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Method Article
Dieses Protokoll beschreibt die Cefoperazon Maus - Modell von Clostridium difficile - Infektion (CDI) eine klinisch relevante und genetisch-lenkbar - Stamm verwenden, R20291. Schwerpunkt auf der klinischen Krankheitsüberwachung, C. difficile Bakterien-Enumeration, Toxin Zytotoxizität und histopathologischen Veränderungen im gesamten CDI in einem Mausmodell werden im Protokoll aufgeführt.
Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.
Clostridium difficile ist ein anaerob, grampositive, sporenbildenden Bazillus, der lebensbedrohlichen Durchfall 1 verursacht. C. difficile - Infektion (CDI) ist mit einer erhöhten menschlichen Morbidität und Mortalität und die Ergebnisse in mehr als $ 4,8 Mrd. Kosten für das Gesundheitswesen pro Jahr 1-4 verbunden. Im Jahr 2013, kategorisiert die Centers for Disease Control and Prevention C. difficile als dringende Antibiotikaresistenz Risiko, was darauf hinweist , dass es eine dringende Gefahr für die öffentliche Gesundheit 1 darstellt. Derzeit Antibiotika - Behandlung mit Vancomycin und Metronidazol sind die Standardbehandlung für CDI 5 betrachtet. Leider ist Rezidiv von CDI nach erfolgreicher Behandlung mit Antibiotika hoch, in 20 auftretenden - 2,5-7 30% der Patienten. Deshalb ist die Entdeckung neuer Therapeutika gegen diese magensaftresistente Erreger notwendig. Zur Beurteilung Therapeutika gegen C. difficile, einem Tiermodell der Krankheit beim Menschen in ac annähertlinically relevante Belastung benötigt wird.
Zunächst wurden Koch-Postulate für C. difficile im Jahr 1977 mit einer Clindamycin-behandelten syrischen Hamstermodell 8 etabliert. Dieses Modell wird auch heute noch verwendet auf Pathogenese 9,10 , die Auswirkungen von C. difficile Toxine zu untersuchen. Allerdings CDI im Hamstermodell führt zu einer hohen Sterblichkeit und nicht die chronische heimtückische Krankheit Manifestationen nähern , die bei Menschen mit CDI 10,11 gesehen werden kann. Auf der Grundlage der Zugänglichkeit und Verfügbarkeit von Reagenz murine Plattformen in Forschung, ist ein Mausmodell der CDI relevant.
Im Jahr 2008 wurde mit einem Antibiotikum - Cocktail durch Behandlung von Mäusen eine robuste Mausmodell der CDI etabliert im Trinkwasser (Kanamycin, Gentamicin, Colistin, Metronidazol und Vancomycin) für 3 Tage , gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von Clindamycin 12. Dies machte Mäuse anfällig für CDI und schwere Colitis. Abhängening auf der Inokulum Dosis verabreicht werden, können eine Reihe von klinischen Anzeichen und Letalität beobachtet werden dieses Modell. Seit dieser Zeit haben sich verschiedene Antibiotika - Anwendungen untersucht worden, die die murinen Darmmikrobiota verändern, Kolonisationsresistenz bis zu dem Punkt abnimmt , wo C. difficile den Magen - Darm - Trakt besiedeln können ( beschrieben in Best et al. Und Lawley & Young) 13,14.
In jüngster Zeit ein breites Spektrum Cephalosporin, Cefoperazon, rendert in dem Trinkwasser gegeben für 5 oder 10 Tage reproduzierbar Mäuse anfällig für CDI 15. Da die Verabreichung von Cephalosporinen der dritten Generation mit einem erhöhten Risiko von CDI beim Menschen assoziiert sind, reflektiert Verwendung des Cefoperazon Modell genauer natürlich vorkommenden Krankheits 16. Cefoperazon behandelten Mäuse anfällig für C. difficile wurden sowohl mit C. difficile - Sporen und vegetativen Zellen von einer Vielzahl von Stämmen Bereich in Frage gestellt worden klinischenRelevanz und Virulenz 17. Trotz einiger der ursprünglichen Studien C. difficile vegetativen Zellen als infektiöse Form verwendet werden C. difficile - Sporen die wichtigste Übertragungsart 18 betrachtet.
In den letzten zehn Jahren, C. difficile R20291, ein NAP1 / BI / 027 - Stamm hat, entstanden Epidemien von CDI 19,20 verursacht. Wir versuchten , den klinischen Verlauf der Erkrankung zu bestimmen , wann Cefoperazon-behandelten Mäusen mit klinisch relevanten und genetisch tractable C. difficile - Stamm, R20291 herausgefordert wurden. Dieses Protokoll beschreibt die klinischen Verlauf, einschließlich Gewichtsverlust, bakterielle Kolonisation Toxin - Zytotoxizität und histopathologische Veränderungen im Gastrointestinaltrakt von Mäusen , die mit C. difficile - Sporen R20291 in Frage gestellt. Insgesamt erweist sich dieses Mausmodell eine wertvolle experimentelle Plattform für CDI annähert Krankheit beim Menschen zu sein. Dieses gekennzeichnet Mausmodell kann somit genutzt werden, um die Auswirkungen zu beurteilenneuartiger Therapeutika auf der Verbesserung der klinischen Erkrankung und über die Wiederherstellung der Kolonisierung Widerstand gegen C. difficile.
Ethische Erklärung:
Die Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der North Carolina State University College of Veterinary Medicine (NCSU) genehmigt diese Studie. Die NCSU Animal Care und Use Policy gilt Normen und Richtlinien , die in der Tierschutzgesetz und Gesundheitsforschung Extension Act von 1985 Labortieranlagen in NCSU her für die Pflege und Verwendung von Labortieren im Leitfaden auf Richtlinien halten. Das Tiergesundheitsstatus wurden täglich bewertet und sterbender Tiere wurden artgerecht von CO 2 Ersticken gefolgt von Sekundärmaßnahmen eingeschläfert. Ausgebildete Tierpfleger oder ein Tierarzt durchgeführt Tierhaltung in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung während dieser Studie.
1. Gabe des Antibiotikums Cefoperazon in Trinkwasser zu erreichen Empfänglichkeit für C. difficile Kolonisation und Erkrankung
HINWEISE: 5- bis 8 Wochen alte C57BL / 6-WT-Mäuse (Frauen und Männer)vor Beginn der Antibiotika Wasser Verabreichung wurden gekauft und für 1 Woche unter Quarantäne gestellt. Nach der Quarantäne wurden die Mäuse mit autoklaviert Essen, Bettzeug und Wasser untergebracht. Cage Änderungen wurden in einer Laminar-Flow-Haube wöchentlich durch Laborpersonal durchgeführt.
2. Herstellung der C. difficile Spore Inokulum und die orale Gabe der Mäuse
HINWEIS: Vor dem Beginn sicher, dass die folgenden Elemente in der anaeroben Kammer platziert sind mindestens 24 h: 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; siehe Materialien), taurocholate cycloserine Cefoxitin Fructose-Agar (TCCFA) Platten (siehe Materialien und die zusätzliche Datei ) und eine sterile L-förmigen Spreader.
HINWEIS: Die Mäuse mit C. difficile - Sporen in Frage sollte in einem Biosafety Level 2 Tieranlage untergebracht werden.
3. Überwachung Maus Gewichtsverlust und klinischen Anzeichen einer Krankheit in ganz C. difficile - Infektion
4. Bakterielle Auszählung von C. difficilevon Maus-Exkremente und Blinddarm Inhalt
HINWEIS: Vor dem Beginn sicher, dass die folgenden Artikel in der anaeroben Kammer platziert sind mindestens 24 h: 1x PBS (siehe Materialien), TCCFA Platten (siehe Materialien), eine sterile L-förmige Spreizer und sterile Mikrozentrifugenröhrchen und / oder PCR-Platten für Verdünnungen.
5. Vero - Cell - Zytotoxizitätstest zu Quantifizieren C. difficile Toxin CytotoxiStadt
HINWEIS: Es wird empfohlen, dass dieser Assay nach Beendigung des Mausmodells an Proben bei der Nekropsie und gelagert bei -80 ° C gesammelt durchgeführt werden. Aseptische Zellkulturtechniken sind für die während dieser Test Kontamination von Vero-Zellen zu verhindern. Dieses Protokoll dauert 2 Tage durchzuführen. Alle Kot und Darminhalt in diesem Test verwendeten müssen in einem gewogen, sterile Mikrozentrifugenröhrchen gelagert werden (bezeichnet mit dem "Rohr Gewicht", siehe Abschnitt oben). Das endgültige Rohrgewicht (einschließlich des Inhalts) über einen analytischen Maßstab auf die nächsten vier Dezimalstellen gemessen wird (siehe Abschnitt oben). Verwendung einer Mehrkanalpipette wird für diesen Test empfohlen.
HINWEIS: Vor dem Beginn sicher, dass die folgenden Elemente stehen zur Verfügung: Vero-Zellen, Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 1x mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin Medien (bezeichnet als "DMEM 1x Medien, "Materialien und die zusätzliche Datei sehen), 0,25%Trypsin-EDTA, 1x PBS, 0,4% Trypanblau, eine 96-Well - Zellkultur - Flachbodenplatte, eine 96-Well - Filterplatte, Clostridium difficile Toxin A (aliquote in 3 ul bei 1 ug / ul in ultrareinem Wasser und bei -80 ° C), Clostridium difficile Antitoxin, ein Arbeitsblatt (für Berechnungen und Platten Karten; siehe Zusatzdateien).
HINWEIS: Vorsicht ist bei diesem Test für das Personal der Exposition gegenüber C. difficile und dessen Toxin genommen werden.
Während einer repräsentativen Studie, 5 Wochen alte C57BL / 6-WT-Mäuse wurden mit Cefoperazon in ihrem Trinkwasser vorbehandelt (0,5 mg / ml) für 5 Tage und erlaubt eine 2-Tages-auswaschen mit regelmäßigen Trinkwasser. Mäuse wurden mit 10 & sup5 ; Sporen von C. difficile R20291 via Schlundsonde am Tag 0 (1A) herausgefordert. Die Mäuse wurden für 14 Tage für die Gewichtsabnahme und klinischen Zeichen (Lethargie, Appetitlosigkeit, Durchfal...
This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...
The authors have nothing to disclose at this time.
The authors would like to thank Trevor Lawley at the Wellcome Trust Sanger Institute for C. difficile R20291 spores and James S. Guy at the North Carolina State University College of Veterinary Medicine for Vero cells, both utilized in this manuscript. Animal histopathology was performed in the LCCC Animal Histopathology Core Facility at the University of North Carolina at Chapel Hill, with special assistance from Traci Raley and Amanda Brown. The LCCC Animal Histopathology Core is supported in part by an NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) to the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We would also like to thank Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie, and Cassie Schumacher for helpful discussions on the Vero cell cytotoxicity assay protocol. JAW is funded by the Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 by NIH. CMT is funded by the career development award in metabolomics grant K01GM109236 by the NIGMS of the NIH.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
1 ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
Distilled Water | Gibco | 15230 | |
DMEM 1x Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use |
Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5 - 8 weeks of age |
Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
DP27 camera | Olympus Life Science | ||
cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
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