头孢哌酮治疗小鼠模型的临床相关的<em&gt;艰难梭菌</em&gt;应变R20291

摘要

该协议概述了使用临床相关和转听话应变，R20291 艰难梭菌感染（CDI）的头孢哌酮小鼠模型。临床疾病的监测， 艰难梭菌细菌枚举，毒素的细胞毒作用，并在小鼠模型中在整个CDI病理学改变强调在协议中详述。

摘要

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

引言

艰难梭菌是一种厌氧，革兰氏阳性，形成孢子的杆菌引起危及生命的腹泻^1。 艰难梭菌感染（CDI）与日益增多的人类发病率和死亡率，并导致每年^1-4医疗费用相关的超过480十亿$。在2013年，美国疾病控制和预防归类难辨作为一项紧迫抗生素耐药性的风险，这表明它对公众健康的¹紧迫的威胁。目前，万古霉素抗生素治疗和甲硝唑被认为是照顾的CDI ⁵标准。不幸的是，CDI复发成功治疗后用抗生素为高，在20发生-的患者^2,5-7 30％。因此，新的治疗剂的发现对这种肠道病原体是必要的。为了评估对难辨梭状芽孢杆菌 ，动物模型近似交流人类疾病治疗需要linically相关的应变。

最初，柯赫氏法则是在1977年用克林霉素治疗的叙利亚仓鼠模型建立⁸ 艰难梭菌 。这种模式是今天仍然利用探讨发病^9,10的难辨梭状芽孢杆菌毒素的作用。然而，CDI在仓鼠模型导致高死亡率和不近似慢性阴险疾病表现可与CDI ^10,11人看到。根据在研究鼠平台的辅助和试剂可用性，CDI的小鼠模型是相关的。

在2008年，CDI的健壮小鼠模型，通过用在饮用水3天之后克林霉素¹²腹膜内注射抗生素混合物（卡那霉素，庆大霉素，粘菌素，甲硝唑，万古霉素）治疗的小鼠建立的。这种小鼠呈现易受CDI和严重的结肠炎。依靠ING上施用接种的剂量，可以使用该模型被观察到的范围内的临床症状和杀伤力。因为这个时候，各个抗生素疗法已调查了改变的鼠肠道菌群，降低到艰难梭菌可以定植在胃肠道的点定植抗力（在最佳等人审查。和罗礼＆Young的^）13,14。

最近，一种广谱头孢菌素，头孢哌酮，饮用水中的给定的5天或10天重复地呈现小鼠易感CDI ^15。由于第三代头孢菌素的管理都与人类的CDI的风险增加，使用头孢哌酮模型更准确地反映自然发生的疾病^16。头孢哌酮治疗小鼠容易艰难梭菌受到挑战既艰难梭菌芽孢和范围在临床多种菌株的营养细胞相关性和毒力^17。尽管出现了一些利用难辨营养细胞的感染形式的原始研究， 艰难梭菌芽孢被认为是传动装置¹⁸的主要方式。

在过去十年中， 艰难梭菌 R20291，一个NAP1 / BI / 027株，已经出现，造成CDI ^19,20流行。我们试图确定疾病的临床过程时头孢哌酮处理的小鼠用临床相关和基因-易于处理艰难梭菌菌株，R20291挑战。该协议细节的临床过程，包括体重减轻，细菌定植，毒素的细胞毒性，并与艰难梭菌 R20291孢子攻击的小鼠的胃肠道组织病理学变化。总体而言，这种小鼠模型被证明是CDI近似人类疾病的宝贵的实验平台。此其特征小鼠模型因此可用于评估的影响对临床疾病的改善和关于对艰难梭菌定植抗力的恢复新颖治疗剂。

研究方案

伦理声明:
机构的动物护理和使用委员会（IACUC）的兽医北卡罗莱纳州立大学（NCSU）批准了这项研究。北卡罗莱纳州立大学的动物护理和使用政策适用于在北卡罗莱纳州立大学的1985年实验动物设施动物福利法与健康研究扩展法案规定的标准和准则，坚持以指南为照顾和实验动物使用中规定的准则。动物的健康状态，每天进行评估和垂死的动物被人道地用CO ₂窒息，再进行二次措施实施安乐死。训练有素的动物技术人员或兽医在本研究中进行畜牧业在AAALAC认证的设施。

1.饮用水管理的抗生素头孢哌酮，实现敏感性艰难梭菌定植与疾病

注意:5至8周龄的C57BL / 6野生型小鼠（雌性和雄性）在开始抗生素水施用前被购买和隔离1周。检疫之后，小鼠被安置与蒸压食品，床上用品和水。笼变化在层流罩中进行由实验室工作人员每周。

1. 在无菌蒸馏水中挑战的目标天（ 图1）之前，至7天制备头孢哌酮（0.5毫克/毫升）。
2. 装满水头孢哌酮蒸压水瓶（0.5毫克/毫升），并放置在每个鼠笼。
   注:新鲜制备的头孢哌酮水应在5天的时间进行，并变出每2天，如在步骤1.1和1.2表示。建议适当处置以下的机构环境，健康和安全准则头孢哌酮水。
3. 后头孢哌酮水5天，用高压灭菌水瓶充满无菌蒸馏水更换瓶。给予小鼠本饮用水在实验的持续时间。

2. 艰难梭菌孢子接种的制备及小鼠口服灌胃

注:在开始之前，确保以下物品被放置在厌氧室中至少24小时:1×磷酸盐缓冲盐水（PBS;参见材料），牛磺胆环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂（TCCFA）板（参见材料和辅助文件），和无菌L形吊具。

注:与艰难梭菌芽孢攻击小鼠应在二级生物安全水平动物设施被安置。

1. 得到所需的应变（在这种情况下，R20291），该先前制备并贮存在4℃下在无菌水中^21,22的艰难梭菌芽孢的库存。事先确定此孢子股票的枚举使用。
2. 基于已知浓度的孢子股票的（孢子/ ml），计算所期望的稀释到每25微升得到10 ⁵孢子。确保接种量足以所有接种在小鼠实验中（每只小鼠25微升），进行接种枚举（约30微升），并考虑到移液错误。
3. 涡原有的艰难梭菌芽孢的股票。然后，悬浮计算体积（来自步骤2.2）一个螺旋盖微量离心管内的无菌水原艰难梭菌芽孢的股票。在层流罩有氧执行此。标识该稀释的混合物作为"孢子接种物"。
4. 放置孢子接种到65℃水浴中并加热它为20分钟。
   注意:此步骤将确保只有有源艰难梭菌芽孢保持热处理后。
5. 在层流罩，取50微升加热孢子接种，将其放置在无菌的离心管中，并把它传递到厌氧室^23。使用这个样本孢子枚举。
6. 在层流罩，装载其余热孢子接种INTOA 1-ml注射器附连到无菌的灯泡尖灌胃针。利用手动注射器步进，以确保准确和快速重复小鼠之间的剂量。确保灌胃针填充有在使用之前被加热的孢子接种物。
   注:一个新的无菌灌胃针每只小鼠是不需要的。然而，如果各种剂量艰难梭菌芽孢的给药，一个新的管饲针建议每次剂量。
   注: 艰难梭菌芽孢是对传统消毒剂高度耐药。因此，使用一杀孢子消毒剂，如＃62 Perisept杀芽孢消毒剂，是必要的。厂家建议2分钟的接触时间摧毁艰难梭菌芽孢。
7. 灌胃小鼠各25微升孢子接种。由颈部松弛皮肤和背面，以便固定头部抓动物轻轻抑制各小鼠。用食指进一步固定动物的头部和细长食道。确保动物不发声或约束时显示的苦恼等体征。
   注:灌胃小鼠的总体积不应超过10毫升/公斤体重（0.1毫升/ 10克）。
8. 保持在直立，垂直位置鼠标和灌胃针轻轻通入口的侧面。直接灌胃针沿口的屋顶和灌胃针缓慢前进到食道。
   注意:如果遇到任何阻力，灌胃针可进入气管，因此不应该先进，而是取出并立即重新定位。
9. 灌胃针是约一半进入食道后，注入25微升加热孢子接种并轻轻撤出从食道的灌胃针。
   注:灌胃针的坚强进步可能导致食道或胃的破裂。因此，如果电阻推进灌胃针时遇到，最好立即删除，并重新定位灌胃针。
10. 返回动物笼子，观察它的任何咳嗽或呼吸困难的症状，因为这可能表明无意气管管理或加热孢子接种的愿望。
    注:小鼠有以下抗生素治疗极易患上难辨 ;因此，预防措施，以防止交叉污染的笼子是必不可少的。管理抗生素治疗，但受到挑战的小鼠作为对照组时，这是特别重要的。
11. 接种所有小鼠后，将剩余的热孢子接种到无菌的离心管中，并把它传递到孢子枚举厌氧室。
12. 用于加热的孢子接种物的枚举（来自步骤2.4），剩余的管饲加热孢子接种物，使在1×PBS中的每个接种物的1:10系列稀释。它建议，使和板4 - 5稀释液（ 即，10 ^-1通过10 ^-5）。
13. 使用无菌技术，转移100微升每个串行稀释到个人TCCFA板。
14. 使用无菌L形吊具，均匀地分布施加到整个板的培养基中的稀释液。即使在稀释接种物的扩频为孢子的准确枚举必不可少的。
15. 孵育所述板厌氧24小时，在37℃。 24小时后， 艰难梭菌菌落形成单位（CFU的）可以举出以获得在25微升（0.025毫升）体积施用于小鼠感染剂量（参见补充文件"实施例计算"）。 难辨梭状芽孢杆菌菌落平坦，淡黄色，并有不规则的边缘和毛玻璃外观^24。
    注:检测细菌计数限为10 CFU ^2。

疾病3.监测老鼠体重减轻和临床症状整个艰难梭菌感染

1. 权衡之前和5天头孢哌酮抗生素治疗后nimals，为期2天的恢复关闭的抗生素（0天）后，然后在实验的持续时间。
   注:每天在一个一致的时间获得的权重。权重得到的挑战（第0天）一天应作为初始基准重量为整个艰难梭菌感染的比较。
2. 将数字刻度成生物安全柜。放置一个无菌塑料烧杯上的规模和去皮塑料烧杯的重量。然后，轻轻的尾巴的基部拿起小鼠，并将其放置到塑料烧杯中。
   1. 放置烧杯背面上的刻度。将鼠标悬停一拱手烧杯的顶部，以确保鼠标没有逃脱。它可能需要2 - 3秒以获得稳定的重量。然后，鼠标轻轻放回笼子里。记录这个重量，重复该过程在笼子里每只小鼠。
      注:当务之急是采取预防措施，以防止交叉contamina获得权重的笼之间的重刑。小鼠每笼应该有称量其自己的塑料烧杯中。塑料烧杯每次使用之间的杀孢子剂进行消毒，并盖上无菌铝箔。
3. 每日两次（至少）为临床上严重的艰难梭菌感染的迹象，包括嗜睡，食欲不振，腹泻等，以及弯腰驼背的姿势监视攻击的动物。
4. 入道安乐死即失去其初始基线体重的20％的动物和/或开发艰难梭菌感染（在步骤3.3中列出）的严重临床症状。
   注:在实验期间根据需要，以确保它们没有失去其初始基线体重的20％的小鼠显示艰难梭菌感染的临床体征应进行权衡。在实验中早期时间点，这可能意味着每日两次测量。

4. 难辨梭状芽孢杆菌细菌计数从小鼠粪便和盲肠内容

注:在开始之前，确保以下物品被放入厌氧室中至少24小时:1×PBS中（参见材料），TCCFA板（参见材料），无菌L形吊具，和无菌的离心管和/或PCR板进行稀释。

1. 获取样本艰难梭菌枚举
   注:在获得粪便或盲肠内容，称在分析大规模无菌离心管。记录在管的一侧的管的重量，四舍五入至小数点后四位（ 例如，0.9864克）。记这个重量的"重管"。收集每个样品应置于无菌，称重微量离心管。
   1. 老鼠粪便收集无菌
      1. 由颈部松弛皮肤和背面，以便固定头部抓动物轻轻抑制各小鼠。用小指轻轻抑制动物的尾巴，THUS露出肛门。确保动物不发声或约束时显示的苦恼等体征。
      2. 保持无菌的，称重的离心管直属动物的肛门。当务之急是管不来与老鼠的直接接触。
         1. 当动物排便，收集粪便颗粒进入管。保持所述管在室温下，直到所有的粪便样品被收集。它可能需要几分钟的鼠标排便，因此需要重复尝试收集粪便。
      3. 称量载有分析天平屎管。记录该管重量，四舍五入至小数点后四位（ 例如，1.0021克）。表示获得的重量为"最后的管的重量。"
      4. 粪便收集后直接传递粪便标本进入厌氧培养室进行细菌计数。
   2. 鼠标盲肠内容无菌收集在尸检时
      1. 通过CO ₂窒息，再进行二次措施人性化的安乐死后，进行尸检，以获得盲肠^25。盲肠是胃肠道的大，逗号形截面。
      2. 放置在盲肠上无菌塑料培养皿。使用一次性的，无菌无。 10手术刀刀片切割盲肠开放从袋的封闭端，以暴露盲肠内容物。
         1. 轻轻轻微用力用手术刀刀片和席卷向盲肠切开部分内容解压盲肠内容物。
            注:应注意不要扰乱盲肠组织，这将进行组织病理学检查提交。
      3. 放置盲肠内容到立即收集下列无菌的，称重微量离心管。只有大约10盲肠内容毫克所需的细菌枚举。
      4. 称量含在分析财政盲肠内容管即记录该管重量，四舍五入至小数点后四位（ 例如，1.0021克）。表示获得的重量为"最后的管的重量。"
      5. 通过盲肠内容样本进入厌氧培养室进行细菌计数。
2. 艰难梭菌的细菌计数
   1. 计算的将要列举的艰难梭菌的内容（粪便或盲肠）最终重量。从减去"总决赛管重量"执行该"管的重量。"
   2. 计算1:10稀释的内容到1X PBS中，并相应地重悬。对粪粒，用吸移管的尖端，以沉淀轻轻打乱成溶液（参见补充文件"实施例计算"）。
   3. 厌氧孵育在室温下这些悬浮的样品30分钟，使内容沉降。
   4. 使系列稀释于1×PBS中每个样品枚举每克含量（粪便或盲肠）的CFU的累加器。厌氧执行此。
   5. 使用无菌技术，转100每微升连续稀释至TCCFA板。使用无菌L形吊具，散布施加到介质稀释横跨板均匀分布的。即使在稀释的扩展是用于菌落精确计数是必不可少的。
   6. 孵育所述板厌氧24小时，在37℃。此时，枚举梭状菌落，以获得每克含量（粪便或盲肠）的CFU。 难辨梭状芽孢杆菌菌落平坦，淡黄色，并有不规则的边缘和毛玻璃外观^24。
      注意:此协议可用于从其它鼠胃肠内容，包括回肠和结肠内容列举艰难梭菌 。 PCR板可用于制造连续稀释。

5.细胞的Vero细胞毒性检测量化艰难梭菌毒素Cytotoxi市

注:建议该测定的小鼠模型上在尸检收集并储存在-80℃下的样品完成之后进行。无菌细胞培养技术是本测定期间防止Vero细胞的污染是必不可少的。该协议需要2天进行。所有粪便和在该试验中使用的肠内容必须存储在一个称重，无菌的离心管（与表示为"管的重量，"见上部分）。最终的管重量（包括内容）经由分析规模到最近的四个小数位测定（参见上文部分）。一个多通道移液器，建议使用用于该测定。

注:在开始之前，请确保以下项目可用:Vero细胞，贝科的10％热灭活胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素媒体（表示为"DMEM 1X Eagle培养基（DMEM）1X修改媒体;"见材料和辅助文件），0.25％胰蛋白酶-EDTA，1×PBS中，0.4％台盼蓝，在96孔细胞培养平底板，96孔过滤板， 艰难梭菌毒素A（等分试样在3微升1微克/微升的超纯水和存储在-80℃下）， 艰难梭菌抗毒素，一个工作表（用于计算和板地图;见补充文件）。

注:应注意这个实验人员暴露于艰难梭菌及其毒素期间进行。

1. 拆分Vero细胞（1天）
   1. 预热的DMEM 1x介质，0.25％胰蛋白酶-EDTA，和1x PBS在37℃水浴中。
   2. 从细胞培养培养箱中（37℃和5％的CO _2）获得的Vero细胞的烧瓶中，并放置在无菌的细胞培养层流罩。使用70％的乙醇擦拭下来使用前罩和设备。使用血清学吸管，从组织培养瓶中吸媒体从Vero细胞取出，并并弃置于废Çontainer。
   3. 冲洗Vero细胞用5毫升1×PBS中的（预热）在组织培养烧瓶中。吸出PBS并丢弃到废物容器中。
   4. 5毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA的添加到组织培养烧瓶中。允许2的接触时间 - 3分钟。在此期间，观察细胞开始脱落烧瓶表面。轻轻摇动组织培养瓶一边到另一边松开Vero细胞。
   5. 后接触时间胰蛋白酶-EDTA，立即加5的10ml DMEM 1x介质的进入组织培养烧瓶中。这将中和胰蛋白酶-EDTA。使用此溶液轻轻洗任何未附着的Vero细胞离烧瓶的背面。然后，使用血清吸管向此混合物转移到15毫升锥形管中。
   6. 离心在锥形管中的Vero细胞在180 xg离心5分钟和25℃。确保离心机是适当的平衡。离心后，在锥形管的底部观察的Vero细胞的可见颗粒。要小心，不要DISRUPT此沉淀。吸掉从锥形管的上清液并丢弃。
   7. 悬浮Vero细胞在3毫升的DMEM 1X媒体。
2. 计数的Vero细胞
   1. 加入100μl的Vero细胞悬液（步骤5.1.7制造）的100微升0.4％台盼蓝的。轻轻地上下吹打混合溶液。
   2. 添加10微升该混合物到血球的各腔室。
   3. 计数活细胞的血细胞计数仪的四个象限内的数目。死Vero细胞会占用台盼蓝，因而将被染成蓝色（这些细胞不应该被计算在内）。在记录这些数字"的Vero细胞表"提供。
   4. 综上所述活Vero细胞中的所有四个象限的总数目，并计算平均值。乘以稀释因子，其值为2，因为将100μl细胞是在共200微升的液体。
   5. 由校正系数相乘，得到"细胞数/ ml的"当使用血细胞计数器中，校正因子是总是10 ⁴由总体积以得到正片。"细胞总数"。
3. 确定井必需的数量为每个实验
   注:单一样本（或粪便或肠内容物）需要一式两份，进行24个独立的井。每孔10 ^5个 Vero细胞的浓度（90微升总体积）是必需的。
   注意:如果一个人希望孵育Vero细胞的96孔板在37℃下，每孔10 ³ Vero细胞的浓度过夜，建议考虑延长的温育时间。维拉的工作表单元格内的计算需要进行调整以适应这种变化。
   1. 确定可以基于可用的Vero细胞的量使用井的数量（来自步骤5.2;使用的Vero细胞表，提供）。
   2. 确定的体积需要填充所需井的数量Vero细胞悬浮液（基于样品的数量被测试）。确保任何额外的容量在增加以弥补移液错误（使用所提供的Vero细胞表）。
   3. 稀释在DMEM 1x介质的Vero细胞悬浮液（步骤5.1.7获得）以获得用于实验所需的体积。
4. 播种Vero细胞到96孔细胞培养板
   1. 从步骤5.3.2使用Vero细胞重悬浮，使用多通道移液器以90微升Vero细胞悬浮液添加到96孔细胞培养平底板的每个孔中。
   2. 孵育的Vero细胞在细胞培养孵化该板在37℃和5％CO ₂的加入毒素（样本）至孔之前至少4小时的。此温育时间将允许Vero细胞附着到每个孔的底部。
5. 创建从样品股票解决方案（或粪便肠内容物）
   注:所有的样品应该有"重管"和"最后的管重量"通过分析量表测量。用于计算的Vero细胞表。
   1. 计算的内容物的重量。转换克至毫克，然后毫克至微升。计算作1:10稀释在1×PBS中所需的溶液微升的最终总数量。计算1×PBS中的总量可添加到样品中。
   2. 1×PBS中（如上计算）的总体积加至样品。有氧执行此，并使用无菌技术。对粪粒，使用吸管尖轻轻扰乱小球在溶液中。
   3. 涡样品，然后在3522 xg离心离心它们在室温下5分钟。确保离心机是适当的平衡。要小心，不要破坏颗粒和悬浮样品成溶液。
      注:在步骤5.5.3，如果只有几个样品被处理，内容可以通过灭菌并使它们通过一个单一的0.22μm的过滤器，而不是使用96孔过滤板的。一些样品可能需要多个过滤器，以消毒使用这种技术的全部体积的内容。
   4. 通过取150微升上清液，将其放置到单独的孔中在96孔过滤板消毒样品/ PBS混合物。放置过滤板牢固地在96孔细胞培养平底板的顶部，使得内容将过滤到该板。
   5. 离心过滤板/细胞培养板堆在431 xg离心在室温下5分钟。确保该离心机是适当的平衡，并且过滤板/细胞培养板堆被紧密对准并且离心分离过程中不会移动。
      注:这些过滤内容，将在稀释板被利用的10 ^-1库存。
   6. 放置板用过滤的样品在冰上。
6. 创建稀释板＃1
   注:中国人民解放军稀释TE＃1（DP＃1）将要求每个样品6口井，包括正面（ 艰难梭菌毒素A）和阴性（1X PBS）控件（参见上的Vero细胞表的DP＃1布局）。
   1. 为了制备用于该测定法的阳性对照（ 艰难梭菌毒素A），得到-80℃的3微升等分试样（1微克/微升），并添加297微升的超纯水，得到0.01微克/微升的最终浓度。广场上冰。
   2. 与他们的稀释液（10 ^{-1〜10 -6）}每个样品标记的孔，并指明阳性和阴性对照（参见DP＃1的布局）。
   3. 加1×PBS中的合适的量向每孔中。在10 ^-1井，增加NO PBS。为10 ^-2至10 ^-6井，添加90微升1×PBS中。
   4. 加样品的适当的量向每孔中。在10 ^-1井，加100微升10 ^-1股，用于每个样品（请参阅从过滤器开发平台5.5.7步E）。为10 ^-2至10 ^-6井，使连续稀释;通过从10 ^-1以及采取10微升和它添加到10 ^-2井开始。继续连续稀释到10 ^-6稀释度。
   5. 覆盖DP＃1板用透明胶的粘接密封，将它放在冰上。
7. 创建稀释板＃2
   注:稀释板（DP＃2）将需要2个车道6口井的每个样本，包括阳性和阴性对照（请参见Vero传代细胞表的DP＃2布局）。
   1. 与他们的稀释液（10 ^{-1〜10 -6）}每个样品标记的孔，并指明阳性和阴性对照（见DP＃2的布局）。标记与样品名称（表示为"样品井"）或与抗毒素的样品名称（表示为"抗毒素孔"）的孔中。
   2. 计算抗毒素的该测定所需的量。注:抗毒素是25倍的股票的解决方案，需要在1×PBS中稀释1:25。广场上冰准备抗毒素1X解决方案。
   3. 为"样品井，"添加20微升1×PBS中，以每个孔用于该样本的所有稀释液（10 ^-1至10 ^-6）。为"抗毒素井，"添加20微升1×抗毒素的到各孔中该样本的所有稀释液（10 ^-1至10 ^6个 ）。
   4. 转让20微升的稀释样品的井DP从1号到指定孔的DP＃2行1 - 6和行7 - 12（请参见Vero传代细胞表的DP＃2布局）。吹打向上和向下轻轻搅拌溶解。
   5. 盖DP＃2用透明胶的粘接密封，并允许在室温下40分钟孵育。该温育是允许抗毒素结合并因此灭活且中和的艰难梭菌毒素。
   6. 孵化后，从DP＃2加入10微升混合到适当的Vero细胞孔中（请参见伏的Vero细胞板布局ERO细胞表）。轻轻混匀通过上下吹打，注意不要破坏被附着到孔的底面的Vero细胞的溶液。
   7. 过夜孵育Vero细胞板在细胞培养培养箱中于37℃和5％的CO _2。
8. 评估使用光学显微镜对舍入Vero细胞（第2天）
   注:回想一下，通过10倍稀释因子变化添加样品的混合物到Vero细胞板时（ 例如，10 ^-3现在是10 ^-4）。具有抗毒素目前富国应该有很少或几乎没有Vero细胞四舍五入指出。 Vero细胞四舍五入（细胞毒性）将含有艰难梭菌毒素样品中注明。如果细胞毒活性在含有样品和抗毒素稀释中和，产生的Vero细胞的细胞毒性的艰难梭菌毒素的存在被确认。
   1. 使用二极管灯检查Vero细胞四舍五入在200倍的显微镜牛逼。对于样品孔（包括阳性对照），记录这是最后有80％的Vero细胞四舍五入指出，良好的稀释。
   2. 计算出的细胞毒性效价，这被定义为产生的每克样品的80％的Vero细胞变圆的最高稀释度的倒数。例如，如果最高稀释度为10 ^-5，则稀释因子将是10 ^-6对于该样本。因此，日志[最终稀释因子] /样品克将被记录^[106]，它产生的6倒数滴度。
      注:Vero细胞需要经历至少3 - 4通道和不超过30代之前将其用在该测定^26。

结果

期间的代表性研究中，5周龄的C57BL / 6野生型小鼠用头孢哌酮在其饮用水中（0.5毫克/毫升）预处理5天，并允许一个2天的洗出与普通的饮用水。小鼠用经由在第0天（ 图1A）口服强饲法10 ⁵孢子梭状 R20291的挑战。小鼠14天的CDI体重减轻和临床症状（嗜睡，食欲不振，腹泻，和驼背姿势）进行了监测。 C57BL / 6 WT小鼠艰难梭菌 R20291孢子的挑战导?...

讨论

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue	Gibco	15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin	Gibco	15070-063
10% heat inactivated FBS	Gibco	16140-071	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap	Corning	430917
96 well cell culture flat bottom plate	Costar Corning	CL3595
96 well filter plate	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose	Fisher	L95500	Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous)	Sigma	M2643	Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filter for TCCFA plates
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Part of TCCFA plates (see below)
NaCl	Fisher	S640-3	Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade	Miltex, Inc	4-410
PCR Plates	Fisherbrand	14230244
Plastic petri dish	Kord-Valmark Brand	2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader	Fisherbrand	14-665-230
Syringe Stepper	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664	Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope	Olympus Life Science
DP27 camera	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Life Science