Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal

Zusammenfassung

Wir entwickelten zwei Sätze von Kombinationen in Rosa26 ^tdTomato Tracing (ubiquitär in allen Zellen exprimiert) / Cre (insbesondere in Chondrozyten exprimiert) Mäuse: eine mit 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und eine mit Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen die direkte Umwandlung von Chondrozyten in Knochenzellen.

Zusammenfassung

Die Zelllinie Tracing-System wurde in erster Linie in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Die Verwendung von Cre-Rekombinase erlaubt die Aktivierung des Reporters in einer bestimmten Zelllinie und alle Nachkommen. Hier haben wir die Zelllinie Tracing - Technik verwendet , um nachzuweisen , dass Chondrozyten direkt verwandeln sich in Osteoblasten und Osteozyten während der langen Knochen und Kiefergelenkkopfs Entwicklung unter Verwendung von zwei Arten von Cre, Col10a1-Cre und Aggrecan-Cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2), gekreuzt mit Rosa26 ^tdTomato. Sowohl Col10 und Aggrecan sind gut erkannt Marker für Chondrozyten.

Auf dieser Basis haben wir eine neue Methode-cell lineage in Verbindung mit fluoreszierenden Immunhistochemie-to Verfolgungszellschicksal bestimmen, indem die Expression von spezifischen Zellmarkern analysiert. Runx2 (ein Marker für osteogene Zellen im Frühstadium) und Dentinmatrix protein1 (DMP1; ein Marker für osteogene Zellen im Spätstadium) warenverwendet, um Chondrozyten stammende Knochenzellen und deren Differenzierungsstatus zu identifizieren. Diese Kombination erweitert nicht nur die Anwendung von Zelllinie Verfolgung, sondern vereinfacht auch die Erzeugung von Verbindung Mäusen. Noch wichtiger ist, sind die Anzahl, Position und Differenzierung Status der Mutterzelle Nachkommen gleichzeitig angezeigt, Tracing allein mehr Informationen als Zelllinie bereitstellt. Abschließend ist die Co-Anwendung von Zelllinie Verfolgungstechniken und Immunofluoreszenz ein mächtiges Werkzeug der Zellbiologie in vivo zu untersuchen.

Einleitung

Während der Entwicklung Konten endochondral Knochenbildung für mehr als 80% des Skelettvolumen. Es wird allgemein angenommen, dass es mit der Apoptose von hypertrophen Chondrozyten beginnt. Anschließend dringen in die Zellen von der darunter liegenden Knochenmark und initiieren Angiogenese, gefolgt von einer Knochenneubildung durch aus Knochenmark und Periost-abstammenden Zellen ^1,2. Die Zelle Schicksal von hypertrophen Chondrozyten (HC-) jedoch seit Jahrzehnten ³ eine Frage der Debatte. Zunächst wurden HCs als das Ende der Chondrozyten-Differenzierungsweges zu sein, und wurde Apoptose allgemein das endgültige Schicksal der HCs zu denken. Jetzt schlagen einige Forscher, dass zumindest einige HCs überleben könnten und tragen zur enchondralen Knochenbildung. Obwohl sie , dass das Wachstum Platte Chondrozyten hatte die Fähigkeit , in Osteoblasten auf Ultra, immunhistochemischen Färbung und in vitro basierend auf transdifferentiate vorgeschlagenen Studien ^46, keine dieser Methoden wehe endgültige Chondrozyten Beitrag zur Osteoblasten-Linie zu demonstrieren.

Die Zelllinie Tracing-Technik liefert eine strengere Weise Zellschicksal zu studieren. Kurz gesagt, eine Rekombinase-Enzym, das nur in einem bestimmten Zelltyp exprimiert wird, stimuliert die Expression des Reportergens. Auf diese Weise kann diese Art von Zelle und ihre Nachkommen sind ⁷ dauerhaft markiert. Das Cre-loxP-System wird häufig in Lineage Tracing verwendet. Cre (die Rekombinase - Enzym) wird die STOP - Sequenz zwischen den zwei loxP - Stellen und aktivieren Sie den Reporter in einer bestimmten Zelllinie (Abbildung 1A) auszuschneiden. In einigen Fällen kann der Prüfer einen günstigen Zeitpunkt wählen Cre zur Aktivierung durch ein Medikament, wie Tamoxifen verwendet, Cre was bewirkt , daß eine modifizierte Form des Östrogenrezeptors (Cre ^{ERT2) 8} zu verschmelzen. Fluorescent Reporter haben die Standard-in-Linie Tracing-Experimente geworden, weil sie drastisch die Komplexität reduzierenund verbessern die Genauigkeit und Effizienz des Zellschicksals Tracing ^8,9. tdTomato wird immer die beste Wahl unter den fluoreszierenden Reportern , da es die hellsten fluoreszierende Protein und das stärkste Epifluoreszenz- hat, so dass es leicht ⁷ (Abbildung 1A) sichtbar gemacht .

Durch die Nutzung der Rosa26 ^tdTomato Linie Tracing - System, unsere Gruppe und andere Forscher gezeigt , dass HCs ihren Phänotyp in Knochenzellen während der Entwicklung ^{10 bis 14} ändern. Um dies zu erreichen, entwickelten wir zwei Sätze von Kombinationen mit Rosa26 ^tdTomato (ubiquitäre Expression in allen Zellen) / Cre (spezifisch für Chondrozyten) -Mäuse Tracing: 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen , dass beide Methoden sind gangbare Wege des Zellschicksals in vivo zu untersuchen.

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Protokoll

Alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Texas A & M University College of Dentistry, geprüft und genehmigt.

1. Tierzüchtung

1. Verwenden Sie drei Tiermodellen in dieser Studie. Um das Schicksal der embryonalen Chondrozyten in Kondylus Bildung, dem ersten Gebrauch Col10a1-Cre ¹⁵ Mäuse untersuchen und überqueren sie mit Rosa26 ^tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor ^{TM9 (CAG-tdTomato) hze} / J) Mäuse zu erhalten Col10a1- Cre und Rosa26 ^tdTomato Mäuse. Als nächstes überqueren diese Mäuse mit 2.3Col1a1-GFP - Mäuse ^16. Verwenden Sie Col10a1-Cre; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP - Mäuse die Zelllinie Verfolgungsexperimente (1B) durchzuführen.
2. Um das Schicksal der postnatalen Chondrozyten studieren, folgen dem gleichen Verfahren wie in Schritt 1.1, sondern verwenden Sie die Aggrecan-cre ^ERT2 (Agg-Cre ^ERT2) ^17,18 Leitung und die Agg-Cre ^ERT2 halten; Rosa26 ^tdTomato; 2.3Col1a1-GFP - Mäuse die Zelllinie Verfolgungsexperimente (1C) durchzuführen. Injizieren Tamoxifen am postnatalen Tag 14.
3. Um die Zelllinie kombinieren Technik mit Immunofluoreszenz Tracing, überqueren Agg-Cre ^ERT2 Mäuse und Rosa26 ^tdTomato Mäuse. Verwenden Sie Mäuse , die beide Gene in das Experiment durchführen und injizieren die Tamoxifen auf postnatalen Tag 3 (Abbildung 1D).

2. Materialvorbereitung

1. Man löst das Tamoxifen Pulver in 10% Ethanol und 90% Maisöl in einer Konzentration von 10 mg / ml. Die Dosierung für Injektion 75 mg / kg.
2. Auflösen des Paraformaldehyd (PFA) -Pulver in PBS auf eine Konzentration von 4% unter Verwendung von 2 M Natronlauge den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Verwenden Sie 4% PFA-Lösung um das Gewebe zu fixieren (die Kondylus und Hinterbein verwendet hier) nach der Tötung. Wegen seinerToxizität, Griff PFA in der Haube mit Handschuhen und Gesichtsmaske.
3. Löse das EDTA-Pulver in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 10% unter Verwendung von 2 M Natronlauge den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Verwenden Sie 10% EDTA des Kondylus und Hinterbein zu entkalken.
4. Auflösen Saccharosepulver in PBS bei Konzentrationen von 15% und 30%. Verwenden Sie die Saccharose-Lösung in das Gewebe nach dem Entkalken zu entwässern.
5. Man löst das Hyaluronidase Pulver in PBS bei einer Konzentration von 2 mg / ml, pH 5,0. Diese Lösung ist für Immunofluoreszenz Antigen Retrieval.
6. Verwenden, um eine 1,5-ml-Röhrchen eine blockierende Lösung herzustellen, die 3% Rinderserumalbumin enthält (BSA) und 20% Ziegenserum in PBS für Runx2 oder DMP1 Immunofluoreszenzfärbung.
7. Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer primären Antikörperlösung herzustellen, die für Runx2 oder DMP1 Immunfluoreszenzanfärbung in PBS 2% Ziegenserum enthält. Die Konzentration des primären Antikörpers beträgt 1: 400 für Runx2 und 1: 100 für DMP1.
8. Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen herzustellendas Kaninchen-IgG-Lösung als Kontrolle für Immunfluoreszenzanfärbung falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Die Lösung enthält 2% Ziegenserum in PBS. Die Konzentration des Kaninchen-IgG für Runx2 Kontrolle 1: 400; für DMP1, 1: 100. Führen Sie das Experiment und die Steuerung gleichzeitig Färbung.
9. Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen einen sekundären Antikörper-Lösung herzustellen, die für Runx2 oder DMP1 Immunfluoreszenzanfärbung in PBS 2% Ziegenserum enthält. Verwenden Sie den sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 500.

3. Schieben Vorbereitung für die konfokale Mikroskopie (Cell Lineage Tracing Nur, keine Kombination mit Immunfluoreszenz)

1. Injizieren Tamoxifen in der Agg-cre ^ERT2 Mäuse zu einem günstigen Zeitpunkt.
   1. Erstens, eine Maus aus dem Käfig entfernen. Verwenden Sie dann den linken Daumen und Zeigefinger die Haut auf der Rückseite der Maus zu greifen und umdrehen, Freilegung der Bauch. Verwenden Sie die rechte Hand auf die Spritze halten. Die optimale Einstiegspunkt für die Injektion ist auf der links oder rechten Seite des Unterbauches, die Vermeidung der Leber und der Blase.
   2. Halten Sie die Spritze parallel zu den Hinterbeinen der Maus und injizieren intraperitoneal. Die Dosierung für Injektion 75 mg / kg. Die Gewichte der Mäuse im Alter von 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen alt sind etwa 7 bis 9 g, 11-13 g und von 16 bis 18 g.
2. Anästhesieren die Mäuse mit Xylazin / Ketaset Kombination.
   1. Um die Arbeitslösung herzustellen, verdünntem zuerst die Xylazin und Ketaset mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 1 mg / ml und 5 mg / ml. 2-Verhältnis: Als nächstes wird in einem 1 die Xylazin und Ketaset mischen. Die Dosierung für Injektion 30 & mgr; l / g.
   2. Injizieren, wie in Schritt 3.1. Bestätigen Sie die anesthetization mit der Maus Knöchel Kneifen. Die Maus ist bewusstlos, wenn es keine Reaktion.
3. Perfuse die Mäuse mit 4% PFA nach anesthetization.
   1. Nachdem der Maus das Bewusstsein verliert, fixieren die vier Beine der Maus auf einem Brett zu entirely den Bauch aus.
   2. Tränken Sie den Bauch mit 70% Ethanol und machen eine Exzision von den unteren Bauch bis zum Hals entlang der Mittellinie. Einzuklemmen und gleichzeitig die Haut zu den seitlichen Seiten ziehen, um die Peritonealmembran offenbaren. Verwenden Sie Dissektion Schere, um eine Längs Exzision machen.
   3. Abgeschnitten und entfernen Sie die vorderen Rippen das Herz aussetzen. Stechen Sie das Herz aus dem linken Ventrikel mit einer 22 G Spritze, halten Sie die Spritze, und gleichzeitig einen Schlitz in der rechten Ohrmuschel schneiden.
   4. Langsam injizieren, um die 4% PFA, die entlang des Herz-Kreislauf-System, während die Blutwallungen aus dem Schnitt von der rechten Ohrmuschel perfundiert wird. Das Volumen des PFA für die Perfusion beträgt 1 ml / Gramm. Führen Sie diesen Schritt in der Klasse I Biosicherheitsschrank, der auf das Gebäude Abgasanlage hart geleitet ist.
4. Ziehen Sie die Haut der Maus und setzen den ganzen Körper in einen 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen, die 40 ml 4% PFA enthält über Nacht bei 4 ° C zu beheben.
5. Verwenden Dissektion Schere und # 3 und # 5 Pinzette vorsichtig die Mandibula und Hinterbein aus dem Körper zu entfernen und die Muskeln und Sehnen auf der Oberfläche zu entfernen. Führen Sie diesen Schritt in der Klasse I Biosicherheitsschrank, der auf das Gebäude Abgasanlage hart geleitet ist.
6. Schneiden, den Unterkiefer in zwei Teile an dem distalen Bereich des dritten molar. In ähnlicher Weise schneiden die Femur und Tibia in den midshaft die Knochenmarkhöhle, um Entkalkung zu beschleunigen auszusetzen. Setzen Sie den Teil, der die Kondylen und Gelenkfortsatz und zusammen mit dem Hinterbein in 40 ml 10% EDTA enthält für 2 bei 4 ° C zu entkalken - 4 Tage in einem 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
7. Verwenden 50 ml 15% Sucrose Kondylus und Hinterbein zu entwässern über Nacht bei 4 ° C in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
8. Verwenden 30% Saccharose Kondylus und Hinterbein über Nacht bei 4 ° C in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen zu dehydratisieren.
9. Entlang der Sagittalebene, betten die Probe mitOktober auf der Schneidplatte in der Kryoschnittes Maschine.
   1. Horizontal lag der Kondylus oder die Hinterbein in der Montageform. Tauchen Sie das Gewebe in OCT und lassen Sie ihn in der Kryoschnittes Maschine, bis die OCT gefriert.
   2. Montieren Sie den Oktober-Block auf der Schneidplatte. Warten Sie ca. 15 Minuten vor dem Schneiden, um sicherzustellen, dass die OCT vollständig gefroren ist.
10. Schneiden Sie den Gelenkkopf und Hinterbein in 10-um-Schnitte. Sammeln Sie die Abschnitte auf Folien und bei -20 ° C.
11. Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C Kammer das Wasser vor der Färbung zu entfernen.
12. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit destilliertem Wasser für 5 min.
13. Wischen Sie das Wasser um jeden Abschnitt aus. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift, um die Abschnitte zu umkreisen und fallen DAPI oder nicht-fluoreszierendes anti-fade Montagelösung in den Kreis. legen Sie die Abdeckung vorsichtig nach unten rutschen.

4. immunhistochemischen Färbung für Runx2 und DMP1

HINWEIS: Die IgG-control ist notwendig für die immunhistochemischen Färbung falsch-positive Signale zu vermeiden. Die Färbung für die Versuchs- und Kontrollgruppen muss gleichzeitig durchgeführt werden.

1. Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C Kammer das Wasser vor der Färbung zu entfernen.
2. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit destilliertem Wasser.
3. Verwenden Sie die hydrophobe Barriere Stift alle Abschnitte auf der Folie zu umkreisen. Von diesem Schritt werden alle der hergestellten Lösung in den Kreis in den vollständig die Abschnitte umfassen.
4. Behandlung der Schnitte mit Hyaluronidase in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 30 min. Das Volumen der Lösung (in Schritten von 4,5 bis 4,8) ist abhängig von der Größe des Abschnitts. Verwenden Sie 50 ul Lösung für die Kondylus und 100 & mgr; l für den langen Knochen. Waschen mit PBST (PBS, das 0,1% Tween 20 enthält) dreimal.
5. Vorbereiten und gelten für jeden Abschnitt die Blockierungslösung und Inkubation sie in einer feuchten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
6. Inkubieren Sie die Abschnitte mit primärenAntikörper-Lösung (Kaninchen-anti-Maus Runx2 oder Kaninchen-anti-Maus DMP1) bei 4 ° C über Nacht. Waschen mit PBS dreimal.
7. Inkubieren der Schnitte mit sekundären Antikörperlösung (Ziege-anti-Kaninchen, Alexa Fluor 488) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen mit PBS dreimal.
8. Wischen Sie das Wasser um den Abschnitt und fallen DAPI in den Kreis aus dem Abschnitt auf der Folie abzudecken. legen Sie die Abdeckung vorsichtig nach unten rutschen.

5. konfokale Mikroskopie

1. Erfassen fluoreszierenden Zellbildern ein konfokales Mikroskop bei Wellenlängen im Bereich von 488 & mgr; m (grün) bis 561 um (rot). Nehmen Sie mehrere gestapelte Bilder bei 200 Hz (Abmessungen von 1.024 × 1.024) ¹⁹ unter Verwendung von 10X, 20X, 63X und Linsen.

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Ergebnisse

Chondrozyten Transform direkt in Knochenzellen (Osteoblasten und Osteozyten) in der Kondylus und langen Knochen.

Aggrecan, ein kritisches Gen für Chondrogenese, ist vor allem in der frühen und reifen Chondrozyten ¹⁸ ausgedrückt. Als Ergebnis der Injektion von Tamoxifen bei 2 Wochen alten in Agg-Cre ^ERT2; Rosa26 ^tdTomato Mäusen aktiviert , um die r...

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Diskussion

Aufgrund der technologischen Einschränkungen , ist es immer schwierig , das Verhalten von Zellen in vivo zu untersuchen. Allerdings erweist sich die Zelllinie Tracing - Technik für das Studium der Zellbiologie ^7-9 ein mächtiges Werkzeug zu sein. In dieser Studie, verbessern wir weiter dieses Protokoll indem sie sie mit Immun kombiniert. Auf diese Weise kann das Zellschicksal von mehreren verwandten Marker definiert werden, die die Anwendung von Lineage Tracing erweitert. Darüber hinaus ist diese ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648	activate the Cre event
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid	Alfa Aesar	A10713	decalcify the hard tissue
Sucrose	Sigma	S0389	dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H4272	retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin	Sigma	A3059	blocking solution
primary antibody for Runx2	Cell Signal	D1L7F	primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1	provided by Dr. Chunlin Qin		primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG	Sigma	18140	control for immunochemical staining
secondary antibody	Invitrogen	A11008	second antibody for immunochemical staining
OCT	Tissue-Tek	4583	embed the sample for frozen section
Tween 20	Fisher Scientific	BP337	PBST
non-fluorescing antifade mountant	Life technologies	P36934	mounting slides
DAPI	Life technologies	P36931	nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories		circle the section on the slide for for immunochemical staining
Xylazine	AnaSed		anesthetization
Ketaset	Zoetis		anesthetization
cryosection machine	Leica	CM1860 UV
confocal microscope	Leica	DM6000 CFS