细胞系标记的共定位和番茄信号

摘要

我们制定了两套在ROSA26 ^tdtomato（在所有细胞中广泛表达）/ Cre重组（特别是软骨细胞表达）小鼠跟踪组合:一个2.3Col1a1-GFP（具体以成骨细胞）和一个与免疫（具体以骨细胞）。该数据证明软骨细胞的直接转化成骨细胞。

摘要

细胞谱系追踪系统已在发育生物学研究中主要使用。利用Cre重组酶的允许记者在特定细胞系和所有后代的活化。在这里，我们使用的细胞谱系追踪技术来证明软骨细胞长骨以及使用2种酶Cre，COL10A1 Cre重组和聚蛋白多糖-Cre重组^ERT2（ 此Agg-Cre重组^ERT2）的下颌骨髁发育过程中直接转变成成骨细胞和骨细胞，越过与ROSA26 ^tdTomato。无论Col10和蛋白聚糖被公认的标记物软骨细胞。

在此基础上，我们开发了一种新方法，细胞谱系通过分析细胞特异性标志物的表达在用荧光免疫-以限定细胞的命运一起跟踪。 RUNX2（对于早期骨细胞的标记）和牙本质基质蛋白1（DMP1;对于晚期骨细胞的标记）为用于鉴定软骨衍生骨细胞和它们的分化状态。这种组合不仅拓宽细胞谱系追踪中的应用，而且还简化了化合物的小鼠的产生。更重要的是，亲本细胞的后代的数量，位置和分化状态同时显示，提供比细胞谱系单独跟踪的详细信息。总之，细胞谱系追踪技术和免疫荧光共应用是用于体内研究细胞生物学的有力工具。

引言

在开发过程中，软骨内骨形成占骨架体积的80％以上。人们普遍认为，这首先肥大软骨细胞的凋亡。接着，从底层骨髓细胞侵入并启动血管生成，随后通过骨髓和骨膜衍生细胞^-1,2-新骨沉积。肥大软骨细胞的细胞命运（HCS），然而，一直是人们争论的一个问题，几十年来^3。最初，碳氢化合物被认为是软骨细胞分化途径的端部，和凋亡普遍认为是碳氢化合物的最终命运。现在，一些研究人员认为，至少有一些碳氢化合物能够生存，并有助于软骨内成骨。虽然他们提议生长板软骨不得不转分化成基于超微结构，免疫组织化学染色的成骨细胞的能力，以及在体外研究^46中 ，这些方法瓦特埃雷在证明对成骨细胞谱系的贡献软骨明确。

该细胞谱系追踪技术提供了一种更严格的方式来研究细胞命运。简要地说，一个重组酶，这是只在特定类型的细胞中表达，刺激报道基因的表达。以这种方式，这种类型的细胞及其后代被永久标记^7。该Cre的loxP系统在谱系追踪常用。酶Cre（重组酶酶）将切除两个loxP位点之间的停止序列和激活报告在特定的细胞系（ 图1A）。在一些情况下，研究者可以选择有利的时间点，通过使用一种药物，例如他莫昔芬激活酶Cre，引起酶Cre熔合到雌激素受体（酶Cre ^ERT2）8的改进形式。荧光记者已成为谱系追踪实验，因为他们大幅降低复杂性的标准和提高细胞命运跟踪^8,9的准确性和效率。 tdTomato是变荧光报告之间的最佳选择，因为它具有最亮的荧光蛋白和最强的萤光，使它很容易地可视化^7（ 图1A）。

通过使用ROSA26 ^tdTomato谱系追踪系统，我们组和其他研究者已经证明，碳氧化合物可以在开发过程中^10-14改变其表型成骨细胞。要做到这一点，我们开发了两套与ROSA26 ^tdtomato（普遍存在的表达在所有的细胞）/ Cre的（特定于软骨细胞）的小鼠的跟踪组合:2.3Col1a1-GFP（特定于成骨细胞）和免疫荧光（特定于骨细胞）。该数据表明，这两种方法都是可行的方法，来研究细胞的命运体内 。

研究方案

所有协议进行审查和机构动物护理和使用委员会（IACUC）在得克萨斯A＆牙科M大学学院批准。

1.动物育种

1. 在这项研究中使用三种动物模型。为了研究胚胎软骨细胞的形成髁的命运，第一次使用COL10A1 Cre重组 ¹⁵只和ROSA26 ^tdTomato越过他们（B6; 129S6- 亿吨（ROSA）26Sor ^{TM9（CAG-tdTomato）HZE} / J）小鼠获得Col10a1-综合招聘考试及ROSA26 ^tdTomato老鼠。接下来，跨越这些小鼠2.3Col1a1-GFP小鼠^16。使用COL10A1 Cre重组; ROSA26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP的小鼠进行细胞谱系追踪试验（ 图1B）。
2. 为了研究产后软骨细胞的命运，遵循相同的程序与步骤1.1，但使用蛋白多糖，CRE ^ERT2（ 总比分Cre重组^ERT2）17,18线，并保持此Agg Cre重组^ERT2; ROSA26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP的小鼠进行细胞谱系追踪试验（ 图1C）。注入14日龄他莫昔芬。
3. 要结合细胞谱系追踪与免疫荧光技术，跨AGG的Cre重组^ERT2小鼠和ROSA26 ^tdTomato老鼠。使用该实验中携带两个基因小鼠和3日龄（ 图1D）注入他莫昔芬。

2.材料准备

1. 溶解在10％的乙醇和90％的玉米油的他莫昔芬粉末以10mg / ml的浓度。用于注射的剂量为75毫克/公斤。
2. 溶解在PBS中的多聚甲醛（PFA）粉末，以4％的浓度，用2M的氢氧化钠以调节pH值至7.4。使用4％PFA解决方案，以修复牺牲后，组织（下颌骨髁状突和后腿这里使用）。由于其毒性，在手套和口罩罩处理PFA。
3. 溶解在蒸馏水中的EDTA粉末的浓度为10％，用2M的氢氧化钠以调节pH值至7.4。使用10％的EDTA脱钙髁突及后腿。
4. 溶解在15％和30％的浓度在PBS中蔗糖的粉末。使用蔗糖溶液脱钙后脱水的组织。
5. 溶解在PBS中的透明质酸粉末以2毫克/毫升，pH 5.0的浓度。这个解决方案是免疫抗原修复。
6. 用1.5毫升管以制备含有3％牛血清白蛋白（BSA）和20％山羊血清的PBS Runx2的或DMP1免疫荧光染色的封闭溶液。
7. 用1.5毫升管以制备包含2％山羊血清的PBS Runx2的或DMP1免疫荧光染色的初级抗体溶液。第一抗体的浓度为1:400为Runx2的和1:100 DMP1。
8. 用1.5毫升管以制备兔IgG溶液作为对照用于免疫荧光染色，以避免假阳性结果。该溶液含有在PBS中2％山羊血清。的兔IgG为Runx2的控制的浓度为1:400;为DMP1，1:100。同时进行实验组和对照染色。
9. 使用1.5ml的管以制备包含2％山羊血清的PBS Runx2的或DMP1免疫荧光染色的二级抗体溶液。使用的第二抗体以1稀释:500。

3.将准备共聚焦显微镜（细胞系只有跟踪，用免疫无组合）

1. 在有利的时间点注入在此Agg-CRE ^ERT2小鼠他莫昔芬。
   1. 首先，从笼子里取出一只老鼠。然后，用左手拇指和食指抓住鼠标的背部皮肤，翻过来，露出腹部。用右手按住注射器。最佳入口点注射是在LEFT或下腹部的右侧，避免了肝脏和膀胱。
   2. 保持平行注射器鼠标的后腿和腹膜内注射。用于注射的剂量为75毫克/公斤。分别为18克， - 小鼠在2周，3周，4周龄的年龄的加权数是约7 - 8克，11 - 13克，和16。
2. 麻醉与赛拉嗪/ Ketaset组合的老鼠。
   1. 为了制备工作溶液，先用蒸馏水稀释甲苯噻嗪和Ketaset至1毫克/毫升和5毫克/ ml的浓度，分别。 2比:接着，在1混合甲苯噻嗪和Ketaset。用于注射的剂量为30微升/ g以下。
   2. 注入如在步骤3.1。按捏鼠的脚踝确认麻醉。鼠标是无意识的，如果它没有反应。
3. 麻醉后灌注用4％PFA的小鼠。
   1. 鼠标失去知觉后，固定在板上鼠标的四条腿entirelŸ露出腹部。
   2. 饱和，用70％的乙醇的腹部并进行切除从下腹部到沿中间线颈部。捏和同时皮肤拉向侧面以显示腹膜。用剪刀清扫，使纵向切除。
   3. 切断并去掉前面的肋骨暴露心脏。从一个22克的注射器左心室穿刺心脏，持注射器，同时切槽的右心耳。
   4. 慢慢注入4％PFA，其沿着心血管系统灌注而潮红出从右侧耳廓的切割。在PFA的灌注体积为1毫升/克。执行在I级生物安全柜是难以输送到大楼的排气系统这一步。
4. 剥离鼠标的皮肤，并把整个身体成含有40毫升的4％的PFA在4℃固定过夜的50ml聚丙烯离心管中。
5. 使用解剖剪刀和＃3，＃5镊子小心地清除体内的下颌骨和后腿，并除去表面的肌肉和肌腱。执行在I级生物安全柜是难以输送到大楼的排气系统这一步。
6. 切下颌骨成两片在第三臼齿的远侧区域。同样，切股骨和胫骨中的中段，以暴露骨髓腔，以加速脱钙。把包括所述髁和髁突的一部分，并与后腿成40毫升10％的EDTA一起在4℃下进行2脱钙 - 4天50ml的聚丙烯离心管中。
7. 用50毫升15％的蔗糖在50ml的聚丙烯离心管中，以脱水髁和后腿过夜，在4℃。
8. 使用30％的蔗糖在50ml的聚丙烯离心管中，以脱水髁和后腿在4℃过夜。
9. 沿矢状面，嵌入与样品华侨城在冷冻切片机切板。
   1. 水平放置髁或在安装模具的后腿。淹没组织OCT和它留在冷冻切片机，直到华侨城冻结。
   2. 安装在剪板机华侨城块。切割，以确保在OCT是完全冻结之前等待约15分钟。
10. 切髁和后腿成10微米的部分。收集幻灯片和商店的部分在-20°C。
11. 孵育在37℃室中的载片染色之前以除去水。
12. 用蒸馏水洗涤载玻片两次5分钟。
13. 擦去水绕每个部分。使用疏水屏障用笔圈出部分拖放DAPI或无荧光防褪色的安装解决方案进入这个圈子。小心放下盖玻片。

4.免疫组织化学染色为Runx2的和DMP1

注:IgG抗体CON控制是必要的免疫组化染色，避免假阳性信号。需要同时执行对实验组和对照组的染色。

1. 孵育在37℃室中的载玻片染色之前以除去水。
2. 用蒸馏水冲洗幻灯片的两倍。
3. 使用疏水屏障笔来圈上滑动的所有部分。从该步骤中，添加所有制备的溶液的成圈以完全覆盖部分。
4. 治疗与透明质酸酶的部分在潮湿室中在37℃下进行30分钟。的溶液（在步骤4.5 - 4.8）的体积取决于该部分的大小。用于髁50微升溶液和100微升的长骨。用PBST（PBS中含有0.1％吐温20）三次清洗。
5. 制备和应用封闭溶液到每一个部分，并培育它们在潮湿室中在室温下1小时。
6. 孵育主要章节在4℃过夜抗体溶液（兔抗小鼠Runx2的，或兔抗小鼠DMP1）。用PBS三次洗涤。
7. 孵育二级抗体溶液（山羊抗兔，的Alexa Fluor 488），用于在室温下2小时的部分。用PBS三次洗涤。
8. 擦掉水绕的部分拖放DAPI到了中圈，以支付幻灯片上的部分。小心放下盖玻片。

5.共聚焦显微镜

1. 在波长范围从488微米（绿色），561微米（红色）捕获利用共聚焦显微镜的荧光细胞图像。在200Hz以多个堆叠图像^{19（1024×1024}尺寸），使用10X，20X，63X和镜头。

结果

软骨细胞直接转变成在颌骨髁状突和长骨骨细胞（成骨细胞和骨细胞）。

聚集蛋白聚糖 ，对软骨的关键基因，主要表现为早期和成熟的软骨细胞^18。其结果是，在2周的年龄在此Agg-Cre重组^ERT2三苯氧胺的注射液; ROSA26 ^tdTomato激活小鼠红番茄记者在所有的软骨细胞和它们?...

讨论

由于技术限制，它始终是难以调查细胞在体内的行为。然而，细胞谱系追踪技术已被证明是用于研究细胞生物学^7-9的有力工具。在这项研究中，我们进一步通过与免疫相结合的方法进行改进。以这种方式，细胞命运可以由多个相关的标志物，从而拓宽谱系追踪中的应用来定义。此外，免疫荧光和番茄信号的此共定位同时显示的创始人细胞，它们的位置，以及它们的分化状态的后代?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS