Co-localizzazione di marcatori di cellule lignaggio e il segnale di pomodoro

Riepilogo

Abbiamo sviluppato due serie di tracciare combinazioni a Rosa26 ^tdtomato (ubiquitariamente espresso in tutte le cellule) / Cre (specificamente indicato nella condrociti) topi: uno con 2.3Col1a1-GFP (specifico per osteoblasti) e uno con immunofluorescenza (specifico per le cellule ossee). I dati dimostrano la trasformazione diretta di condrociti in cellule ossee.

Abstract

Il sistema di tracciamento linea cellulare è stata utilizzata prevalentemente negli studi di biologia dello sviluppo. L'uso di Cre ricombinasi consente l'attivazione del reporter in una linea cellulare specifica e tutto progenie. Qui, abbiamo utilizzato la linea cellulare tecnica tracing per dimostrare che condrociti trasformano direttamente in osteoblasti e osteociti durante osso lungo e lo sviluppo del condilo mandibolare utilizzando due tipi di Cre, Col10a1-Cre e Aggrecan-Cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2), incrociati con Rosa26 ^tdTomato. Sia Col10 e aggrecan sono marcatori ben riconosciuti per condrociti.

Su questa base, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di lignaggio cellule tracing in combinazione con fluorescenti immunoistochimica-per definire il destino della cellula, analizzando l'espressione di marcatori cellulari specifici. Runx2 (un marker per le cellule osteogeniche fase iniziale) e dentina matrice protein1 (DMP1, un marker per le cellule in fase avanzata osteogeniche) eranoutilizzato per identificare le cellule ossee chondrocyte-derivati ​​e il loro stato di differenziazione. Questa combinazione non solo amplia l'applicazione della linea cellulare tracing, ma semplifica anche la generazione di topi composti. Ancora più importante, gli stati posizione, il numero e la differenziazione delle progenie cellula madre vengono visualizzati contemporaneamente, fornendo più informazioni rispetto linea cellulare tracciamento solo. In conclusione, la co-applicazione di tecniche tracing linea cellulare e immunofluorescenza è un potente strumento per studiare biologia cellulare in vivo.

Introduzione

Durante lo sviluppo, rappresenta la formazione di osso endochondral per oltre l'80% del volume scheletrico. E 'opinione diffusa che inizia con l'apoptosi dei condrociti ipertrofici. Successivamente, le cellule dal midollo osseo sottostante invadono e avviare l'angiogenesi, seguita dalla deposizione di nuovo tessuto osseo da dal midollo osseo e cellule del periostio di derivazione ^1,2. Il destino delle cellule di condrociti ipertrofici (HC), tuttavia, è stato un problema di dibattito per decenni ^3. Inizialmente, HC sono stati considerati alla fine del percorso di differenziazione dei condrociti, e l'apoptosi è stato generalmente pensato per essere il destino finale di HC. Ora, alcuni ricercatori suggeriscono che almeno alcuni HC potrebbero sopravvivere e contribuire alla formazione di osso endochondral. Anche se hanno proposto che la crescita condrociti piatto aveva la capacità di transdifferenziare in osteoblasti sulla base di ultrastruttura, colorazione immunoistochimica, e studi in vitro ^46, nessuno di questi metodi were definitiva a dimostrare il contributo di condrociti alla stirpe degli osteoblasti.

La tecnica di linea cellulare tracciare fornisce un modo più rigoroso per studiare il destino della cellula. Per dirla in breve, un enzima ricombinasi, che viene espresso solo in un tipo specifico di cellula, stimola l'espressione del gene reporter. In questo modo, questo tipo di cellula e loro discendenti sono permanentemente etichettati ^7. Il sistema Cre-loxP è comunemente usato in lineage tracing. Cre (l'enzima ricombinasi) sarà asportare la sequenza di STOP tra i due siti loxP e attivare il reporter di una determinata linea cellulare (Figura 1A). In alcuni casi, il ricercatore può scegliere un punto tempo favorevole per attivare Cre utilizzando un farmaco, come il tamoxifene, causando Cre di fondere ad una forma modificata del recettore dell'estrogeno (Cre ^{ERT2) 8.} giornalisti fluorescenti sono diventati lo standard in lignaggio tracciare esperimenti perché riducono drasticamente la complessitàe migliorare la precisione e l'efficienza del destino delle cellule tracciamento ^8,9. tdTomato sta diventando la scelta migliore tra i reporter fluorescenti poiché ha la proteina fluorescente chiaro e il epifluorescenza forte, che lo rende facilmente visualizzato ⁷ (Figura 1A).

Usando il lignaggio Rosa26 ^tdTomato sistema di rintracciamento, il nostro gruppo e altri ricercatori hanno dimostrato che l'HC può cambiare il loro fenotipo in cellule ossee durante lo sviluppo ^10-14. Per fare questo, abbiamo sviluppato due serie di tracciare combinazioni con Rosa26 ^tdtomato (espressione ubiquitaria in tutte le cellule) / Cre (specifico per condrociti) topo: 2.3Col1a1-GFP (specifico per osteoblasti) e immunofluorescenza (specifico per le cellule ossee). I dati dimostrano che i due metodi sono modi vitali per studiare il destino della cellula in vivo.

Protocollo

Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la Texas A & M University College of Dentistry.

Allevamento 1. Animal

1. Utilizzare tre modelli animali in questo studio. Per studiare il destino dei condrociti embrionali in formazione condilo, primo utilizzo Col10a1-Cre ¹⁵ topi ed attraversarle con Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{TM9 (CAG-tdTomato) HZE} / J) topi per ottenere Col10a1- topi Cre e Rosa26 ^tdTomato. Successivamente, attraversare questi topi con topi 2.3Col1a1-GFP ^16. Utilizzare Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; Topi 2.3Col1a1-GFP per eseguire gli esperimenti linea cellulare di tracciamento (Figura 1B).
2. Per studiare il destino dei condrociti postnatali, seguire la stessa procedura al punto 1.1, ma utilizzare il ^ERT2 Aggrecan-cre (Agg-Cre ^ERT2) ^17,18 line e mantenere la Agg-Cre ^ERT2; Rosa26 ^tdTomato; Topi 2.3Col1a1-GFP per eseguire gli esperimenti linea cellulare Tracing (Figura 1C). Iniettare tamoxifene su postnatale giorno 14.
3. Per combinare la linea cellulare tecnica con immunofluorescenza rintracciamento, attraversare topi Agg-Cre ^ERT2 e topi Rosa26 ^tdTomato. Utilizzare i topi che portano entrambi i geni nell'esperimento e iniettare il tamoxifene in postnatale giorno 3 (Figura 1D).

2. Preparazione Materiale

1. Sciogliere la polvere tamoxifen in 10% di etanolo e olio di mais al 90% ad una concentrazione di 10 mg / ml. Il dosaggio iniettabile è 75 mg / kg.
2. Sciogliere la polvere paraformaldeide (PFA) in PBS ad una concentrazione di 4%, utilizzando 2 M di sodio idrato per regolare il pH a 7,4. Utilizzare 4% soluzione PFA per riparare il tessuto (il condilo mandibolare e gamba posteriore sono utilizzati qui) dopo il sacrificio. A causa del suotossicità, maniglia PFA nella cappa con guanti e una maschera facciale.
3. Sciogliere la polvere EDTA in acqua distillata ad una concentrazione del 10%, utilizzando 2 M di sodio idrato per regolare il pH a 7,4. Utilizzare il 10% EDTA per decalcificazione del condilo mandibolare e gamba posteriore.
4. Sciogliere in polvere di saccarosio in PBS a concentrazioni di 15% e 30%. Utilizzare la soluzione di saccarosio per disidratare i tessuti dopo la decalcificazione.
5. Sciogliere la polvere ialuronidasi in PBS ad una concentrazione di 2 mg / ml, pH 5,0. Questa soluzione è per il recupero immunofluorescenza antigene.
6. Utilizzare una provetta da 1,5 ml per preparare una soluzione di saturazione contenente 3% di albumina sierica bovina (BSA) e 20% siero di capra in PBS per Runx2 o DMP1 immunofluorescenza.
7. Utilizzare una provetta da 1,5 ml per preparare una soluzione anticorpo primario che contiene 2% di siero di capra in PBS per Runx2 o DMP1 immunofluorescenza colorazione. La concentrazione dell'anticorpo primario è 1: 400 per Runx2 e 1: 100 per DMP1.
8. Utilizzare un tubo da 1,5 ml per prepararela soluzione rabbit IgG come controllo per immunofluorescenza per evitare falsi risultati positivi. La soluzione contiene 2% siero di capra in PBS. La concentrazione di IgG di coniglio per il controllo Runx2 è 1: 400; per DMP1, 1: 100. Eseguire l'esperimento e di controllo colorazione contemporaneamente.
9. Utilizzare una provetta da 1,5 ml per preparare una soluzione di anticorpo secondario che contiene 2% di siero di capra in PBS per Runx2 o DMP1 immunofluorescenza colorazione. Utilizzare l'anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 500.

3. Far scorrere Preparazione per la microscopia confocale (cellulare Lineage Tracing Solo, nessuna combinazione con immunofluorescenza)

1. Iniettare tamoxifene nel Agg-cre ^ERT2 topi in un punto di tempo favorevole.
   1. In primo luogo, rimuovere un mouse dalla sua gabbia. Quindi, utilizzare il pollice e l'indice sinistro per afferrare la pelle del dorso del mouse e capovolgerlo, esponendo l'addome. Usare la mano destra per tenere la siringa. Il punto di ingresso ottimale per l'iniezione è sul lEFT o sul lato destro della all'ipogastrio, evitando il fegato e vescica.
   2. Tenere la siringa parallelo alle zampe posteriori del mouse e iniettare per via intraperitoneale. Il dosaggio iniettabile è 75 mg / kg. I pesi dei topi all'età di 2 settimane, 3 settimane e 4 settimane di vita sono circa 7-9 g, 11 - 13 g, e 16 - 18 g, rispettivamente.
2. Anestetizzare i topi con una combinazione Xilazina / Ketaset.
   1. Per preparare la soluzione di lavoro, prima diluire la xylazina e Ketaset con acqua distillata alla concentrazione di 1 mg / ml e 5 mg / ml, rispettivamente. Avanti, mescolare il Xilazina e Ketaset in un rapporto 1: 2. Il dosaggio per iniezione è di 30 ml / g.
   2. Iniettare come al punto 3.1. Confermare l'anestesia pizzicando caviglia del mouse. Il mouse è incosciente se non ha alcuna reazione.
3. Perfusione i topi con 4% PFA dopo anestesia.
   1. Dopo il mouse perde conoscenza, fissare le quattro gambe del mouse su una scheda per entirely esporre l'addome.
   2. Saturare l'addome con il 70% di etanolo ed effettuare una escissione dal basso addome al collo lungo la linea mediana. Pinch e contemporaneamente tirare la pelle ai fianchi laterali per rivelare la membrana peritoneale. Usare le forbici dissezione per fare un escissione longitudinale.
   3. Tagliare e rimuovere le costole anteriori per esporre il cuore. Forare il cuore dal ventricolo sinistro con una siringa da 22 G, tenere la siringa, e contemporaneamente tagliare una fessura nel padiglione auricolare destro.
   4. Iniettare lentamente il 4% PFA, che viene perfuso lungo il sistema cardiovascolare, mentre le vampate sangue dal taglio dal atrio destro. Il volume della PFA per perfusione è 1 ml / grammo. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza di classe I che è difficile-canalizzato per il sistema di scarico dell'edificio.
4. Rimuovere la pelle del topo e si inserisce il corpo intero in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml contenente 40 ml di 4% PFA fissare notte a 4 ° C.
5. Utilizzare forbici dissezione e # 3 e # 5 pinze per rimuovere accuratamente la mandibola e gamba posteriore dal corpo e per rimuovere i muscoli e tendini sulla superficie. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza di classe I che è difficile-canalizzato per il sistema di scarico dell'edificio.
6. Tagliare la mandibola in due parti in corrispondenza della zona distale del terzo molare. Analogamente, tagliare il femore e la tibia in mediopeniene per esporre la cavità del midollo osseo al fine di accelerare la decalcificazione. Mettere la parte che comprende il processo condilo e condilare e con la zampa posteriore in 40 ml di 10% EDTA decalcificare a 4 ° C per 2 - 4 giorni in una provetta di polipropilene da centrifuga da 50 ml.
7. Utilizzare 50 ml di 15% di saccarosio per disidratare il condilo e zampa posteriore notte a 4 ° C in una provetta di polipropilene da centrifuga da 50 ml.
8. Utilizzare 30% di saccarosio per disidratare il condilo e zampa posteriore notte a 4 ° C in un 50-ml tubo di polipropilene centrifuga.
9. Lungo il piano sagittale, incorporare il campione conOttobre sul piatto di taglio nella macchina cryosection.
   1. Orizzontalmente gettare le condilo o la zampa posteriore nello stampo di montaggio. Immergere il tessuto in OCT e lasciarlo in macchina cryosection fino personalizzazione di Office si blocca.
   2. Montare il blocco di ottobre sulla piastra di taglio. Attendere circa 15 minuti prima del taglio per garantire che i PTOM è completamente congelato.
10. Tagliare il condilo e gamba posteriore in sezioni di 10 micron. Raccogliere le sezioni su diapositive e conservare a -20 ° C.
11. Incubare il vetrino in una camera 37 ° C per rimuovere l'acqua prima della colorazione.
12. Lavare i vetrini due volte con acqua distillata per 5 min.
13. Rimuovere l'acqua intorno ogni sezione. Utilizzare una penna barriera idrofobica a fare il giro delle sezioni e rilasciare DAPI o non-fluorescenti soluzione di montaggio anti-sbiadimento nel cerchio. adagiarvi la polizza di copertura.

4. la colorazione immunoistochimica per Runx2 e DMP1

NOTA: L'aria IgGcontrollo è necessario per la colorazione immunoistochimica per evitare segnali falsi-positivi. La colorazione per i gruppi trattati e di controllo deve essere eseguita simultaneamente.

1. Incubare i vetrini in una camera 37 ° C per rimuovere l'acqua prima della colorazione.
2. Lavare i vetrini due volte con acqua distillata.
3. Utilizzare la penna barriera idrofobica a cerchio tutte le sezioni sul vetrino. Da questo punto, aggiungere tutta la soluzione preparata nel cerchio per coprire completamente le sezioni.
4. Trattare le sezioni con ialuronidasi in una camera umida a 37 ° C per 30 min. Il volume della soluzione (a passi di 4,5 - 4,8) dipende dalle dimensioni della sezione. Utilizzare 50 ml di soluzione per il condilo e 100 ml per il lungo osso. Lavare con PBST (PBS contenente 0,1% di Tween 20) tre volte.
5. Preparare e applicare la soluzione di blocco per ogni sezione e incubare in una camera umida per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Incubare le sezioni con primariesoluzione di anticorpi (Runx2 coniglio anti-topo o di coniglio anti-topo DMP1) a 4 ° C durante la notte. Lavare con PBS per tre volte.
7. Incubare le sezioni con soluzione di anticorpo secondario (goat anti-rabbit, Alexa Fluor 488) per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con PBS per tre volte.
8. Pulire l'acqua intorno alla sezione e rilasciare DAPI nel cerchio per coprire la sezione sulla diapositiva. adagiarvi la polizza di copertura.

5. Microscopia confocale

1. Catturare immagini di cellule fluorescenti usando un microscopio confocale a lunghezze d'onda che vanno da 488 micron (verde) a 561 micron (rosso). Una serie di immagini sovrapposte a 200 Hz (dimensioni di 1.024 × 1.024) ¹⁹ utilizzando 10X, 20X, 63X e lenti.

Risultati

I condrociti Direttamente trasformarsi in cellule ossee (osteoblasti e osteociti) nel mandibolare Condilo e delle ossa lunghe.

Aggrecan, un gene critico per condrogenesi, si esprime soprattutto nelle prime e mature condrociti ^18. Come risultato, l'iniezione di tamoxifene a 2 settimane di età in AGG-Cre ^ERT2; Topi Rosa26 ^tdTomato attivati il giorn...

Discussione

A causa di limitazioni tecnologiche, è sempre difficile studiare il comportamento delle cellule in vivo. Tuttavia, la tecnica linea cellulare tracciamento sta dimostrando di essere un potente strumento per lo studio della biologia delle cellule ^7-9. In questo studio, abbiamo migliorare ulteriormente questo protocollo attraverso la combinazione con immunofluorescenza. In questo modo, il destino della cellula può essere definita da più marcatori correlate, che estende l'applicazione di lineage t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS