호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

요약

이 논문은 phagosomal의 pH 및 영역뿐만 아니라 비율 적 지표 seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, 또는 S-1을 사용하여 인간 및 마우스 호중구의 세포 내 pH를 측정하는 간단한 방법을 설명한다. 이 라이브 셀 공 초점 형광 현미경 및 이미지 분석을 사용하여 얻을 수있다.

초록

호중구는 타고난 방어를 개최하는 것이 중요하며, 결과적으로 의학 연구의 중요한 영역을 구성한다. phagosome, 침몰 입자의 살인과 소화가 일어나는 세포 내 구획은 꽉 규제가 필요 호중구 병원균을 죽이는위한 주요 경기장입니다. Phagosomal pH는 조심스럽게 항균 단백질 분해 효소의 활동을 조절 차례로, 제어 한 측면이다. 많은 형광의 pH에 ​​민감한 염료는 phagosomal 환경을 시각화하는 데 사용되었다. S-1은 듀얼 발광 스펙트럼 사진 표백에 대한 저항성, 및 높은 pKa를 포함한 다른 pH 민감성 염료에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 이 방법을 사용하여, 우리는 호중구 phagosome 다른 식세포에 비해 비정상적으로 알칼리성 것을 증명하고있다. phagosome의 크기와 형상의 변화가 평가 될 수 있도록 염료의 다른 생화학 활용형을 사용함으로써, phagosome은 세포질에서 묘사 될 수있다. 이것은 F를 할 수 있습니다이온의 이동 또는 추가 모니터링.

서문

호중구은 신체에서 가장 풍부한 타고난 면역 세포이다. 그 주요 기능은 혈류 순찰 덮어하고 식세포 ^{(1, 2)로} 알려진 과정에서 발생할 수있는 이물질 소화 구성된다. 입자는 phagosome 불리는 세포 내 구획에서 분해된다. 호중구 NADPH 옥시 다제의 이성체 Nox2를, 상기 활성은 병원체의 죽음 절정 생화학 반응 캐스케이드를 개시한다. Nox2를 단백질 소단위는 phagosomal 막 ^(3)의 전자 전달계 복합체 형성을 진행. 일단은 슈퍼 옥사이드 음이온 및 상기 활성 산소 종 생산의 phagosome 내부에 산소 분자를 막을 통해 NADPH에서 전자를 수송 활성화. 이 작업은 호흡 버스트로 알려져 있으며,이를 효율적으로 미생물을 죽이는 소화 ² 필수적인 것으로 생각된다 . 이 양전하로의 이동 및 / 또는 음의 전하가 phagosome 밖으로 이동 보상을하지 않은 경우에는, 막에 걸쳐 네가티브 전하의 이동이 배타적 곧 Nox2를 불 활성화한다. 이곳은 호중구에 전하 보상의 대부분 양성자 HVCN1 채널 ^{(4, 5)에} 의해 수행되는 것이 확립되었다. 이 채널은 phagosome로 세포질에서 그들의 전기 화학적 구배 아래 양자의 수동 이동을 허용한다. 프로톤 농도는 pH가 반사되므로, 옥시 다제 활성의 소정 레벨의 phagosome에서 pH를 측정하면 전하 보상에 프로톤 비 프로톤 경로의 상대적 참가에 관한 정보를 제공 할 수있다.

인간의 호중구는 식균 ⁵ phagosome 후 약 20-30 분 동안 8.5의 pH를 알칼리 갖는다. 이 NOX의 추가 비 양성자 이온 채널의 존재를 의미한다관찰 된 것과 달리, 산성 환경을 유지하는 것 인 융합 HVCN1하여 산성 과립 단독 보상의 내용을 떼면, 전하 보상 2 유도. 이온의 이동은 또한 삼투 통해 phagosome 크기 변화를 가할 수도 음전하를 보상한다. 생리 높은 농도로 존재 이러한 호중구 수있다 이온 : 칼륨 이온이 phagosome ^6으로 이동 도시되어 있고, 염화물 이온 이동은 호중구 함수 ⁷ 다른 중요한 후보자이다.

phagosome에서의 pH의 조절은 항균 단백질 분해 효소 활동 ^5에 매우 중요합니다. 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO)은 카 텝신 G 및 엘라 스타 제에 대해, 최적의 수준이 ^5는 각각 pH를 7-9 및 8-10의 pH 반면, pH가 6에서 최적 활성을 갖는 것으로 보인다. 따라서, phagosomal의 pH의 일시적인 변화는 재미에 다른 효소 활동의 틈새 시장을 제공 할 수있다ction. pH를 호중구 미생물을 죽이는에 참여하는 방법을 이해하는 것은 새로운 호중구 보강 미생물 에이전트의 디자인에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.

호중구 phagosome는 반응성이 매우 높은 환경입니다. 염료가 쉽게 산화 될 수 있기 때문 기술적 인공물로 이어지는, 정확하게 pH를 평가하기가 어렵습니다. 역사적으로, 형광 염료 (FITC)가 세포 내 pH를 ^{8, 9를} 측정하기 원하는 염색되었다. 단, 호중구 phagosomal 산도 측정에서의 사용에 대한 몇 가지 단점이있다. 그것은 산도 <8 ¹¹ 포화으로 만 정확하게 7.5 5 내지 ^8의 pH 레벨을 평가하기 위해 이용 될 수 있다는 것을 의미 6.4 ^10의 pKa를 갖는다. 호중구 phagosomal의 pH가 훨씬 더 알칼리성 ^5가 될 수 있듯이, FITC는 잠재적 인 pH 변화의 전체 범위를 캡처 할 수 없습니다. 또 signifi호중구의 맥락에서 FITC와 질수 문제는이 MPO ^(12)에 의해 광 퇴색 될 것으로 생각된다는 것이다. MPO 형 억제제, 아 지드 화 나트륨은 ¹³ photobleaching에 제한 할 수 있지만, 아 지드 화 나트륨이 직접 MPO 독립적 인 방식으로 phagosomal 산도를 저하 등 세이 ^5에 사용하기에 따라서 부적절한 것으로 밝혀졌다.

다른 세포 성 염료에 비해 S-1 7.5 ^(10)의 비교적 높은 pKa가있다. 산성 조건에서, 분자는 양성자이고, 488 nm의 여기 이상일 때, 560 및 600 nm의 사이에 발광 신호를 생성한다. 분자는 알칼리성 조건에 탈 때, 발광 파장이 600 nm를 초과한다. 이 형광 물질의 농도 및 셀 구조에 의해 영향을받지 않는 이러한 2 개 개의 파장에서의 형광 강도의 비는,보다 단일 형광 측정보다 신뢰성있는 발광 시프트를 나타낸다. 열이 사망 (HK) 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)가 바람직하지만, 더 큰 표면적보다 일관된 형광 판독을주기 때문에 S-1, 예컨대 ¹⁴ 모산, 항원 성 물질에 접합 될 수있다.

우리는 또한 (그림 3) ⁵ pH의 시간적 변화를 연구하기 위해이 방법의 수정을 사용했다. 알칼리성 phagosomes ¹⁴ 곳 ^{(15) (16),} 및 세포 세포질 바와 같이 pH를 측정하는이 방법은 용이하게 다른 세포 유형에 적용될 수있다.

프로토콜

윤리 문 : 모든 동물의 작업은 라이센스 및 영국 홈 오피스의 승인을 실시했다. 이 연구에서 인간의 참여는 인간 연구의 윤리에 공동 UCL / UCLH위원회에 의해 승인되었다. 모든 참가자는 동의를 제공했다.

C. 알비 칸스의 제조 1

1. 제조업체의 지침에 따라 같은 YPD 한천 플레이트에 칸디다 디스크 (재료 목록 참조) 성장. 콜로니를 골라 YPD 배지 15 ㎖의에 추가. 발효액은 흐린 (일반적으로 약 2 일, 또는 약 / ㎖ ⁹ 1 × 이상의 농도로)이 될 때까지 30 ° C, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 부화.
2. 칸디다 매체를 스핀 다운하고 인산 완충 용액 (PBS) 50 ㎖에 재현 탁을. 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 두 번이 단계를 반복합니다.
3. 전체의 튜브가되도록 60 ℃로 예열 된 수조에 PBS / 칸디다 배지 50 ㎖를 함유하는 튜브를 배치1 시간 동안 ubmerged.
   1. 칸디다는 YPD 한천 플레이트에 열 사망, 행진 샘플이며, 30 ° C에서 하룻밤 배양 있는지 확인합니다. 5-9 열 살해 (HK) 칸디다 농도를 조정 × ¹⁰⁸ / ㎖, 칸디다 성장에 따라 C와 냉동고 -20 °에서 1 mL의 분취 액에 저장.
      참고 :이 프로토콜의 모든 세포 수는 자동 세포 계수기를 사용하여 수행되었다.

2. S-1 커플 링은 (HK) 칸디다 죽인 열

1. 고급 디메틸 술폭 시드 100 μL (DMSO)로 희석하여 카르복시 S-1 숙신 이미 딜 에스터 (50 μg의)의 분취 량을 준비한다. 소용돌이 잘 혼합한다.
2. 15 ㎖의 튜브에 0.1 M 중탄산 나트륨 (PH 8.3)에 1 × ¹⁰⁸ HK 칸디다 1 ㎖를 준비한다.
3. 100 μL 카르복시 S-1 대략 소용돌이에 2,000 RPM (고속 중간)을 혼합하면서 HK 칸디다에 한 번에 한 방울을 추가한다. 알루미늄 FOI 랩상기 튜브의 주위 (L)와 실온에서 1 시간 동안 롤러에 배치.
4. 10 분마다 2,250 XG에서 원심 HK Candida- S-1 (HKC-S-1)를 세 번 세척 하였다. 처음 두 세척 들어, 0.1 M 중탄산 나트륨 (PH 8.3)의 15 mL 중 펠렛을 재현 탁. 세 번째 세척 후에 평형 염액 완충액 1 ㎖에 재현 탁하여 (표 1 참조).
5. 100 μL 씩의 튜브로 HKC-S-1 현탁액을 옮기고 -20 ℃에서 보관.
   주 : 가능하면 낮은 표면으로서, 소재 구속력과 이용 튜브 HKC-S-1 입자는 통상 원심 관의 벽에 붙어있다.
6. Opsonize HKC-S-1
   1. 인간 호중구를 들어, 해동의 100 μL HKC-S-1에 인간 IgG 혈청의 100 μL를 추가합니다.
   2. 마우스 호중구 정상 마우스 혈청 50 μL를 추가 칸디다 마우스 면역 혈청의 50 μL를 ⁵ μL 100 (HK 칸디다 주입 C57B6 생쥐에서 생성)의 HKC-S-1.
   3. 37 ℃에서 가열을 진탕 혼합하고 60 내지 90 분 동안 1,100 rpm으로 한 후 2 시간 동안 39 ° C에서의 롤러.
   4. 1 분마다 17,200 XG에서 원심 분리하여 BSS 버퍼에 세 번 세척 하였다. BSS 완충액 100 μL에 재현 탁.

호중구 3. 분리

1. 인간 말초 혈액 호중구, 건강한 기증자로부터 정맥 천자하여 혈액 15 mL를 취하여 1000 IU / ㎖ 헤파린 나트륨 용액 (헤파린 60 μL 혈액 / 10 mL)을 90 μL를 함유하는 20 mL의 주사기에 배치.
2. 피펫 팁을 사용하여 주사기에 10 % 덱스 트란 용액 1.5㎖를 주입. 부드럽게 3 번을 반전하고 벤치에 똑바로 서 둡니다.
3. 혈액은 담황색 적혈구를 함유하는 하부층 인 상부 버피 코트 층을 반으로 대략 분할 될 때까지 30 ~ 60 분을 기다린다.
4. 조심스럽게 바늘을 통해 상층을 밀어 또는 피펫 팁으로 제거. 내가 넣어NA 15ml의 튜브. 빨간색 계층을 복용하지 마십시오. 5 mL를 피펫을 사용하여 밀도 구배 매질 3-4 mL를 넣어 두 개의 별개의 층을 수득하는 버피 코트 층 아래에서 튜브의 바닥 (자재 목록 참조). 10 분 동안 913 XG 원심 분리기.
   참고 : 사용하여 마우스 호중구 (마우스 호중구 격리를 위해 ¹⁷ 참조 참조) 경우, 대신 골수에서 플러시 된 세포 현탁액을 사용합니다.
5. 빨간 펠렛 남겨두고, 뜨는을 붓고. 부드럽게 소용돌이는 펠렛을 방해합니다. 펠렛에 증류수, 멸균 H ₂ O 7의 용액을 첨가하고, 펠렛을 재현 탁 20 초 동안 반전. 배 식염수의 7 mL를 넣고 나머지 적혈구 용혈, 혼합 몇 번 반전.
6. 5 분 동안 300 XG 원심 분리기. 상등액을 붓고 약 4 × ¹⁰⁶ / ㎖로 BSS 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
   세포의 최적 현미경 1.5-6 × 106 ⁽⁶⁾ 사이의 세포 현탁액 농도를 계속 참고 / ㎖.

프레젠테이션 제 담

1. 8 웰 플레이트 현미경을 사전 처리하고 실온에서 40-60 분 동안 각 웰의 폴리 -L- 라이신 200 μL (0.01 % 용액)과 (자재 목록 참조).
2. 폴리 -L- 리신을 분리 (재사용 될 수있다) 및 증류수 H ₂ O. 200 μL로 두 번 웰을 씻어
3. 각 웰에 3.6 단계에서 제조 된 세포 현탁액을 200 μL를 추가한다. 30-60 분 동안 실온에서 인큐베이션.
4. 하나 개의 튜브에 고급 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 -5- (및 -6) 카르복시 -1- 아세 S (S-1-AM) 에스테르 (50 μg의)의 분취 량을 준비한다. 소용돌이 믹스합니다. 사용하지 않을 때는, -20 ° C에서 보관.
5. 작은 튜브, 1.7 mL의 BSS 완충액 추가 S-1-AM 20 μL. 소용돌이 믹스합니다.
6. BSS 완충액 200 μL로 두 번 웰을 세척 한 다음, S-1-AM 용액으로 버퍼를 교체한다. 부드럽게 피펫 팅하여 잘 바닥에 부착 세포의 단층을 방해하지 않도록주의하십시오웰의 벽 아래. 적어도 25 분 동안 실온에서 인큐베이션.
7. BSS 완충액 200 μL로 두 번 웰을 세척한다. 억제제를 테스트하려면, BSS 버퍼에서 적절한 약물의 "마스터 믹스"를 구성합니다. 억제제 용액으로 두 번 웰을 세척한다.
   참고 : 컨트롤에 약물 비히클 (예를 들어, DMSO 또는 에탄올)의 같은 양을 사용하는 것이 아니라 억제제를 사용 하였다해야합니다. 염화 아연의 효과를 시험하는 경우가 인산 아연 침전물로,합니다 (HEPES 단독 용액을 버퍼링 할 수) KH ₂ PO _{4 결여} BSS 버퍼를 사용한다.
8. 5 ㎛의 진폭을 약 3 초 동안 옵 소닌 HKC-S-1 (6.2)을 초음파 처리. 각 웰에 10 μL를 추가합니다. 탐식 스냅 묘화 될 셀을 준비하게 탐식 있도록 15-20 분 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.

5. 공 초점 현미경

1. 공 초점 현미경을 사용하여, 일 때문에 레이저 파장을 조절세포에서 555 nm에서 흥분하고 방출은 두개의 채널, 또는 검출기에 의해 검출된다 : 560-600 nm 내지 600 nm를 초과.
   참고 : 특정 현미경 매개 변수는 각 현미경 다를 필요는 연구자에 의해 최적화한다.
2. 오일과 63X 렌즈를 사용하여 세포를 볼 수 있습니다. 중앙 타일을 볼 수 연속 설정에 타일 스캔 이미지를 사용합니다. 초점 레이저의 강도 및 두 채널의 이득을 형광 강도 검출기 채널의 이득을 조정 사용하여 이미지를 최적화한다.
3. 두 채널을 볼 수있는 설정을 사용하여 이미지를 분할; 세포질이나 액포 형광 강도에는 채도가없는 것을 확인한다. 채도는 빨간 점으로 표시됩니다. 이 빨간색 점의 최소 숫자가 있지만, 세포와 phagosomes가 명확하게 볼 수있을만큼 밝은이되도록 레이저 강도를 줄입니다.
4. 만족하는 경우, 클릭 "실험을 시작합니다." 9- 타일 스캔 화상이 생성된다. 복잡한 파일을 권장하는 이미지를 저장두 채널 (JPEG 또는 TIFF 생략)의 합성 화상을 포함하는 소프트웨어.

6. 교정 실험

1. 혼자 칸디다와 산도 표준 곡선을 구축합니다.
   1. 표 1에 따라, 13.0의 pH 3.0의 완충액을 준비한다.
   2. HKC-S-1의 한 부분 표본 (100 μL)를 타고. 17,200 × g으로 1 분간 스핀 내려. 상기 할당 된 버퍼 500 μL에 재현 탁을.
   3. 낮은 pH 범위로부터 출발 한 상기 현탁액을 추가한다 (단계 4.2) 또한 전처리. 37 ℃로 설정된 가열 스테이지 상에 공 초점 현미경 슬라이드를 놓는다.
   4. 10 분 동안 형광마다 분을 기록합니다. 각 버퍼에 대해 반복합니다.
2. 사포닌 표준 곡선.
   1. 1 × ¹⁰⁷ 인간 호중구 ^(5)를 분리하고, 낮은 pH 완충 1 ㎖에이를 재현 탁.
   2. (P)을 측정 부 (4)에 기재된 방법에 따라호중구의 hagosomal 산도.
   3. 20 분 동안 칸디다 현탁 배양 후, 0.3 % 사포닌 부가 (10 % 스톡 15 μL를 한 전처리 () 단계 4.2도)를 접시 후 37 ° C에서 20 분 동안 배양한다. 10 분 동안 이미지를 매 순간을 가져 가라. 각 버퍼에 대해 반복합니다.
3. 기술은 ^{5, 18, 19 +} / nigericin 높은 K를 이용하여 세포 내 pH를 표준 곡선.
   1. 13.0 pH가 4.0, 표 1에 설명 된 버퍼를 확인합니다.
   2. 사전 처리 된 우물 만 호중구를 떠나, 단계 4.1-4.7에 따라 - 각 웰 다른 버퍼를 포함 할 수 있습니다. 37 ° C로 가열 단계로 슬라이드를 추가하고 10 분 동안 형광 분마다 기록한다.
   3. 세포질의 pH가 외부 용액으로 안정화하는 것은 약간의 시간이 걸릴 수 있지만,이 시점 이후에 상기 S-1의 비율 값이된다 참고일정한. 각 실험에서 세포 HKC-S-1 측정은 추가 된 억제제는 S-1의 형광 방출을 방해하거나, 버퍼의 pH가 영향을 미치지 않는 것을 확인하는 제어부로서 기능 할 수있다.

7. 이미지 분석

참고 : 여기에, 이미지 분석 (형광의 정량) 자유 소프트웨어 ImageJ에 사용에 대한 지침이 제공된다. ImageJ에 사용하는 것이 좋습니다.

1. 다운로드 및 개발자의 지시에 따라 1.46r> ImageJ에 버전을 설치 (https://imagej.nih.gov/ij/). 라는이 프로토콜에 부착 된 보조 코드 파일 설치 "Phagosomal 측정을."
2. 이미지 열기 J 도구 모음에 분석을 위해 선택한 이미지 파일을로드합니다. 두 채널을 결합하려면, 이미지> 색상> 복합을 확인하십시오.
3. 결과를 저장할 파일을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.
4. 도구 모음에서 선 도구를 클릭하고 #을 &하는 폭을 높이기 위해 더블 클릭(34) 2 '.
5. phagosome의 폭을 가로 지르는 선을 그린 다음 "측정 pH를"을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 두 채널의 평균 휘도를 취득하고, 그 비율은 ImageJ에있는 코드 파일에 의해 자동으로 계산된다.
6. 측정을 마친 후, 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 "파일을 저장합니다."
7. phagosome 영역을 측정하기 위해, 지역의 주위에 자유의 손을 그리기 위해 도구 막대를 따라 네 번째 아이콘을 사용합니다. 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 "측정 영역을."
   참고 : 결과가 저장되고 로그 파일이 선택한 디렉토리에 생성됩니다. 결과는 스프레드 시트, R 또는 등가 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다. 산도에 형광 비의 관계는 대략 S 자형이고, 상기 분석 ImageJ에 의해 생성 된 비의 값은 일반적인 로지스틱 또는 시그 모이 드 함수 또는 선형 또는 큐빅 스플라인 보간을 사용하여 pH로 전환시킬 수있다.
8. 세포질에서 선을 그립니다, 세포질을 측정하려면 및에 "측정의 pH를 마우스 오른쪽 단추로 클릭".

결과

그림 1은 다양한 phagosomal 환경을 보여 다른 기원에서 호중구의 스냅 샷을 제공합니다. 정량 분석을 용이하게하기 위해, 세포의 적절한 수의 우물을 시드하는 것이 중요하다 : 너무 많은 정확하게 동봉 phagosomes을 볼 어렵게 만드는 세포가 서로를 통해 레이어하게됩니다; 너무 적은 의지 물론, 모든 호중구 탐식하지 않습니다 특히로서, 적은 결과를 제공합니다. 도 2는 과도한 포화 인 이미지이다; 최대 형광이 검출 된 위치를 표시 레드 도트 - 이는 그 두 채널 간의 영상 분할 (재료 목록 또는 동등한 추천 현미경 소프트웨어를 사용하여)에 의해 평가 될 수있다. 이것은 레이저의 강도를 감소시킴으로써 상쇄 될 수있다. 다양한 버퍼 시스템을 사용하여 교정 곡선 레빈 등 각색도 3에 나타낸다. ^{5 <}/ SUP>. 오류 바는 측정 값 사이 형광에 약간의 변화가 있음을 보여줍니다. 도 4는 phagosomal의 pH 및 영역에 대한 데이터가 제공 될 수 있는지의 예를 제공한다. 이 방법은 각각의 측정이 과도하게 누워 상자 그림으로 표시 할 수 있습니다. 그러나, 데이터는 히스토그램 막대 그래프로 표시 될 수있다.

그림 1 : 인간과 생쥐에서 호중구의 적절한 스냅 샷 이미지. 맨 오른쪽 산도에 대응하는 S-1 염색 phagosomes 대략 컬러 질적 비주얼 계이다. 빨간색이 더 알칼리성을 나타내는 반면, 노란색은 더 산도를 나타냅니다. ^{- / -} (A) Hvcn1 도시 마우스 골수 호중구를 식균 후 20 분. phagosomes은 매우 빨강, 알칼리, 부어 나타납니다. 의 오른쪽 아래 부분에 빨간색 화살표세포 내 칸디다 이미지 포인트 세포 외 입자의 좌측 상단 점에서 화살표있다. (B)는 칸디다 균을 섭취 한 야생형 마우스의 골수 호중구를 보여줍니다; ^{- / -} 세포들은 Hvcn1보다 훨씬 적은 알칼리성이다. (C)을 식균 한 후 동일한 시점에서 인간 말초 혈액 호중구를 나타낸다. 그들은 마우스 야생형 세포보다 약간 알칼리성을 표시하지만 phagosomes은 여전히 Hcvn1만큼 크고 붉은 아니다 ^{- / -} 세포. (D)는 5 μM의 디 페닐 요오도 늄 (DPI)의 존재 칸디다를 포식 한 인간 호중구를 나타낸다. 모든 phagosomes 6 미만의 pH로 매우 산성; 약물은 NADPH 옥시 다제 억제, 그래서 보상 이온의 이동은 없다. phagosome에 융합 산성 과립으로부터 방출 프로톤 1~ V-ATPase에의 산성 pH ²⁰ 채용 증가를 야기DPI ⁹ 처리시 전자 phagosomal 막. 세포질은 또한 다른 조건에서 세포에 비해 알칼리성을 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 오버 포화 Hvcn1의 ^{- / -} 마우스 골수 호중구. 이 형광 데이터가 오버 포화되는 분석 이미지에서 제외하는 것이 중요하다. 5.3 절에 설명 된 바와 같이, 합성 화상을 개별적으로 제시된 두 채널과 두 개의 이미지 (맨 좌측 적색 화살표)로 분할된다. 이 소프트웨어에서, 다양한 지시자는 (바닥 적색 화살표 왼쪽)에 체크하고 과도한 포화 모든 픽셀은 밝은 빨강이다. 과도한 포화 두 채널 모두에 존재하는 (1, 2)가있다. 그니일부 셀의 가스화 및 칸디다 세포는 화살표 피해 지역 가리키는 오른쪽 하단에 표시된다. 이러한 점을 분석하는 것은 잘못된 비율 계량 측정으로 이어질 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3 : pH 측정에 S-1 형광 비율의 전환에 대한 표준 검량선. 균체 사포닌 ( "사포닌 ')으로 투과성이있다 때 ("트리스 "로 표시됨)만을 다른 버퍼 칸디다에 대한 표준 곡선은 S-1 세포 (phagosome 및 세포 내외 읽고 보여주는 매우 유사 매체)를 비교한다. 오류 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. I 테스트 때 S-1의 비율 / 산도 곡선 짧게N 화상 분석에 고려되어야 세포질 ( "세포질"). 이 수치는 레빈 외에서 개질되었다. ^5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : phagosomal의 pH와 지역의 정량화. 이 그림은 데이터 프리젠 테이션의 예를 제시한다. phagosomal 비 대응의 pH A에 대한 표시 ^{(- / -} Hvcn1 마우스 골수 호중구), B : 그래프는 프로그래밍 소프트웨어 R. A를 이용하여 생성 된 야생형 마우스 골수 호중구, C : 인간 말초 혈액 호중구 및 D를 인간을 5 μM DPI N = 300분의 3과 호중구. 개별 측정은 메디와 상자 그림 오버레이로, 작은 사각형으로 표시됩니다를 사용하며 분위 범위. 빨간색 막대는 평균을 나타냅니다. 그림 1의 이미지에서 볼 수 있듯이, Hvcn1는 ^{- / -} 세포는 야생형 마우스와 인간 호중구에 비해 매우 알칼리성 phagosomes 있습니다. 또한 큰 phagosomal 영역 (도 4b, N = 3백분의 3)를 갖는다. DPI 배양 인간 호중구 매우 작은 산성 phagosomes있는 동안 인간 호중구 phagosomes은 야생형 마우스 호중구보다 약간 더 알칼리성 크다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

평형 염액 버퍼
염화나트륨	156 mM의
KCl을	3 밀리미터
황산	2 mM의
KH 2 PO 4	1.25 밀리미터
염화칼슘 2	2 mM의
포도당	10 mM의
헤 페스	10 mM의
의 NaOH 또는 HCl로 pH를 7.4
YPD 배지
YPD 배지	50 그램
증류수	1 L
15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브
YPD 한천의 경우 : 고압 증기 멸균이 15g을 추가하기 전에 / L 한천
10 % 덱스 트란 용액
덱스 트란 임상 등급		50 그램
염화나트륨		4.5 g
증류수		500 ㎖
15 분 동안 121 ℃에서 유리 병을 오토 클레이브에 추가
배 식염수
염화나트륨		18g
증류수		1 L
15 분 동안 121 ℃에서 유리 병을 오토 클레이브에 추가
10 % 사포닌의 재고
BSS 버퍼		50 ㎖
사포닌		5g
37 ° C에 열 BSS 버퍼는, 사포닌을 추가하고 섞는다.
4 ℃에서 방부제 0.1 % 아 지드 화 나트륨, 저장 혼합물을 추가한다.
교정 버퍼
칸디다 표준 곡선
먼저 각 버퍼의 0.15 M 주식을 만들
0.15 M NaCl 용액 메이크업
15 ㎖의 최종 부피 : 5 ㎖ + 10 ㎖, 0.15 M NaCl 용액 원하는 완충액, 0.15 M
pH를 3	100 mM의 NaCl을	50 mM의 글리신
pH를 4	100 mM의 NaCl을	50 mM의 아세트산
pH를 5	100 mM의 NaCl을	50 mM의 아세트산
pH가 6	100 mM의 NaCl을	50 mM의 아세트산
pH가 7	100 mM의 NaCl을	50mM 트리스
pH가 8	100 mM의 NaCl을	50mM 트리스
pH가 9	100 mM의 NaCl을	50mM 트리스
pH를 10	100 mM의 NaCl을	50 mM의 글리신
pH를 11	100 mM의 NaCl을	50mM의 인산
pH를 12	100 mM의 NaCl을	50mM의 인산
pH가 (13)	100 mM의 NaCl을	50mM의 인산
세포질 표준 곡선
이전에 0.15 M 재고 버퍼 솔루션을 만들어 사용하십시오
0.15 M의 KCl 솔루션 메이크업
15 ㎖의 최종 부피 : 5 ㎖ 원하는 버퍼 + 10 mL의 0.15 M KCl을 용액 0.15 M
에탄올 nigericin의 10 mM의 주식은, 각각의 최종 볼륨 솔루션을 15 μL를 추가
pH를 3	100 mM의 KCl을	50 mM의 글리신	10 μM의 nigericin
pH를 4	100 mM의 KCl을	50 mM의 아세트산	10 μM의 nigericin
pH를 5	100 mM의 KCl을	50 mM의 아세트산	10 μM의 nigericin
pH가 6	100 mM의 KCl을	50 mM의 아세트산	10 μM의 nigericin
pH가 7	100 mM의 KCl을	50mM 트리스	10 μM의 nigericin
pH가 8	100 mM의 KCl을	50mM 트리스	10 μM의 nigericin
pH가 9	100 mM의 KCl을	50mM 트리스	10 μM의 nigericin
pH를 10	100 mM의 KCl을	50 mM의 글리신	10 μM의 nigericin
pH를 11	100 mM의 KCl을	50mM의 인산	10 μM의 nigericin
pH를 12	100 mM의 KCl을	50mM의 인산	10 μM의 nigericin
pH가 (13)	100 mM의 KCl을	50mM의 인산	10 μM의 nigericin
염산 또는 하나의 NaOH으로 pH 모든 보정 용액

표 1 : 버퍼의 조성. 이 테이블은이 프로토콜에서 사용되는 다른 적절한 버퍼 조성물을 설명한다.

보충 코드 파일. 이 파일은 이미지 분석에 필요한 앱 레빈에 의해 작성된 매크로의 수를 포함합니다. 저자는이 코드를 사용하여 관련된 모든 쿼리를 해결하기 위해 시도하실 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

적절한 시약, 현미경 설정 및 교정 실험이 설정되면,이 방법을 수행하기가 비교적 간단하다. 결정적인 단계를 포함한다 : S-1 칸디다 레이블링 보정 및 이미지 분석 염료에는 과부하가되지 않도록.

S-1 ^(21)은 호중구에서 특히 중요하지만, 특정 세포 유형에서의 사용을 제한하고 더 알칼리성의 pH 환경에 적합한 시약이다. 예컨대 대식 phagosomes, SNARF-4, S-4 같은 더 산성 환경 들어 pKa가 낮기 때문에 ^(22)의 더 적합하다. 또한,보다 정확한 판독 세포질 들어, 형광 비는 pH가 6 이하 고원 (도 3)을 시작하는 것을 보여준다 S-1을위한 표준 곡선으로, S-4를 사용하는 것이 좋다. 다른 염료 등의 2 ', 7'- 비스 - (2- 카복시 에틸) -5- (및 -6) -Carboxyfluorescein (BCECF) 또는 pHrodo 레드도 계속 더 적합 할 수있다산성 될 것으로 예상된다 내선. 그러나 세포질 염색은 여전히 칸디다 균을 포함하는 phagosomes의 정확한 식별을 위해 필요하다.

phagosomal 산도 지표의 중요한 특징은이 비가 역적 반응 phagosomal 환경에 의해 변경되지 않는 것입니다. S-1은 호중구 환경에 강한 것 같다. 이것은 레빈 동부 등에 의해 도시된다. ^{- / -} 호중구 ⁵ Hvcn1 의한 식균 작용 및 S-1 표지 칸디다 입자의 후속 버전을 보여 (문헌 ^5의 보조 비디오 4 참조). 포식 때, 입자 (알칼리 pH를 중성) 적색 황색 / 오렌지색에서 켜졌지만 입자 호중구에 의해 해제 될 때, 원래의 색으로 복귀.

이 S-1 사용과 관련된 몇 가지 제한 사항을 언급하는 것이 중요하다. 이 염료는 비율 적 신체의 체중 측정을 가능하게이 방출 스펙트럼을 가지고 있다는 사실urement은 장점이지만, 전문 장비는 이미지를 수집 할 필요가; 실험에 사용되는 현미경은 두 개의 이미지를 동시에 또는 무의미한 시간 지연을 기록 할 수 있어야합니다. 저자는이 프로토콜을 시도하는 연구자가 공 초점 현미경을 사용하여 경험을 가지고, 또는 훈련 된 전문가에 액세스 할 수 있다고 가정합니다. 그들은 각각의 현미경 다릅니다 및 연구자에 의해 최적화해야하므로 우리는 특정 현미경 매개 변수를 나열 할 수 없습니다. 염료의 세포질 내로 확산 할 수 있도록 S-1에 컨쥬 게이트 아세 톡시 메틸 에스테르 형광 분자를 형성하는 세포의 세포질에서 비 특이성 에스 테라 제에 의해 분해된다. 알칼리 포스파타제 등의 에스 테라 제는 세포 배양 배지를 보충하기 위해 사용되는 인간 혈청 및 소 태아 혈청에 존재한다. 따라서, 셀은 S-1-AM (4.5 절)와 함께로드되는 배지는 혈청을 포함해서는 안된다. 더 영양 RIC을 필요로 세포를 사용하는 경우이 도전 증명할 수 있습니다H 매체는이 프로토콜에서 사용되는 평형 염 용액보다 그것들을 유지한다. 마찬가지로, 페놀 레드 등의 다른 매체 형광 성분은, S-1의 측정을 방해 할 수있다.

도 3의 오차 막대는 각 pH에서 비 측정에 약간의 변화가 있음을 나타낸다. 각 실험의 반복 적절한 수 (적어도 N = 3)마다 하나의 실험에서 많은 개별 측정 간 액포 변동을 극복하기 위해 필요하다. 적어도 100 phagosomes 각 조건에 대해 단 하나를 포함하는 칸디다 나타만큼 phagosomal 영역의 pH를 측정하는 것이 바람직하다. phagosomes 완전히 (즉, 그것들이 완전히 세포질에 의해 둘러싸인) 칸디다 입자를 채우고있는 것들이어야 정량 측정한다. 정량 세포 / phagosomes의 선택에 의도하지 않은 편향을 완화하기 위해, 모든 분석이 동시에 수행되어야실험 조건에 장님.

여기서, 우리는 밀도 구배를 통해 플라즈마 층의 원심 분리 전혈 덱스 트란 침강 호중구의 분리를 설명한다. 신속하고 효율적으로 호중구의 순수한 (> 95 %) 인구를 생산하는 기타 밀도 구배 수식이나 항체 또는 자기와 전문 장비를 사용하여 호중구의 부정적인 선택을 통해 전혈을 원심 분리로 사용할 수있는 다른 방법이 있기는하지만 우리는이 기술을 사용 염주. 그러나, 후자는 정기적으로 중성 백혈구를 분리 대부분의 그룹에 대한 엄청나게 비용이 많이들 수 있습니다. 다른 연구자는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 또는 산, 시트르산 나트륨 (ACD)를 사용하여 더 익숙 할 수있는 반면 또, 상기 혈액 수집 튜브 내에 항응고제 헤파린을 사용한다. 선택할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다, 그것은 연구자의 개인적인 취향에 달려있다.

더욱이,호중구를 분리하고 조작 할 때 과도한 활성화를 피하기 위해 몇 가지주의하여 취급해야합니다. 예방 조치 단계는 다음과 같습니다에만 플라스틱 구조물을 사용하여, 유리; 필터링 소독 어떤 독소 오염을 제거하는 모든 버퍼; 때 회전 호중구는 원심 분리기가 과도한 진동을 피하기 위해 균형이 잘되어 있는지 확인; 시간 호중구는 원심 분리 후 펠렛에 남아 가능한 한 많이 제한; 이상 5 × ¹⁰⁶ / ㎖의 용액의 호중구를 유지하지 않는다; 및 차단 후 가능한 한 빨리 실험을 수행합니다.

교정 단계에서 기술 한 바와 같이이 방법은, 현미경에서 37 ° C로 가열 한 스테이지 세트를 사용하여 동일한 위치에서 한번 30-60의 스냅 샷을 시간이 지남에 따라 pH 및 phagosomal 면적 변화를 측정하도록 구성 될 수있다. 또한 이론적으로 이러한 96- 웰 플레이트와 같은 높은 처리량 실험을 위해 적응 될 수 있으며, 유동 세포 계측법 실험을 위해, 여기서 S-1은 수pH는 인디케이터 ^(23)로서 이용 될 수있다. 그러나 이러한 설정에서, 개별 셀 활동에 대한 강조는 세포 인구에 더 글로벌 효과로 대체됩니다.

이 방법은 개별 연구자가 자신의 관심 분야에 맞게 적응할 수에 따라 비교적 간단한 실험 장치를 제공하는 것을 목표로하고있다. 연구자들은 예컨대, 세포 내 칼슘 농도에 대한 다른 이온의 이동을 측정하는 동안 호중구 phagosomal의 pH 및 영역을 탐색 할 수도있다. 예컨대 인도 1,도 400 및 475 내지 ^24, 듀얼 발광 스펙트럼을 갖는 한 공 초점 현미경 용이하게 사용할 수있는 여러 형광 ^칼슘 지표가있다. 이러한 발광 파장은 S-1 발광 스펙트럼과 중첩되지 않지만, 여기 파장이 세포에 손상 될 수있는 스펙트럼의 자외선 (UV) 단부이며, UV 레이저 모든 현미경에 평범하지 않다. 다른 지표의 종합적인 검토측정 세포 내 칼슘 플럭스는 다카하시 등의 알에 의해 덮여있다. ²⁵ Hillson 등 알. ^(26).

결론적 눈즈 동부 등 같은 다른 형광 염료를 사용 phagosomal 산도를 측정하는 다른 가능한 방법이있다. ^(13)뿐만 아니라 다른 그룹 ^{(27), (28)을} 증명하고있다. 다른 연구자들은 세포질 산도 phagosomal ²⁹ 또는 ^{14의 pH를} 측정하는 S-1을 사용 하였다. ^{- / -} 그러나,이 프로토콜은 동시에 phagosomal 단면적의 변화를 관찰하고 야생형 및 Hvcn1 구별하는 기회를 제공 세포질 및 phagosome 모두의 pH 측정의 고유 마우스 호중구와 함께 그리고없이 인간 호중구 NADPH 산화 효소 작업.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU	Sigma-Aldrich	RQC14003-10EA	Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth	Sigma-Aldrich	Y1375	Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000	MP Biomedicals	2101514	Use gloves
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL	Fannin, Wockhardt UK Ltd	FP1077	We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging	Thermo Scientific/Invitrogen	SS22801	Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	Thermo Scientific/Invitrogen	C1272	Use gloves
Vivaglobin human IgG  160 mg/mL solution	CSL Behring	received as a gift	Various providers exist
Normal mouse serum	Abcam	ab7486	Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium)	Alere Ltd	1114547	Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Various providers exist
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	Various providers exist
Absolute Ethanol	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Various providers exist
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086	Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine	Sigma	P4707	Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)	Carl Zeiss		The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat	Thistle Scientific	IB-80826	Other appropriate imaging dishes can be substituted
Soniprep 150	MSE		Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter	BioRad		Various providers exist
1.5 mL Protein LoBind Tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA	Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs