、フェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりIVI反応からの全DNAを精製します。 16,000×gで、室温ですべての遠心操作を実行します。
5. 2分間、脱タンパクサンプルに等量のフェノールを加え、ボルテックスで激しく混合し、遠心。慎重に上部の水相を除去し、新しいチューブに移します。
6. 繰り返し手順5.5。新しいチューブに上部の水相を転送します。
7. 、クロロホルム混合物ボルテックスで激しく混合し、遠心分離器のfo：1フェノール：1等量の追加R 2分間。新しいチューブに上部の水相を転送します。
8. 、等量のクロロホルムを加え、ボルテックスで激しく混合し、2分間遠心します。新しいチューブに上部の水相を転送します。
9. DNAを沈殿させ、最終0.3 Mの濃度、および100％エタノール（氷冷）の2.5倍量には0.1μg/μL、酢酸ナトリウムの3 Mの最終濃度にグリコーゲンを追加します。コンテンツを収集し、-80°CO / Nでチューブを配置するために、短時間遠心分離を混合する渦。
10. 次の日は、16,000×gで30分間サンプルを遠心分離し、30分間、4°C。ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。
11. 16,000×gでペレットや遠心分離機に80％エタノール（氷冷）の500μLを加え、4℃で10分間。 RTでDNAペレットを空気乾燥し、完全にヌクレアーゼフリー水50μLに再懸濁します。 -20℃でDNAサンプルを保管してください。

定量化PIC活動6. PCRアッセイ

注：プライマーの2セットとPCRの2シーケンシャルラウンドを採用しネステッドPCR戦略によって定量化された標的DNAに組み込まれたHIV-1 DNAのコピー数。

1. 統合されたHIV-1 DNAの接合部を増幅するために（それぞれ、LTRとphiX174プライマー）ウイルスのLTRおよびphiX174 DNAを標的とするプライマーを用いて、第1ラウンド従来のPCRを行います。
   1. 表3に記載されているように第一ラウンドPCR混合物を組み立てます。鋳型DNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、別々のPCRチューブに45-μLアリコートを分配し、鋳型DNAまたはヌクレアーゼフリー水（コントロール）の5μLを追加します。
   2. 表4に、推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。
2. 選択的に第一-ROから統合vDNA配列を増幅するために、ウイルスLTR（LTR-RおよびLTR-Uプライマー）の短い領域に隣接するプライマーを用いて、第2ラウンドのqPCRを実行しますウントPCR産物。統合vDNAコピー数を決定するために、既知のコピー数の10倍連続希釈液を使用して標準曲線を生成する（ 例えば、10 ^{0から10まで 8）HIV-1}分子クローンの。
   1. 表5に説明したように、第2ラウンドのqPCR混合物を組み立てます。 96ウェルPCR反応プレート中のウェルの適切な数に25μLのアリコートを分配慎重に、テンプレートDNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、その後、未精製の第一ラウンドのPCR産物またはヌクレアーゼフリー水を5μLを追加（コントロール）。三重ですべてのqPCR反応を実行します。
   2. リアルタイムPCR装置にPCRプレートをロードし、 表6に推奨サイクリング条件を用いて定量PCRを行います。
   3. 適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。

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結果

HIV-1のPICの単離

急性感染のSup-T1細胞からのHIV-1のPICの単離のために使用されるプロトコルの概略図を図1に示されています。このプロトコルは、エンゲルマンらによって記載された方法に由来します。 ^19、20。 HIV-1のPICは、感染細胞内で組み立てら...

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ディスカッション

レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合^{6、7、18を}?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphate-buffered Saline (PBS) (1x)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T cells (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect transfection reagent	Qiagen	301107
DNase 1	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Sup-T1 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7.2 - 7.5 (ready-to-use solution)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Potassium chloride (KCl) solution	Sigma-Aldrich	60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replicative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F primer: 5’-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3’ PhiX174-R primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick gel extraction kit	Qiagen	28706
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) buffer (100x)	Sigma-Aldrich	T9285
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/mL ready-to-use solution)	Qiagen	19131
Phenol (equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0 and 1 mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glycogen (5 mg/mL solution)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Sodium acetate (3 M, pH 5.2)	Sigma-Aldrich	S7899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
First round LTR primer: 5’-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3’ First round phiX174 primer: 5’-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	---
Second round LTR-R primer: 5’-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3’ Second round LTR-U primer: 5’-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3’ Second round Taqman probe:  5’-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3’	Invitrogen and/or IDT-DNA	---
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862