의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련<em&gt; 클로스 트리 디움 디피</em&gt; 스트레인 R20291

요약

이 프로토콜은 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 변형, R20291를 사용 클로스 트리 디움 디피 감염 (CDI)의 cefoperazone 마우스 모델을 설명합니다. 임상 질병 모니터링, C. 디피 세균 열거, 독소의 세포 독성 및 마우스 모델에서 CDI에 걸쳐 조직 병리학 적 변화에 대한 강조는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

초록

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

서문

클로스 트리 디움 디피는 생명을 위협하는 설사 ^일이 발생 혐기성, 그람 양성, 포자 형성 간균이다. C. 디피 감염 (CDI)는 올해 ^{1 ~ 4} 당 의료 비용 이상의 $ 4.8 억 증가 인간의 이환율과 사망률 및 결과와 연결되어 있습니다. 2013 년 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 공중 보건 ¹ 긴급한 위협을 나타내는, 긴급 항생제 내성의 위험으로 C. 디피을 분류. 현재 항생제 반코마이신 치료 및 메트로니다졸은 CDI ^5에 대한 치료의 표준으로 간주됩니다. 환자 ^2,5-7의 30 % - 불행하게도, 항생제 성공적인 치료 후 CDI의 재발은 20에서 발생하는 높은입니다. 따라서,이 장내 병원균에 대한 새로운 치료제의 발견이 필요하다. C. 디피 교류에서 인간의 질병에 근접 동물 모델에 대한 치료제를 평가하려면linically 관련 변형이 필요하다.

처음 코흐의 공리는 클린다마이신 처리 시리아 햄스터 모델 ^(8)을 사용하여 1977 년 C. 디피 위해 설립되었다. 이 모델은 아직 병인 ^{9, 10에} C. 디피 독소의 영향을 조사하기 위해 오늘 사용된다. 그러나, CDI는 햄스터 모델에서 높은 사망률을 초래하고 CDI ^{10, 11와} 인간에서 볼 수있는 만성 교활한 질병의 발현에 근접하지 않습니다. 연구 뮤린 플랫폼 접근성 시약 가용성에 따라, CDI의 마우스 모델에 적합하다.

2008 년 CDI의 강력한 마우스 모델은 클린다마이신 ^(12)의 복강 내 주사 한 다음 3 일간 항생제 물을 마시는 칵테일 (카나마이신, 겐타 마이신, 콜리 스틴, 메트로니다졸, 및 반코마이신)와 쥐를 처리하여 설립되었다. CDI 심각한 대장염에 감염이 렌더링 된 마우스. 따라투여 접종 용량에 보내고, 임상 증상 및 치사율의 범위는이 모델을 사용하여 관찰 할 수있다. 이 시간 이후, 다양한 항생제 요법은 C. 디피는 위장관 식민지 수있는 지점에 식민지 저항을 감소 쥐의 장내 미생물을 변경하는 조사되었다 (베스트 등 검토.을 Lawley & 영) ^{13, 14.}

최근 5 또는 10 일 동안 마시는 물에 주어진 광범위한 스펙트럼 세 팔로 스포린, cefoperazone는 재현성 CDI ^(15)에 민감한 쥐를 렌더링합니다. 3 세대 세 팔로 스포린의 투여는 인간에서 CDI의 위험 증가와 관련되어 있기 때문에, cefoperazone 모델의 사용은 더 정확하게 질병 ¹⁶ 자연 발생 반영한다. Cefoperazone 처리 C. 디피에 민감한 마우스는 C. 디피 포자 및 임상에 이르기까지 균주의 다양한 식물 세포 모두에 도전 한관련성 및 독성 ^17. 전염성 형태로 C. 디피 식물 세포를 이용하여 기존 연구의 일부에도 불구하고, C. 디피 포자 전송 ^(18)의 주요 모드 간주됩니다.

지난 10 년, C. 디피 R20291하는 NAP1 / BI / 027 균주는, CDI ^{(19, 20)의} 전염병을 일으키는 원인이 등장했다. 우리는 cefoperazone 처리 된 마우스는 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 C. 디피 변형, R20291에 도전했을 때 질병의 임상 경과를 결정하기 위해 노력했다. 이 프로토콜은 체중 감소, 세균 식민지, 독소의 세포 독성 및 C. 디피 R20291 포자와 도전 마우스의 위장관에서의 조직 병리학 적 변화를 포함하여 임상 경과를 자세히 설명합니다. 전반적으로,이 마우스 모델은 CDI는 인간의 질병을 근사위한 유용한 실험 플랫폼으로 증명한다. 이 특징으로, 마우스 모델은 이에 영향을 평가하기 위해 사용될 수있다임상 질환의 경감에와 C. 디피에 대한 식민지 저항의 복원에 대한 새로운 치료제의.

프로토콜

윤리 정책 :
동물 용 의약품의 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (NCSU)이 연구를 승인했다. NCSU 동물 관리 및 정책 NCSU에서 1985 년 실험 동물 시설의 동물 복지법 및 건강 연구 연장 법에 명시된 기준과 지침 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 명시된 가이드 라인을 준수를 적용합니다. 동물의 건강 상태를 매일 평가하고, 죽어가는 동물을 인도적으로 차를 측정 한 다음 CO ₂ 질식에 의해 안락사시켰다. 훈련 된 동물 기술자 또는 수의사는이 연구 중에 AAALAC 인증을받은 시설에서 축산을 수행 하였다.

마시는 물에 항생제 Cefoperazone 1. 관리는 C. 디피 식민과 질병에 감수성을 달성하기 위해

참고 : 5 ~ 8 주령 C57BL / 6 WT 마우스 (여성과 남성)이전에 항생제 물 관리를 시작하기 구입 1 주일 동안 격리되었다. 검역 후, 마우스 오토 클레이브 음식, 침구, 물을 보관 하였다. 케이지의 변화는 층류 후드에 실험실 직원이 매주 실시 하였다.

1. 칠일 전에 도전의 대상 일 (그림 1)에 멸균 증류수에 cefoperazone (0.5 ㎎ / ㎖)를 준비합니다.
2. cefoperazone 물 멸균 물 병 (0.5 ㎎ / ㎖)을 입력하고 각 마우스 케이지에 넣습니다.
   참고 : 단계 1.1 및 1.2에 표시된대로 갓 제조 된 cefoperazone 물이, 5 일 동안 만든 모든 이일을 변경해야합니다. 제도적 환경 보건 및 안전 지침을 다음과 cefoperazone 물을 적절히 처리하는 것이 좋습니다.
3. cefoperazone 물 5 일 후, 멸균 증류수로 가득 멸균 된 물 병 병을 교체합니다. 실험 기간 동안 쥐에게이 식수를 제공합니다.

2. C. 디피 포자 접종의 준비와 쥐의 구강 투여

참고 : 시작하기 전에 다음과 같은 항목이 최소 24 시간 동안 혐기성 챔버에 배치되어 있는지 확인합니다 1X 인산 완충 식염수를 (PBS; 자료 참조), 타우로 콜산 시클로 세린 cefoxitin 과당 한천 (TCCFA) 판 (재료 및 보조 파일을 참조하십시오 ) 및 멸균 L 자형 확산기.

참고 : C. 디피 포자와 도전 마우스는 바이오 안전성 수준이 동물 시설에 보관해야합니다.

1. 이전 준비 및 멸균 ^{(21, 22)에서} 4 ° C에서 보관 하였다 (이 경우, R20291)에서 원하는 변형의 C. 디피 포자 주식을 얻습니다. 사용하기 전에이 포자 주식의 열거를 결정합니다.
2. 공지 농도 포자 재고 (포자 / ㎖)에 기초하여, 원하는 희석액 25 μL 당 ¹⁰⁵ 포자를 구하는 계산한다. 접종 볼륨을 확인하면 모든 접종하는 것이 적절하다실험 (마우스 당 25 μL)의 마우스는 접종의 열거 (약 30 μL)을 수행하고, 피펫 오류를 설명 할 수 있습니다.
3. 소용돌이 원래 C. 디피 포자 재고. 그런 다음, 스크류 캡 microcentrifuge 관 내에서 멸균의 원래 C. 디피 포자 주식 (단계 2.2)에서 계산 된 볼륨을 재현 탁. 층류 후드에서 호기이를 수행한다. 으로이 희석 된 혼합물을 식별 "포자 접종."
4. 65 ° C의 물을 욕조에 포자 접종을 넣고 20 분 정도 가열한다.
   참고 :이 단계는 활성 C. 디피 포자가 열처리 후 남아 있는지 확인합니다.
5. 층류 후드 내에서, 가열 된 포자 접종의 50 μl를 가지고 멸균 microcentrifuge 관에 배치하고, 혐기성 챔버 ^(23)로 전달합니다. 포자 열거이 샘플을 사용합니다.
6. 층류 후드 내에서, 나머지 가열 포자 접종 INT로드OA 1 ml를 주사기 멸균 전구로 만들어진 위 위관 바늘에 연결합니다. 생쥐 간 투여 정확하고 빠른 반복을 위해 수동 주사기 스테퍼를 사용한다. 위관 바늘을 사용하기 전에 가열 된 포자 접종 충전되어 있는지 확인합니다.
   참고 : 각 마우스의 새로운 멸균 위관 바늘이 필요하지 않습니다. C. 디피 포자의 다양한 용량을 투여하는 경우에는, 새로운 위관 니들은 각 투여하는 것이 좋습니다.
   참고 : C. 디피 포자는 기존 소독제에 매우 저항력. 따라서, # 62 Perisept Sporicidal 소독제로서 sporicidal 소독제의 사용이 필요하다. 제조업체는 C. 디피 포자를 파괴 할 수있는 2 분의 접촉 시간을 권장합니다.
7. 위관 영양 포자 접종의 25 μl를 각 마우스입니다. 목 느슨한 피부로 다시 머리를 고정하기 위해 동물을 잡고 부드럽게 각 마우스 억제. 집게 손가락을 사용하여, 상기 동물의 머리에 고정화식도 신장. 동물이 목소리를하거나 억제하는 동안 고통의 징후를 표시하지 않습니다 있는지 확인하십시오.
   참고 : 위관 영양에 의해 쥐에 부여 된 총 부피 10 ㎖ / kg 체중 (0.1 ㎖ / 10 g)을 초과하지 않아야합니다.
8. 수직, 수직 위치에 마우스를 유지하고 부드럽게 입의 측면에 위관 바늘을 전달합니다. 입의 지붕을 따라 위관 바늘을 지시하고 천천히 식도로 위관 바늘을 진행합니다.
   참고 : 어떤 저항이 발생하는 경우, 위관 바늘 기관에 진입 할 수 있으며, 따라서 진행되어서는 안되며, 오히려 즉시 제거 및 재배치.
9. 위관 영양법 바늘 식도로 대략 반 후, 가열 포자 접종의 25 μL를 주입하고 부드럽게 식도에서 위관 영양법 바늘을 철수.
   참고 : 위관 바늘 억지로 발전은 식도 나 위의 파열 될 수 있습니다. 위관 바늘을 전진 할 때 따라서 저항이 발생했을 경우즉시 제거하고 위관 영양 바늘의 위치를 ​​변경하는 것이 가장 좋습니다.
10. 새장에 동물을 반환하고이 부주의 기관의 관리 또는 가열 된 포자 접종의 포부를 나타낼 수로, 어떤 기침이나 호흡 곤란의 징후를 관찰한다.
    참고 : 마우스는 항생제 치료 다음 C. 디피에 매우 민감하다; 케이지가 필수적이다 사이에 따라서,주의 사항은 교차 오염을 방지합니다. 컨트롤로 처리 항생제하지만 도전받지 않은 쥐를 관리 할 때 특히 중요합니다.
11. 모든 쥐를 접종 한 후, 멸균 microcentrifuge 관에 남아있는 가열 된 포자 접종을 배치하고 포자 열거 혐기성 챔버로 전달합니다.
12. 가열 된 포자 접종의 열거를 들어 나머지 gavaged 가열 포자 접종 (단계 2.4에서), 1X PBS의 각 접종 1:10 연속 희석을합니다. 5 희석 (즉, ^10-1를 통해 - 네 만들어 판 것이 좋습니다^10-5).
13. 무균 기술을 사용하여, 개별 TCCFA 판에 각 시리얼 희석 100 μl를 전송합니다.
14. 멸균 L 형 분산기를 사용하여, 균일 판 전체 배지에 도포 희석 확산. 심지어 희석 접종 확산하는 포자의 정확한 계산을위한 필수적이다.
15. 37 ° C에서 24 시간 동안 혐기성 번호판을 품어. 24 시간 후, C. 디피 콜로니 형성 단위 (CFUs)은 볼륨 25 μL (0.025 ml)에 마우스에 투여 감염 복용량을 (보충 파일 "예 계산"참조)을 얻었다 열거 할 수있다. C. 디피 식민지 노란색 평평하고 창백하고 불규칙한 가장자리와 지상 유리 모양 ^{(24)이있다.}
    참고 : 세균 열거 검출 한계는 10 ² CFU입니다.

C. 디피 감염을 통해 질병의 3. 모니터링 마우스 체중 감소 및 임상 증상

1. 체중항생제 오프 -2- 일 복구 (0 일째) 후에 전 5 일 cefoperazone 항생제 치료 후 nimals, 다음 실험이 지속되는 동안.
   주 : 매일 일정한 시간에 무게를 얻습니다. 무게는 도전의 날 (0 일)이 C. 디피 감염에 걸쳐 비교를 위해 초기 기준 중량 표기를 얻을.
2. 바이오 안전성 캐비닛에 디지털 규모를 놓습니다. 규모 상으로 멸균 플라스틱 비커를 놓고 플라스틱 비커의 무게를 용기를. 그런 다음, 부드럽게 꼬리의 기본으로 마우스를 선택하고 플라스틱 비커에 넣습니다.
   1. 다시 규모 비커를 놓습니다. 마우스가 탈출하지 않도록 비커의 상부 위에 손을 올려 놓으면. 안정적인 무게를 얻기 위해 3 초 - 그것은이 걸릴 수 있습니다. 그런 다음, 부드럽게 다시 케이지에 마우스를 놓습니다. 이 무게를 기록하고 그 장에 각 마우스의 과정을 반복합니다.
      주 :이주의 사항은 상호 contamina을 방지하기 위해 촬영하는 것이 필수적입니다케이지 사이의 기 가중치를받을 때. 마우스의 각 케이지는 무게에 대한 자신의 플라스틱 비이커가 있어야합니다. 플라스틱 비커는 각각의 사용 사이의 sporicidal 에이전트와 소독 및 멸균 알루미늄 호일로 덮여해야한다.
3. 회 (최소한) 무기력, 식욕 부진, 설사의 손실, 그리고 구부리고 자세를 포함하여 임상 적으로 중증 C. 디피 감염의 징후에 대한 도전 동물을 모니터링합니다.
4. 인도적 초기 기준 체중의 20 %를 잃고 동물을 안락사 및 / 또는 (단계 3.3에 나열된) C. 디피 감염의 심한 임상 증상을 개발한다.
   주 :이 초기 기본 체중의 20 %를 손실하지 않았는지 확인하기 위해 실험 기간 동안 필요에 따라 C. 디피 감염의 임상 증상을 표시 마우스의 무게를 측정한다. 실험 초기 시점 동안이 두 번 매일 측정을 의미 할 수 있습니다.

C. 디피 4. 세균 열거마우스 대변과 맹장 내용에서

참고 : 1X PBS (자료 참조), TCCFA 판 (자료 참조), 멸균 L 모양의 스프레더 및 멸균의 microcentrifuge 튜브 및 / 또는 : 시작하기 전에 다음과 같은 항목이 최소 24 시간 동안 혐기성 챔버에 배치되어 있는지 확인 희석에 대한 PCR 플레이트.

1. C. 디피 열거에 대한 샘플을 얻기
   참고 : 대변 또는 맹장 내용을 취득하기 전에 분석 규모 멸균의 microcentrifuge 튜브의 무게. 네 소수점 이하 자릿수 (예를 들어, 0.9864 g)에 반올림, 튜브의 측면에 튜브의 무게를 기록한다. 로이 무게를 나타낸다 "튜브의 무게." 수집 된 각 시료를 멸균 칭량 microcentrifuge 관에 배치되어야한다.
   1. 마우스 배설물의 무균 컬렉션
      1. 부드럽게 목 느슨한 피부로 다시 머리를 고정하기 위해 동물을 파악하여 각 마우스 억제. t, 부드럽게 동물의 꼬리를 억제하기 위해 새끼 손가락을 사용하여HUS 항문을 노출. 동물이 목소리를하거나 억제하는 동안 고통의 징후를 표시하지 않습니다 있는지 확인하십시오.
      2. 직접 동물의 항문에서 멸균, 무게 microcentrifuge 관을 잡으십시오. 이는 튜브가 마우스와 직접 접촉하지 않는 것이 필수적이다.
         1. 동물이 배설 된 바와 같이, 튜브에 배설물 펠렛을 수집합니다. 모든 분변 시료가 수집 될 때까지 실온에서 튜브를 유지한다. 마우스가 배변하는 것은 따라서 대변을 수집하기 위해 반복 시도를 필요로, 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
      3. 분석 규모의 대변을 포함하는 튜브의 무게를. 네 소수점 이하 자릿수 (예를 들어, 1.0021 g)에 반올림, 튜브의 무게를 기록한다. 로 얻어진 무게를 나타낸다 "최종 튜브의 무게."
      4. 직접 대변 수집 후 세균 열거 혐기성 챔버로 대변 샘플을 전달합니다.
   2. 부검시 마우스의 맹장 콘텐츠 균 컬렉션
      1. 차를 측정 한 다음 CO ₂ 질식에 의해 인도적인 안락사 후, 맹장 ^(25)를 얻기 위해 부검을 수행합니다. 맹장 위장관의 대형 콤마 형 단면이다.
      2. 멸균 플라스틱 페트리 접시에 맹장를 놓습니다. 일회용 멸균 없음을 사용합니다. 10 메스 블레이드는 맹장 내용을 노출 파우치의 블라인드 끝에서 열려 맹장을 잘라.
         1. 조심스럽게 메스 블레이드 빛의 압력을 적용하고 맹장의 절개 부분을 향해 내용을 청소하여 맹장 압축을 풉니 다.
            참고 : 관리는 조직 병리학 적 검사를 위해 제출 될 맹장 조직을 방해하지 않도록주의해야한다.
      3. 즉시 수집 다음 멸균, 무게 microcentrifuge 관에 맹장 내용을 놓습니다. 맹장 콘텐츠의 약 10 mg의 세균 열거 필요합니다.
      4. 분석 SCAL 맹장에 콘텐츠를 포함하는 튜브의 무게이자형. 네 소수점 이하 자릿수 (예를 들어, 1.0021 g)에 반올림, 튜브의 무게를 기록한다. 로 얻어진 무게를 나타낸다 "최종 튜브의 무게."
      5. 세균 열거 혐기성 챔버로 맹장 콘텐츠 샘플을 전달합니다.
2. C. 디피의 세균 열거
   1. C. 디피에 대해 열거되는 내용 (대변 또는 맹장)의 최종 무게를 계산합니다. 로부터의 "최종 튜브 무게"를 감산하여이 작업을 수행 "튜브의 무게."
   2. 1X PBS에 내용의시 10 분 희석을 계산하고 그에 따라 재현 탁. 배설물 펠렛의 경우, (보충 파일 "예 계산"참조) 부드럽게 솔루션으로 펠렛을 방해 피펫의 팁을 사용합니다.
   3. 혐기성 내용 정착 할 수 있도록 30 분 동안 실온에서 이러한 샘플을 현탁 배양한다.
   4. 열거에 대한 1X PBS의 각 샘플에 대한 일련 희석합니다콘텐츠 (대변 또는 맹장)의 g 당 CFU의 eration. 혐기성이를 수행합니다.
   5. 무균 기술을 사용하여, TCCFA 판에 각각 직렬 희석액 100 ㎕를 전달. 멸균 L 모양의 스프레더를 사용하여 균일하게 접시에 걸쳐 그것을 확산 미디어에 적용되는 희석을 확산. 심지어 희석의 확산은 식민지의 정확한 열거 필수적이다.
   6. 37 ° C에서 24 시간 동안 혐기성 번호판을 품어. 이 때, 컨텐츠 (대변 또는 맹장)의 g 당 CFU를 얻기 위해 C. 디피 식민지를 열거. C. 디피 식민지 노란색 평평하고 창백하고 불규칙한 가장자리와 지상 유리 모양 ^{(24)이있다.}
      주 :이 프로토콜은 회장 및 결장을 포함한 다른 콘텐츠 뮤린 GI 콘텐츠로부터 C. 디피을 열거 할 수있다. PCR 플레이트를 계열 희석을 위해 사용될 수있다.

5. 베로 세포 세포 독성 분석은 C. 디피 독소 Cytotoxi을 정량화하기시티

주 :이 분석은 샘플 부검에서 수집 및 -80 ° C에 저장에 마우스 모델의 완료 후 수행하는 것이 좋습니다. 무균 세포 배양 기술이 분석 동안 베로 세포의 오염을 방지하기 위해 필수적이다. 이 프로토콜은 수행 2 일이 소요됩니다. 모든 배설물이 분석에 이용 장 콘텐츠가 무게, 멸균 microcentrifuge 관에 저장해야합니다 (로 표시 "관 중량,"위의 섹션 참조). (내용 포함) 최종 튜브의 무게가 가장 가까운 네 개의 소수 자릿수로 분석 척도를 통해 측정된다 (위의 섹션 참조). 멀티 채널 피펫의 사용은이 분석을 권장합니다.

주 : 시작하기 전에, 다음 사항을 사용할 수 있도록되어 있음 : 베로 세포를 DMEM 1X "로 표시된 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 매체 (함께 이글 배지 (DMEM) (1X)의 둘 베코 변형 미디어, "재료 및 보조 파일을 참조하십시오), 0.25 %초순수 1 μg의 / μL의 3 μL의 트립신 EDTA, 1X PBS, 0.4 % 트리 판 블루, 96 웰 세포 배양 평면 바닥 플레이트, 96 웰 필터 플레이트, 클로스 트리 디움 디피 독소 A (분취하고 -80 ° C)에서 저장, 클로스 트리 디움 디피 항독소, 계산 및 판지도를위한 워크 시트 (;) 추가 파일을 참조하십시오.

참고 :주의 C. 디피와 그 독소에 인사 노출이 분석시주의해야한다.

1. 베로 셀 분할 (1 일)
   1. 37 ° C의 물을 욕조에 DMEM 1 배 매체, 0.25 % 트립신 - EDTA 및 1X PBS를 예열.
   2. 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO _2)에서 베로 세포의 플라스크를 얻어 멸균 세포 배양 층류 후드에 배치. 사용하기 전에 후드 및 장비를 닦아 70 % 에탄올을 사용합니다. 혈청 피펫을 사용하여 베로 세포로부터 제거하고, 폐기 C로 폐기하는 조직 배양 플라스크에서 매체를 대기음ontainer.
   3. 1X PBS 5 ㎖와 베로 세포를 헹구 조직 배양 플라스크에서 (예열). PBS를 대기음 및 폐기물 용기에 폐기.
   4. 조직 배양 플라스크에 0.25 % 트립신 - EDTA의 5 ML을 추가합니다. 3 분 - 2의 접촉 시간을 허용합니다. 이 시간 동안, 세포가 플라스크의 표면을 이탈하기 시작 관찰한다. 조심스럽게 베로 세포를 느슨하게하는쪽으로 조직 문화 플라스크 측 바위.
   5. 트립신 EDTA와의 접촉 시간 후, 바로 조직 배양 플라스크에 DMEM 배지 1X 5 mL를 추가한다. 이 트립신 - EDTA를 중화합니다. 조심스럽게 플라스크의 뒷 어떤 부착되지 않은 베로 세포를 씻어이 솔루션을 사용합니다. 이어서, 15 ml의 원추형 튜브 혼합물을 전송하는 혈청 피펫을 사용한다.
   6. 180 XG에서 5 분, 25 ° C에 대한 원추형 튜브의 베로 세포를 원심 분리기. 원심 분리기가 제대로 균형 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 원추형 튜브의 하단에 베로 세포의 가시적 인 펠렛을 관찰한다. DISR주의 말라이 펠렛을 UPT. 원뿔 튜브에서 뜨는 오프 대기음 및 폐기.
   7. 1X DMEM 배지 3 ㎖에 베로 세포를 재현 탁.
2. 베로 세포를 카운팅
   1. 0.4 % 트리 판 블루 100 ㎕에 (단계 5.1.7에서 만들어진) 베로 세포 현탁액 100 μl를 추가합니다. 부드럽게 상하 용액을 피펫 팅하여 혼합한다.
   2. 혈구의 각 챔버에이 혼합물의 10 μl를 추가합니다.
   3. 혈구의 사분면 내 생존 세포 수를 계산. 죽은 베로 세포는 트리 판 블루를 취할 것 때문에 (이 세포가 계산 안) 푸른 스테인드됩니다. 에이 번호를 녹음 "베로 셀 워크 시트"제공했다.
   4. 네 사분면 가능한 베로 세포의 총 수를 합계의 평균을 계산한다. 곱하기 셀이 보낸 100 μL 인 희석 배수에 의한 액체의 200 μL의 합계이다.
   5. 보정 계수를 곱하여 "를 정제하여세포 수 / ㎖ "혈구를 사용하는 경우, 상기 보정 계수는 항상 ^104이다 수득 총량 곱하기."셀의 총 개수를 "..
3. 각 실험에 대한 웰스 필요한의 수 결정
   참고 : 하나의 샘플 (대변 또는 장 내용 중 하나)를 중복 수행 할 24 별도의 우물을 필요로한다. 웰 당 ¹⁰⁵ 베로 세포의 농도 (90 μl의 총 부피)가 필요하다.
   참고 : 하나의 하룻밤 37 ° C, 잘 당 10 ^세 베로 세포의 농도로 베로 세포를 96 웰 플레이트를 배양하고자하는 경우 확장 배양 시간을 고려하는 것이 좋습니다. 베로 셀 워크 시트에서 계산이 변경을 고려하여 조정해야합니다.
   1. (단계 5.2에서 상기 베로 세포 워크 제공 사용)을 사용할 수 베로 세포의 양에 기초하여 이용 될 수있는 웰의 수를 결정한다.
   2. 의 볼륨을 결정소정 웰의 수 채울 필요 베로 세포 현탁액 (샘플 수에 따라 테스트중인). 추가 볼륨 (제공되는 베로 셀 워크 시트를 사용) 오류를 피펫 팅에 대한 계정에 추가되어 있는지 확인합니다.
   3. 실험에 필요한 양을 얻기 위해 1X DMEM 배지에서 (단계 5.1.7에서 수득)을 베로 세포 현탁액을 희석.
4. 96 웰 세포 배양 플레이트에 파종 베로 세포
   1. 단계 5.3.2에서 베로 세포를 재현 탁하여, 96 웰 세포 배양 평면 바닥 플레이트의 각 웰에 베로 세포 현탁액 90 μL를 추가하는 멀티 채널 피펫을 사용한다.
   2. 웰에 독소 (시료)를 첨가하기 전에 4 시간 이상 동안 CO _2, 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 베로 세포 플레이트를 인큐베이션, 5 %. 이 배양 시간은 베로 세포를 각 웰의 바닥에 부착하는 것을 허용 할 것이다.
5. (대변 또는 샘플에서 증권 솔루션 만들기장 컨텐츠)
   참고 : 모든 샘플을 분석 척도를 통해 측정 된 "튜브 무게"와 "최종 튜브의 무게를"이 있어야합니다. 계산을 위해 베로 셀 워크 시트를 사용합니다.
   1. 내용물의 중량을 계산한다. mg의 g를 변환 한 다음 μL mg 정도. 1X PBS에서 1:10 희석을 만드는 데 필요한 솔루션의 μL의 최종 총 수를 계산합니다. 샘플에 추가 1X PBS의 총량을 계산합니다.
   2. 시료에 (위 계산) 1X PBS의 총 볼륨을 추가합니다. 기적이를 수행하고, 무균 기술을 사용하여. 배설물 펠렛의 경우, 부드럽게 용액에 펠렛을 방해 피펫의 팁을 사용합니다.
   3. 샘플을 와동 후, 실온에서 5 분 동안 3522 × g으로 원심 분리하여 그들을. 원심 분리기가 제대로 균형 있는지 확인합니다. 펠렛을 방해 및 솔루션에 샘플을 재현 탁하지 않도록주의하십시오.
      주의 : 단지 몇 샘플이 처리되는 경우, 단계 5.5.3 동안, 내용물을 멸균 할 수있다96 웰 필터 플레이트를 사용하는 대신에 단일의 0.22 μm의 필터를 통해 전달. 일부 샘플은이 기술을 이용하여 전체 볼륨의 콘텐츠를 여러 살균 필터를 필요로 할 수있다.
   4. 상등액 150 μL를 복용하고 96 웰 필터 플레이트 상에 별도의 웰에 배치하여 샘플 / PBS 혼합물을 멸균. 내용이 판으로 필터링되도록 96 웰 세포 배양 평면 바닥 판의 상부에 확실하게 판형 필터를 배치했다.
   5. 실온에서 5 분 동안 431 XG에서 필터 판 / 세포 배양 용기 스택 원심 분리기. 원심 분리기가 제대로 균형 것을 확인하고 필터 플레이트 / 세포 배양 플레이트 스택은 밀접하게 정렬되었는지 원심 분리 동안 이동하지 않습니다.
      참고 :이 필터링 된 내용이 희석 플레이트에 사용되는 10 ^-1 재고 있습니다.
   6. 얼음에 필터링 된 샘플 접시를 놓습니다.
6. 작성 희석 플레이트 # 1
   참고 : 희석 괞 찮아테 # 1 (1 DP #을) 긍정적 (C. 디피 독소 A)과 음극 (1X PBS)를 제어합니다 (베로 셀 워크 시트에서 DP # 1 레이아웃을 참조)를 포함하여 샘플 당 6 우물을 필요로 할 것이다.
   1. 이 분석을위한 양성 대조군 (C. 디피 독소 A)를 제조하기 위해, -80 ° C에서 3 μL 분취 (1 μg의 / μL)을 얻었다 0.01 μg의 / μL의 최종 농도를 수득 초순수 297 μL를 추가한다. 얼음에 놓습니다.
   2. 각 샘플에 대한 자신의 희석 ^{(10-1 10-6)으로} 우물을 라벨 및 양극과 음극 컨트롤을 표시합니다 (DP # 1 레이아웃을 참조).
   3. 각 웰에 1X PBS의 적절한 금액을 추가합니다. 10 ^-1 우물에서 NO PBS를 추가하지 않습니다. 10 ^{-2 -6} 10 우물의 경우, 1X PBS의 90 μl를 추가합니다.
   4. 각 웰에 샘플의 적절한 금액을 추가합니다. 10 ^-1 우물에서, 각 샘플에 대해 10 ^-1 주식 100 μl를 추가 (필터 작은지면에서 단계 5.5.7 참조이자형). 10 ^-2 ~ 10 ^-6 우물의 경우, 연속 희석을; 10 ^-1도에서 10 μl를 복용하고 잘 ^10-2에 추가하여 시작합니다. 10 ^-6 희석 밖으로 시리얼 희석을 계속합니다.
   5. 투명한 플라스틱 접착 도장과 DP 1 판을 덮고 얼음에 놓습니다.
7. 작성 희석 플레이트 # 2
   참고 : 희석 플레이트 (DP는 # 2) 양성 및 음성 컨트롤을 포함하여 각 샘플합니다 (베로 셀 워크 시트에서 DP # 2 레이아웃을 참조) 6 우물의 2 차선을 필요로 할 것이다.
   1. 각 샘플에 대한 자신의 희석 ^{(10-1 10-6)으로} 우물을 라벨 및 양극과 음극 컨트롤을 표시합니다 (DP # 2 레이아웃 참조). 또는 ( "항독소 우물"로 표시) 항독소와 샘플 이름 ( "샘플 우물"로 표시) 샘플 이름으로 우물을 레이블.
   2. 이 분석에 필요한 항독소의 양을 계산합니다. 주 : 항독소가 25 배 재고입니다필요 솔루션은 1X PBS에서 1:25으로 희석한다. 얼음에 준비 항독소 1 배 솔루션을 놓습니다.
   3. 내용은 "샘플 우물,"잘 그 샘플의 모든 희석 ^{(10-1 10-6)에} 대한 각 1X PBS의 20 μl를 추가합니다. 내용은 "항독소 우물,"잘 그 샘플의 모든 희석 ^{(10-1 6 ~} 10)에 대해 각각 1 배 항독소의 20 μl를 추가합니다.
   4. 6 행 7 - - 행 1 DP # 2에 지정된 우물에 DP # 1에서 우물에 전송 희석 된 샘플의 20 μl를 12합니다 (베로 셀 워크 시트에서 DP # 2 레이아웃 참조). 로 pipetting 아래로 부드럽게 솔루션을 섞는다.
   5. 투명한 플라스틱 접착 씰 DP # 2을 덮고 실온에서 40 분간 인큐베이션을 허용한다. 이 부화는 항독소가 결합함으로써 불 활성화와 C. 디피 독소를 중화 할 수 있도록하는 것입니다.
   6. 배양 후, (적절한 베로 세포 우물에 DP # 2에서 혼합물의 10 μl를 추가 V의 베로 셀 플레이트 레이아웃을 참조ERO 셀 워크 시트). 조심스럽게 우물의 바닥면에 부착 된 베로 세포를 방해하지 않도록주의하면서 아래로 pipetting 및하여 솔루션을 섞는다.
   7. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 베로 세포 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO _2.
8. 광학 현미경을 사용하여 반올림에 대한 베로 세포를 평가 (2 일)
   주 : 베로 세포 플레이트에 샘플 혼합물을 추가 할 때 10 배 희석 배율 변화 (예, ^{10-3 이제 10-4} 임) 것을 상기하자. 본 항독소가 웰스없이 베로 세포 라운딩에 조금주의해야한다. 베로 세포 반올림 (세포 독성은) C. 디피 독소를 포함하는 샘플에 주목해야 할 것이다. 세포 독성 활성은 시료와 항독소를 함유하는 희석 중화되면 베로 세포 독성 결과 C. 디피 독소의 존재가 확인된다.
   1. 조명 관리를 사용하여 베로 세포 라운딩에 대한 검사200X 배율에서 t 현미경. (양성 대조군 포함) 샘플 우물의 경우,주의 80 % 베로 세포 라운딩을 가지고 마지막 인 웰의 희석을 기록합니다.
   2. 시료 g 당 80 % 베로 세포 라운딩을 제조 한 최고 희석액의 역수로서 정의되는 세포 독성의 역가를 계산한다. 예를 들어, 가장 높은 희석 후 희석 요인이 샘플 ^10-6 것, ^10-5 경우. 따라서, 로그 [최종 희석 계수] / g 시료 6의 역수 역가를 산출 ^[106]를 기록 할 것이다.
      참고 : - 4 구절이 분석 ^{(26)에서의} 사용에 더 이상 30 이상의 통로 이전 베로 세포가 필요로 적어도 3을받은합니다.

결과

대표 연구 기간 동안, 5 주령 C57BL / 6 WT 마우스는 5 일 자신의 식수 (0.5 ㎎ / ㎖)에 cefoperazone으로 전처리 및 2 박 정기적으로 마시는 물로 씻어시켰다. 마우스는 하루 0 (그림 1A)에 구강 투여를 통해 C. 디피 R20291 10 ⁵ 포자에 도전했다. 마우스는 14 일 동안 CDI의 체중 감소와 임상 증상 (혼수, 식욕 부진, 설사, 및 구부리고 자세)에 대해 모니터링 하였?...

토론

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue	Gibco	15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin	Gibco	15070-063
10% heat inactivated FBS	Gibco	16140-071	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap	Corning	430917
96 well cell culture flat bottom plate	Costar Corning	CL3595
96 well filter plate	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose	Fisher	L95500	Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous)	Sigma	M2643	Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filter for TCCFA plates
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Part of TCCFA plates (see below)
NaCl	Fisher	S640-3	Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade	Miltex, Inc	4-410
PCR Plates	Fisherbrand	14230244
Plastic petri dish	Kord-Valmark Brand	2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader	Fisherbrand	14-665-230
Syringe Stepper	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664	Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope	Olympus Life Science
DP27 camera	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Life Science