成像中性粒细胞吞噬体和细胞质使用比例测量pH指示剂

摘要

这手稿描述了一种简单的方法来测量吞噬体的pH值和面积以及使用比率量度指示器seminaphthorhodafluor（SNARF）-1，或S-1人和小鼠嗜中性粒细胞的胞质pH值。这是使用活细胞共聚焦荧光显微镜和图像分析来实现的。

摘要

中性粒细胞是宿主先天防御的关键，因此，构成医学研究的一个重要领域。吞噬，细胞内的车厢中吞噬颗粒的杀戮和消化发生，对于那些需要精确调节中性粒细胞杀灭病原体的主要舞台。吞噬体的pH是仔细控制，反过来调节抗微生物的蛋白酶活性的一个方面。许多荧光pH敏感的染料已被用于可视化的吞噬体环境。 S-1具有比其它pH敏感染料，包括它的双发射光谱，其光漂白性和其高的pKa几个优点。使用这种方法，我们已经表明，中性粒细胞吞噬是相较于其他吞噬细胞异常碱性。通过使用染料的不同生物化学缀合，吞噬体可以从细胞质划定使得在吞噬体的大小和形状的变化进行评估。这使得˚F或进一步的监测离子的运动。

引言

中性粒细胞是人体内最丰富的先天免疫细胞。它的主要功能包括巡逻血流和吞噬并消化，它可能在被称为吞噬^1,2的过程遇到外来颗粒。这些颗粒中降解称为吞噬细胞内舱。中性粒细胞NADPH氧化酶的亚型NOX2，活化引发生物化学反应的级联，在病原体死亡高潮。 NOX2蛋白质亚基进行到形成在吞噬体膜³的电子传递链复合体。一旦被激活，它从NADPH穿过膜传输电子到分子氧吞噬体内的，从而产生超氧阴离子和进一步的活性​​氧物种。这被称为呼吸爆发，并且它被认为是用于有效微生物杀伤和消化²必不可少。然而，负电荷穿过膜这个独特的运动很快就会失活NOX2，如果它不是由正电荷移动的和/或负电荷移出吞噬的补偿。已经公认的是大多数在中性粒细胞电荷补偿由质子通道HVCN1 ^4,5进行。这个信道允许质子向下从细胞质到吞噬体它们的电化学梯度的被动运动。质子浓度通过pH反射，所以对于氧化酶活性的给定电平，测量pH在吞噬体可以提供在电荷补偿质子和非质子途径的相对参与信息。

的人嗜中性白细胞吞噬体具有大约8.5 20-30分钟吞噬⁵后的碱性pH值。这意味着在NOX另外的非质子离子通道的存在2诱导的电荷补偿，作为融合和的酸性颗粒和鞋底补偿由HVCN1的内容物的释放将维持酸性环境，而相比之下，所观察到的。离子的移动，以补偿该负电荷也可经由渗透施加在吞噬体大小的变化。这些存在于高生理浓度的中性粒细胞可以是离子:钾离子已经显示出移动到吞噬体^6，和氯化物离子的运动是另一个候选为嗜中性粒细胞功能⁷重要。

pH值在吞噬体的调节是用于抗微生物蛋白酶活性⁵是至关重要的。髓过氧化物酶（MPO）似乎具有最佳活性在pH 6，而对于组织蛋白酶G和弹性蛋白酶的最佳水平为pH 7-9和pH 8-10，分别为^5。因此，在吞噬体的pH瞬时变化可以针对不同的酶，以提供有趣的活动龛ction。了解pH值如何参与嗜中性粒细胞杀死微生物可以提供新颖的嗜中性粒细胞增强微生物剂的设计的有用信息。

中性粒细胞吞噬体是一种高活性的环境。这使得难以准确评估pH值，因为染料可能容易被氧化，从而导致技术假象。从历史上看，异硫氰酸荧光素（FITC）已选择的染料来测量细胞内pH ^8,9。然而，也有一些缺点为其测量中性粒细胞吞噬小体的pH使用。它具有6.4 ¹⁰的pKa，这意味着它只能精确地被用于pH水平评估为5至7.5 ^8，因为它饱和在pH <8 ^11。由于嗜中性粒细胞吞噬体pH值可以变得更加碱性^5，FITC不能捕获全面的潜在的pH变化。进一步signifi嗜中性粒细胞中的上下文中倾斜问题用FITC是，它被认为是由MPO ¹²光漂白。的MPO抑制剂，叠氮化钠，可以用来限制光漂白^13，但它已经表明，叠氮化钠直接降低了pH值吞噬体中的MPO无关的方式，并因此在这样的测定⁵不当使用。

相对于其他细胞内的染料，S-1具有7.5 ¹⁰相对高的pKa。在酸性条件下，该分子是质子化的并且当在488纳米或以上激发产生560和600纳米之间的发射信号。当在分子中更多的碱性条件下脱质子化，发射波长为600纳米。在这两个波长的荧光强度的比例表示发光移，这是更比单一荧光测量可靠，因为它是由荧光团浓度和细胞结构的影响。 S-1可以缀合至抗原性材料，例如酵母聚糖^14，虽然热灭活（HK） 白色念珠菌是优选的，因为较大的表面积给出了更一致的荧光读数。

我们也使用这种方法的修改来研究pH值随时间的变化（ 图^3）5。此胞质pH值的测定方法可容易地应用于其它类型的细胞中，与多种碱性吞噬体¹⁴中别处描述^15，16，和细胞。

研究方案

伦理声明:所有的动物工作与许可和英国内政部的批准下进行。在这项研究中人类参与的人类研究伦理被批准为联合UCL / UCLH委员会。所有参加者签署知情同意书。

1. 白色念珠菌的制备

1. 成长念珠菌盘显示（参见材料列表）上的YPD琼脂平板上按照制造商的说明。挑选一个菌落，并将其添加到15毫升YPD肉汤中。孵育它在振荡培养箱中于30℃和200rpm下，直到液是混浊（通常约2天，或至大约在1×10 ⁹ / mL的浓度）。
2. 降速念珠菌介质和在50mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）的重悬它。离心机中以3000×g离心10分钟。重复此步骤两次。
3. 放置含50毫升PBS / 念珠菌介质的管在预热至60℃的水浴中，以使整个管为submerged 1个小时。
   1. 为了确认念珠菌是热灭活的，条纹的样品到YPD琼脂平板上，并在30℃下孵育过夜。调整热灭活（HK） 念珠菌浓度为5-9×10 ^8个 / ml，取决于念珠菌生长，并且它在一个-20存储在1mL等分试样℃冷冻机中。
      注意:使用自动细胞计数器进行该协议中的所有细胞计数。

2. S-1耦合到热杀死（HK） 念珠菌

1. 通过在100μL高档二甲基亚砜（DMSO）稀释制备羧基-S-1琥珀酰亚胺酯（50微克）的等分试样。涡以及混合。
2. 在一个15毫升管中准备在0.1M碳酸氢钠（pH为8.3）1毫升1×10 ⁸ HK 念珠菌 。
3. 添加100μL羧基-S-1在时刻到HK 念珠菌 ，同时在涡旋混合以大约2000rpm的转速（中到高速）一滴。包装铝FOI升管周围，并将其放置在滚筒上在室温下1个小时。
4. 通过以2250×g下，每次10分钟洗HK Candida- S-1（HKC-S-1）的三倍。对于前两个洗涤，重新悬浮在15毫升的0.1M碳酸氢钠（pH值8.3）的沉淀。在第三次洗涤后，重悬它在1mL平衡盐溶液（BSS）的缓冲液（ 见表1）。
5. 转移HKC-S-1悬浮液为在100μL等分试样管，并将它们存储在-20℃。
   注:具有低表面结合材料，如果可能的话，使用如管HKC-S-1颗粒可能会粘到正常离心管的壁上。
6. 调理HKC-S-1
   1. 对于人嗜中性粒细胞，人IgG的血清加入100微升至100微升的解冻HKC-S-1。
   2. 对于小鼠嗜中性粒细胞，加入正常小鼠血清的50μL和小鼠念珠菌免疫血清的^50μL5至100μL（从与HK 念珠菌注射C57B6小鼠中产生）的HKC-S-1。
   3. 混合它在热摇床在37℃和1,100rpm下60-90分钟，然后在4℃下辊2小时。
   4. 通过以17200×g离心洗BSS缓冲液三次，每次1分钟。重悬在100μLBSS缓冲液中。

3.中性粒细胞的分离

1. 对于人外周血嗜中性粒细胞，从健康供体取15毫升的血液通过静脉穿刺，将其放入含有90μL的1000 IU / mL肝素钠溶液（60微升肝素/ 10毫升的血液）在20mL注射器中。
2. 使用移液管尖端，注入1.5毫升的10％的葡聚糖溶液到注射器。轻轻翻转的3倍，让它在板凳上直立。
3. 等待30-60分钟，直到血液被对半大致分裂，具有顶部血沉棕黄层是稻草色和包含红细胞的底层。
4. 小心通过针推出前层或用移液管尖端将其删除。把它放在我呐15mL的管中。避免服用了红层。使用5毫升吸管，加入3-4毫升的密度梯度介质的（见材料列表）的血沉棕黄层下的管，以获得两个不同的层的底部。离心机中以913×g离心10分钟。
   注意:如果使用小鼠嗜中性粒细胞（参见附图¹⁷为嗜中性粒细胞的小鼠隔离），使用已被从骨髓冲洗代替细胞悬浮液。
5. 倒掉上清，留下红色沉淀后面。轻轻涡旋打扰颗粒。添加7毫升蒸馏水，高压灭菌H ₂ O与沉淀和反转20秒，以重悬沉淀。加入7毫升2X生理盐水和颠倒几次混合，裂解剩余的红血细胞。
6. 离心机中以300×g离心5分钟。倒掉上清，重悬在BSS缓冲沉淀到大约4×10 ⁶ /毫升。
   注:对于细胞的最佳显微镜，保持1.5-6×10 ⁶之间的细胞悬浮液的浓度 /毫升。

4.幻灯片的制备

1. 预治疗的8孔显微镜板（参见材料列表）与多聚-L-赖氨酸的200μL（0.01％溶液）在各孔中，在室温下40-60分钟。
2. 除去聚-L-赖氨酸（可重复使用），并用蒸馏水H ₂ O的200μL洗涤孔两次
3. 添加在步骤3.6制得到各孔的细胞悬浮液的200μL。在室温下孵育30-60分钟。
4. 通过添加100μL高档DMSO的一个反应管中准备的5-（和-6） - 羧基S-1乙酰氧基甲基（S-1-AM）酯（50微克）的等分试样。涡旋混合。当不使用时，储存在-20℃。
5. 在小管中，加入1.7 mL的BSS缓冲液和S-1-AM的20μL。涡旋混合。
6. 用BSS缓冲液200μL洗涤各孔两次，然后替换为S-1-AM溶液的缓冲液中。注意不要轻轻吹打扰乱连接到井底细胞的单层顺着孔壁。在室温下孵育至少25分钟。
7. 用BSS缓冲液200μL洗涤各孔两次。为了测试抑制剂，弥补在BSS缓冲适当药物的"主混合物"。在抑制剂溶液洗涤各孔两次。
   注意:确保在控制使用的药物载体（ 例如，DMSO或乙醇）的相同量以及用于该抑制剂。如果在测试的氯化锌的效果，使用缺乏KH ₂ PO ₄缓冲液BSS（在HEPES缓冲液可以单独溶液），作为锌的磷酸盐沉淀。
8. 声处理调理HKC-S-1（第6.2节）中在5微米振幅大约3秒。加入10微升至每孔。孵育在37℃下将板15-20分钟，以允许细胞吞噬，使细胞准备要被成像为吞噬作用的快照。

5.共聚焦显微镜

1. 使用共焦显微镜，调节激光波长，使得第在所述细胞是在555nm处激发和发射是由两个通道或检测器检测:560-600纳米和600纳米。
   注意:特定显微镜参数将为每个显微镜不同，并且需要由研究人员进行优化。
2. 查看使用63X镜头油细胞。使用上连续设置一个瓦片扫描图像来查看中心瓦片。使用荧光强度和检测器通道的增益，调整焦距和激光的强度和两个信道的增益以优化图像。
3. 使用的设置，以查看两个通道分割图像;检查有在细胞质或空泡没有荧光强度的饱和。饱和度显示为红色圆点。降低激光的强度，以便有红点的最少数量，但这些细胞和吞噬足够明亮清楚地看到。
4. 满意后，点击"开始实验。" A 9瓦片扫描图像被生成。将图像保存为一个复杂的文件建议包含两个信道（未JPEG或TIFF）的一个合成图像的软件。

6.标定实验

1. 构造具有单独念珠菌 pH值标准曲线。
   1. 准备从pH为3.0缓冲器至13.0，按表1中 。
   2. 采取HKC-S-1中的一个等分试样（100微升）。旋下来在17200×g的1分钟。重悬它在所分配的缓冲器500μL。
   3. 从最低的pH范围内开始，悬浮液添加到一个预处理阱（步骤4.2）。放置在共聚焦显微镜载玻片上设置为37℃的加热阶段。
   4. 记录荧光每分钟10分钟。重复每个缓冲区。
2. 皂素标准曲线。
   1. 隔离1×10 ⁷人中性粒细胞⁵和重悬在1mL的最低pH值缓冲液中。
   2. 按照第4，用于测量页记载的方法hagosomal pH值在中性粒细胞。
   3. 与念珠菌悬浮液20分钟温育后，0.3％皂苷加入（10％储备的15μL到一个预处理阱（来自步骤4.2））的培养皿中，然后在37℃下孵育20分钟。拍摄图像每分钟10分钟。重复每个缓冲区。
3. 使用高K ⁺ /尼日利亚菌素技术 ^5，18，19 胞质pH标准曲线 。
   1. 弥补在表1中所描述的，从pH4.0至13.0的缓冲液。
   2. 按照步骤4.1-4.7，只留下嗜中性粒细胞在预处理的孔 - 每个孔包含不同的缓冲器。滑动添加到37℃下加热阶段并记录每分钟10分钟的荧光。
   3. 注意:可能需要一些时间对胞质pH至与外部溶液稳定，但在该点之后，在S-1的比例值变为不变。在每个实验中测定细胞外HKC-S-1可以作为控制来检查添加任何抑制剂不与S-1发射的荧光干扰或影响该缓冲区的pH值。

7.图像分析

注:在这里，提供了使用免费软件ImageJ的图像分析（荧光定量）的说明。建议ImageJ的使用。

1. 下载并安装ImageJ的版本> 1.46r按照开发者的指令（https://imagej.nih.gov/ij/）。安装附有此协议称为补充代码文件"吞噬体测量"。
2. 打开图像J和加载用于分析选择到工具栏上的图像文件。要结合这两个通道，使用图像>彩色>制造复合。
3. 右键单击，选择用于存储结果的文件。
4. 点击行工具工具栏上，然后双击来增加宽度＆＃34; 2"。
5. 绘制跨越吞噬体的宽度的线，然后单击右键"测量的pH"。两个通道的平均强度被获取时，以及它们的比率通过ImageJ中的代码文件中自动计算出来。
6. 在完成测量后，用鼠标右键单击，选择"保存文件"。
7. 为了测量吞噬面积，使用第四个图标沿工具栏绘制手绘周围的区域。右键单击选择"测量面积。"
   注:结果保存在选定的目录中生成一个日志文件。结果可以使用电子表格，R，或等价的软件进行处理。至pH荧光比之间的关系是S形近似，并且通过使用ImageJ分析生成的比率值可以使用广义后勤或S型函数或由直链的或三次样条插值被转换为pH值。
8. 为了测量细胞质，得出整个细胞质的线，然后右键单击"测量pH值"。

结果

图1表示不同来源的嗜中性粒细胞的快照以证明不同吞噬体环境。为了缓解定量分析，种子孔与适当的细胞数是很重要的:太多会导致细胞层在彼此之上，这使得难以精确地查看封闭吞噬体;太少的意志，当然，提供较少的结果，尤其是因为并非每个中性粒细胞吞噬会。 图2是是过饱和的图像;红色点表示已经检测最大荧光 - 这可以通过分割图像的两个信道之间（使用材料清单或等效的建议的显微镜软件）进行评估。这可以通过减小激光的强度来抵消。使用各种缓冲系统的校准曲线示于图3中 ，改编自Levine 等。 ^{5 <}/ SUP>。误差线表明，在读数之间的荧光一些变化。 图4给出了如何针对吞噬体的pH值和区域中的数据可以被呈现的示例。这种方法允许以一个过铺设箱线图显示每个单独的测量。但是，这些数据也可以被显示的直方图条形图英寸

图1:来自人和小鼠的嗜中性粒细胞的适当的快照图像。最右边是对应于pH值S-1染色的吞噬体的近似颜色的定性视觉系。黄色表示还有更多的酸度，而红色表示多种碱。 （A）示出了Hvcn1 ^{- / -}小鼠骨髓嗜中性粒细胞的吞噬作用后20分钟。吞噬体显得很红，碱性和肿胀。在的右下部分的红色箭头图像点到细胞内念珠菌 ，而在左上点到细胞外的粒子的箭头。 （B）示出了已摄取念珠菌的野生型小鼠骨髓嗜中性粒细胞;他们比Hvcn1碱性少得多^{- / -}细胞。 （C）示出了在后的吞噬作用的相同点的人外周血嗜中性粒细胞。他们似乎比野生型小鼠细胞稍微碱性，但吞噬体仍然没有大又红的Hcvn1 ^{- / -}细胞。 （D）示出了在5μM的二亚苯基碘（DPI）存在下已吞噬念珠菌人中性粒细胞。所有的吞噬体是非常酸性的，pH为6或更小;药物抑制NADPH氧化酶，所以没有补偿性离子运动。从该熔合到吞噬体酸性颗粒释放质子导致酸性pH ^20，并增加招募在V-ATP酶的至TH在用DPI ⁹处理E吞噬体膜。细胞质还与来自其他条件的细胞显得更为碱性。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:过饱和的Hvcn1 ^{- / -}小鼠骨髓中性粒细胞。它从其中的荧光数据是过饱和的解析图像排除是很重要的。如在第5.3节描述的那样，合成图像被分成两个图像（左上，红色箭头）与单独呈现两个通道。在该软件，范围指示器上选中（左下角，红色箭头），则它们是过饱和的任何像素是明亮的红色。有本过饱和在两个信道（1和2）。一个MAGNIF一些细胞的ication和胞外念珠菌显示在右下方，用箭头指向受影响的区域。分析这些点会导致错误的比例测量。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:S-1的荧光比率至pH测量转换标准校准曲线。 念珠菌独自在不同的缓冲液的标准曲线（标记为"TRIS"），并且当细胞用皂苷（"皂苷"）透化是非常相似的，显示出在S-1的内部和读出该单元（吞噬小体和胞外外介质）是相当的。误差条代表平均值±SD。当测试i中的S-1的比例/ pH值曲线被缩短n中的细胞质（"细胞质"），其应该被考虑在图像分析。该图已被从Levine 等改性。 ^5。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4:吞噬体的pH值和区域的定量。该图表示数据呈现的一个例子。示出了用于吞噬体比率和对应的pH值（ ^{- / -} Hvcn1小鼠骨髓嗜中性粒细胞），B::使用编程软件R. A中生成的图的野生型小鼠骨髓嗜中性粒细胞，C:人末梢血嗜中性粒细胞，和D:人嗜中性粒细胞用5μMDPI N =300分之3。单个测量被示出为小方块，与中介的重叠箱线图一和四分位数间距。红色条代表的意思。如在图1中的图像中看到，Hvcn1 ^{- / -}细胞具有非常碱性吞噬体相比野生型小鼠和人嗜中性粒细胞。它们还具有更大的吞噬体区域（ 图4B中，n =300分之3）。人中性粒细胞吞噬体稍微比野生型小鼠嗜中性粒细胞更碱性大，同时用DPI孵育的人中性粒具有非常酸性和小吞噬体。 请点击此处查看该图的放大版本。

平衡盐溶液（BSS）缓冲
氯化钠	156毫
氯化钾	3毫米
硫酸镁	2mM的
KH 2 PO 4	1.25毫米
氯化钙	2mM的
葡萄糖	10毫
HEPES	10毫
用NaOH或HCl pH 7.4的
YPD肉汤
YPD肉汤	50克
蒸馏水	1升
高压釜在121℃下15分钟
对于YPD琼脂:高压灭菌之前添加15g / L的琼脂
10％葡聚糖溶液
葡聚糖临床级		50克
氯化钠		4.5克
蒸馏水		500毫升
添加到玻璃瓶中，高压釜在121℃下15分钟
2X盐溶液
氯化钠		18克
蒸馏水		1升
添加到玻璃瓶中，高压釜在121℃下15分钟
10％皂素股票
BSS缓冲		50毫升
皂素		5克
热BSS缓冲至37℃，加入皂苷和混合。
在4℃加入0.1％叠氮化钠作为防腐剂，存储混合物。
校正缓冲液
念珠菌标准曲线
首先弥补0.15M的股票每个缓冲区的
弥补了0.15M的NaCl溶液
15mL的最终体积:5mL的期望的缓冲溶液的0.15 M + 10毫升0.15M的NaCl溶液
pH值3	100mM NaCl的	50mM的甘氨酸
pH值4	100mM NaCl的	50mM乙
pH值5	100mM NaCl的	50mM乙
pH为6	100mM NaCl的	50mM乙
pH值7	100mM NaCl的	的50mM Tris
pH值8	100mM NaCl的	的50mM Tris
pH值9	100mM NaCl的	的50mM Tris
pH值10	100mM NaCl的	50mM的甘氨酸
pH值11	100mM NaCl的	50mM磷酸盐
pH值12	100mM NaCl的	50mM磷酸盐
pH值13	100mM NaCl的	50mM磷酸盐
胞浆标准曲线
使用先前作出的0.15M股票的缓冲溶液
弥补了0.15M的KCl溶液
15mL的最终体积:5mL的期望的缓冲液+ 10毫升0.15M的KCl溶液的0.15M的
在乙醇尼日利亚菌素的10mM储备，添加15μL到每个终体积溶液
pH值3	100mM的氯化钾	50mM的甘氨酸	10μM尼日利亚
pH值4	100mM的氯化钾	50mM乙	10μM尼日利亚
pH值5	100mM的氯化钾	50mM乙	10μM尼日利亚
pH为6	100mM的氯化钾	50mM乙	10μM尼日利亚
pH值7	100mM的氯化钾	的50mM Tris	10μM尼日利亚
pH值8	100mM的氯化钾	的50mM Tris	10μM尼日利亚
pH值9	100mM的氯化钾	的50mM Tris	10μM尼日利亚
pH值10	100mM的氯化钾	50mM的甘氨酸	10μM尼日利亚
pH值11	100mM的氯化钾	50mM磷酸盐	10μM尼日利亚
pH值12	100mM的氯化钾	50mM磷酸盐	10μM尼日利亚
pH值13	100mM的氯化钾	50mM磷酸盐	10μM尼日利亚
pH值与任一盐酸或氢氧化钠所有校准溶液

表1:缓冲剂的组成。此表描述在协议中使用的不同的缓冲液的适当的组合物。

补充代码文件。该文件包含了许多宏，通过阿普·莱温写的，这是必要的图像分析。作者会很乐意尝试解决使用此代码相关的任何疑问。 请点击这里下载此文件。

讨论

一旦适当的试剂，显微镜设置和校准实验设置，这种方法是相对简单的执行。的关键步骤包括:与S-1标记的念珠菌 ，以确保不存在染料的超载，校准和分析图像。

S-1是适合于碱性pH环境的试剂，它是嗜中性粒细胞²¹特别重要，但限制在某些细胞类型及其用途。有关详细的酸性环境，如巨噬细胞吞噬体，SNARF-4，或S-4，是更合适的，因为其下的pKa ^22。此外，对于更精确的读数细胞质，最好是使用S-4，作为用于S-1的标准曲线示出了荧光比开始低于pH 6高原（ 图3）。其他染料，如2' ，7'-二（2-羧乙基）-5-（和-6） - 羧基荧光素（BCECF）或红色的pHrodo也可能更适合在CONT分机，预计将是酸性的。然而，胞浆染色仍是必要的正确识别含念珠菌的吞噬的。

一个吞噬体pH指示剂的一个重要特征是，它是不可逆的通过反应性吞噬体环境改变。 S-1似乎是中性粒细胞性环境。这是通过Levine 等人示出。 ^5（参见参考文献⁵补充视频4），其表明由Hvcn1吞噬和S-1标记的念珠菌粒子的随后的释放^{- / -}嗜中性粒细胞。当吞噬，颗粒从黄色/橙色到红色（中性至碱性pH下）转动时，但是当粒子通过嗜中性粒细胞释放，它返回到原来的颜色。

重要的是要提一些使用S-1相关的限制是非常重要的。这染料具有两个发射光谱允许比率MEAS的事实urement是一个优势，但需要专门的设备来获取图像;用于实验的显微镜必须能够记录同时或与非显着的时间延迟的两个图像。作者假设，研究人员在尝试此协议利用共聚焦显微镜有经验，或访问训练有素的专业人员。我们无法列出所有的特定显微镜参数，因为它们会为每个显微镜不同，需要由研究人员进行优化。缀合到S-1的乙酰氧基甲基酯，其允许染料扩散进入细胞的细胞质是通过在细胞的细胞质中的非特异性酯酶降解以形成荧光分子。酯酶，如碱性磷酸酶，存在人血清和胎牛血清，其用于补充细胞培养基英寸因此，在其中所述细胞加载S-1-AM（第4.5节）所述介质必须不含有血清。如果使用需要更多的营养RIC细胞，这可能具有挑战性H培养基，以维持它们比贯穿本协议中使用的平衡盐溶液。类似地，其他荧光培养基组分，如酚红，可与S-1的测量干扰。

图3中的误差棒表明，有在各pH的比率测量的一些变化。合适数目的每个实验的重复（至少n = 3）并且在每个单次实验中作为许多单个的测量需要克服间液泡的变化。因此建议测量至少100个吞噬体对于每种条件并显示到仅包含一个念珠菌尽可能多的吞噬体区域的pH。用于定量应该是那些已完全吞噬念珠菌粒子（ 即，那些完全被细胞质包围）将待测量的吞噬体。为了减轻防止意外偏差在用于定量细胞/吞噬体的选择，所有的分析应而进行盲目的实验条件。

在这里，我们的全血接着等离子体层的离心分离通过密度梯度葡聚糖沉降描述嗜中性粒细胞的分离。我们使用这个技术，因为它快速和有效地产生嗜中性粒细胞的纯（> 95％）的人口，虽然也有可用的其它方法，例如通过其他密度梯度公式或使用专门的试剂盒与抗体或磁中性粒细胞的阴性选择全血离心珠。然而，后者可以是谁经常嗜中性粒细胞中分离大多数组昂贵。另外，我们使用抗凝血剂肝素的血液收集管，而其它研究人员可能更习惯于使用乙二胺四乙酸（EDTA）或酸式柠檬酸盐钠（ACD）。由于有许多不同的方法可供选择，它是由研究者的个人喜好。

此外，分离和操纵嗜中性粒细胞时它们应与一些小心处理以避免过度活化。预防措施包括:使用只塑料器皿，没有玻璃;过滤灭菌的所有缓冲区，以除去任何污染的内毒素;当纺纱嗜中性粒细胞确保离心机是很好的平衡，避免过度振动;限制尽可能时间中性粒细胞保留在离心后的颗粒;不保持在超过5×10 ^6个 / mL的溶液的嗜中性粒细胞;和隔离后尽快进行实验。

可以适于该方法通过使用显微镜加热的阶段设定为37℃和从相同位置拍摄快照每隔30-60秒至测量随时间的pH和吞噬体面积的变化，作为用于校准的步骤进行说明。它也可以在理论上适合于高通量的实验，例如在96孔板中，并进行流式细胞术实验，其中S-1可以被用作pH指示剂^23。然而，在这些设置，强调个人的细胞活性是通过在细胞群更具全球性的影响所取代。

这种方法旨在提供一个比较简单的实验装置在个别研究人员可以适应，以满足他们感兴趣的领域。研究人员可能希望探索嗜中性粒细胞吞噬体的pH值和面积，同时还测量其它离子的移动，例如，细胞内钙浓度。有几种荧光^钙指标容易地用于共焦显微镜，如印1，其还具有在400和475nm处²⁴双发射光谱。这些发射波长不与S-1的发射光谱重叠，但激发波长是在光谱，其可以破坏细胞的紫外线（UV）端，和一个紫外激光是不是在所有显微镜普遍。不同指标的全面审查测量细胞内钙通量由高桥等人所覆盖。 ²⁵和希尔森等。 ^26。

总之，存在可使用不同的荧光染料如生菜等来测量pH为吞噬体的其它方法。已经证明¹³以及其它基团^27,28。其他研究人员也使用S-1来测量pH为胞质²⁹或吞噬体的pH ^14。然而，该协议是在同时测量两个胞质溶胶和吞噬体的pH值，这提供了机会来观察吞噬体的横截面面积的变化和野生型和Hvcn1区分独特^{- / -}小鼠嗜中性粒细胞，和具有和不具有人嗜中性白细胞工作NADPH氧化酶。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU	Sigma-Aldrich	RQC14003-10EA	Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth	Sigma-Aldrich	Y1375	Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000	MP Biomedicals	2101514	Use gloves
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL	Fannin, Wockhardt UK Ltd	FP1077	We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging	Thermo Scientific/Invitrogen	SS22801	Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	Thermo Scientific/Invitrogen	C1272	Use gloves
Vivaglobin human IgG  160 mg/mL solution	CSL Behring	received as a gift	Various providers exist
Normal mouse serum	Abcam	ab7486	Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium)	Alere Ltd	1114547	Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Various providers exist
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	Various providers exist
Absolute Ethanol	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Various providers exist
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086	Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine	Sigma	P4707	Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)	Carl Zeiss		The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat	Thistle Scientific	IB-80826	Other appropriate imaging dishes can be substituted
Soniprep 150	MSE		Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter	BioRad		Various providers exist
1.5 mL Protein LoBind Tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA	Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs