Imagerie du neutrophile Phagosome et Cytoplasme L'utilisation d'un pH Ratiométrique Indicateur

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode simple pour mesurer le pH du phagosome et de la zone, ainsi que le pH cytoplasmique des neutrophiles humains et de souris en utilisant l'indicateur ratiométrique seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Ceci est réalisé en utilisant la microscopie à fluorescence confocale cellules vivantes et l'analyse d'image.

Résumé

Les polynucléaires neutrophiles sont cruciales pour accueillir la défense innée et, par conséquent, constituent un domaine important de la recherche médicale. Le phagosome, le compartiment intracellulaire où la mort et la digestion des particules englouties ont lieu, est l'arène principale pour tuer des agents pathogènes neutrophile qui exige une réglementation stricte. Phagosome pH est un aspect qui est soigneusement contrôlée, à son tour la régulation de l'activité de protéase antimicrobien. De nombreux colorants fluorescents sensibles au pH ont été utilisées pour visualiser l'environnement du phagosome. S-1 présente plusieurs avantages par rapport à d'autres colorants sensibles au pH, y compris ses deux spectres d'émission, sa résistance à la photo-blanchiment, et son pKa élevé. En utilisant cette méthode, nous avons démontré que le phagosome neutrophile est particulièrement alcaline par rapport à d'autres phagocytes. En utilisant différentes conjugaisons biochimiques du colorant, le phagosome peut être délimité à partir du cytoplasme de sorte que les changements dans la taille et la forme du phagosome peuvent être évalués. Cela permet à fou la surveillance supplémentaire de mouvement ionique.

Introduction

Le neutrophile est la cellule immunitaire innée plus abondant dans le corps. Sa fonction principale consiste à patrouiller dans la circulation sanguine et engloutit et de digérer les particules étrangères qu'il peut rencontrer dans un processus connu sous le nom phagocytose ^{1, 2.} Les particules sont dégradées dans un compartiment intracellulaire appelé le phagosome. L'activation de la NADPH oxydase neutrophile, la NOX2 isoforme, initie une cascade de réactions biochimiques qui aboutit à la mort de l'agent pathogène. Sous - unités protéiques de NOX2 procéder pour former un complexe de la chaîne de transport d'électrons dans la membrane du phagosome ^3. Une fois activé, il transporte des électrons de NADPH à travers la membrane à l'oxygène moléculaire dans le phagosome, produisant des anions superoxydes et d'autres espèces réactives de l'oxygène. Ceci est connu comme l'éclatement respiratoire, et il est considéré comme essentiel pour la destruction microbienne efficace et la digestion ² . Cependant, ce mouvement exclusif de charge négative à travers la membrane serait bientôt inactivent NOX2 si elle était pas compensée par une charge positive se déplaçant dans et / ou une charge négative de la déplacer phagosome. Il a été bien établi que la majeure partie de la compensation de charge dans le neutrophile est effectuée par le canal de proton HVCN1 ^{4, 5.} Ce canal permet le mouvement passif de protons vers le bas de leur gradient électrochimique du cytosol dans le phagosome. la concentration en protons est réfléchie par le pH, de sorte que pour un niveau donné d'activité de l'oxydase, la mesure du pH dans le phagosome peut fournir des informations sur la participation relative des voies protoniques et non protoniques à compensation de charge.

Le phagosome neutrophile humaine a un pH alcalin d'environ 8,5 pour 20 à 30 min après ⁵ phagocytose. Cela implique l'existence de canaux supplémentaires d'ions non-proton Noxcompensation de charge 2 induite, comme la fusion et la libération du contenu des granules acides et unique compensation par HVCN1 permettrait de maintenir un environnement acide, contrairement à celle observée. Le mouvement d'ions pour compenser cette charge négative peut aussi exercer des changements dans la taille de l'phagosome par osmose. Ces ions peuvent être présents dans le neutrophile à de fortes concentrations physiologiques: ions potassium ont été montrés pour se déplacer dans le phagosome ^6, et le mouvement ionique est le chlorure d' un autre candidat important pour la fonction des neutrophiles ^7.

La régulation du pH dans le phagosome est vital pour l' activité de la protéase antimicrobienne ^5. Myéloperoxydase (MPO) semble avoir une activité optimale à un pH de 6, tandis que pour la cathepsine G et l' élastase, les niveaux optimaux sont pH 9.7 et pH 8-10, respectivement ^5. Par conséquent, le changement transitoire de pH phagosome peut fournir des créneaux d'activité pour les différentes enzymes pour le plaisirction. Comprendre comment le pH est impliqué dans destruction microbienne neutrophile peut fournir des informations utiles pour la conception de nouveaux neutrophile-augmentation des agents microbiens.

Le phagosome neutrophile est un environnement très réactif. Cela rend difficile d'évaluer avec précision le pH, car les colorants peuvent être facilement oxydées, ce qui conduit à des artefacts techniques. Historiquement, l' isothiocyanate de fluorescéine (FITC) a été le colorant de choix pour mesurer le pH intracellulaire ^{8, 9.} Cependant, il y a quelques inconvénients pour son utilisation dans la mesure du pH neutrophile phagosome. Il a un pKa de 6,4 ^10, ce qui signifie qu'elle ne peut précisément être utilisé pour évaluer les niveaux de pH de 5 à 7,5 ^8, comme il sature à pH <8 ^11. Comme le pH du phagosome neutrophile peut devenir beaucoup plus alcalin ^5, FITC ne peut pas saisir la gamme complète des changements de pH potentiels. Un autre signifiproblème avec dévers FITC dans le contexte de neutrophiles est qu'il pense être par FTU ¹² Photo - blanchissement. L'inhibiteur de la MPO, l' azoture de sodium, peut être utilisé pour limiter photoblanchiment ^13, mais il a été montré que l' azoture de sodium abaisse le pH directement du phagosome d'une manière indépendante MPO et est donc inapproprié pour une utilisation dans de tels dosages ^5.

Par rapport aux autres colorants intracellulaires, S-1 a un pKa relativement élevé de 7,5 ^10. Dans des conditions acides, la molécule est protoné et produit un signal d'émission entre 560 et 600 nm lorsqu'il est excité à 488 nm ou au-dessus. Lorsque la molécule est déprotoné dans des conditions plus alcalines, la longueur d'onde d'émission est supérieure à 600 nm. Un rapport des intensités de fluorescence à ces deux longueurs d'onde indique le décalage d'émission, qui est plus est plus fiable que les mesures de fluorescence uniques, car il est affecté par la concentration de fluorophore et de la structure cellulaire. S-1 peut être conjugué à une substance antigénique, tel que le zymosan ^14, bien que tué par la chaleur (HK) Candida albicans est préféré, car la plus grande surface donne une lecture de fluorescence plus cohérente.

Nous avons également utilisé une modification de cette méthode pour étudier les changements temporels de pH (figure 3) ^5. Cette méthode de mesure du pH cytosolique peut être facilement appliquée à d' autres types de cellules, comme décrit ailleurs ^{15, 16,} et les cellules avec des phagosomes plus alcalins ^14.

Protocole

déclaration éthique: Tous les travaux des animaux a été réalisée avec la licence et l'approbation du Royaume-Uni Home Office. participation humaine dans cette recherche a été approuvé par les comités UCL communs / UCLH sur l'éthique de la recherche humaine. Tous les participants ont donné leur consentement éclairé.

1. Préparation de C. albicans

1. Développer un disque Candida (voir Liste des matériaux) sur une plaque de gélose YPD selon les instructions du fabricant. Choisissez une colonie et l'ajouter à 15 ml de bouillon YPD. Incuber dans un incubateur à agitation par secousses à 30 ° C et 200 tours par minute jusqu'à ce que le bouillon est trouble (habituellement environ 2 jours, ou à une concentration d'environ plus de 1 x 10 ⁹ / ml).
2. Isoler le moyen Candida et remettre en suspension dans 50 ml d' une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger à 3000 g pendant 10 min. Répétez cette étape deux fois.
3. Placer le tube contenant 50 ml de milieu PBS / Candida dans un bain d'eau préchauffé à 60 ° C de sorte que l'ensemble du tube est submerged pendant 1 h.
   1. Pour confirmer que le Candida sont tués par la chaleur, strie un échantillon sur une plaque de gélose YPD et incuber pendant une nuit à 30 ° C. Ajuster la concentration de chaleur tué (HK) Candida à 5-9 x 10 ⁸ / ml, en fonction de la croissance de Candida, et le stocker dans aliquotes de 1 ml dans un congélateur à -20 ° C.
      NOTE: Tous les comptages de cellules dans ce protocole ont été effectuées à l'aide d'un compteur automatique de cellules.

2. S-1 couplage à la chaleur tués (HK) Candida

1. Préparer une aliquote de carboxy-S-1 ester de succinimidyle (50 ug) en le diluant dans 100 ul de diméthylsulfoxyde à haute teneur (DMSO). Vortex bien mélanger.
2. Préparer 1 ml de 1 x 10 ⁸ Candida HK dans 0,1 M de bicarbonate de sodium (pH 8,3) dans un tube de 15 mL.
3. Ajouter 100 ul de 1-S-carboxy une goutte à la fois à la Candida HK pendant le mélange sur un vortex à environ 2000 tours par minute (vitesse moyenne à élevée). Enveloppez aluminium LLAIL autour du tube et le placer sur un rouleau à la température ambiante pendant 1 h.
4. Laver le Candida- HK S-1 (HKC-S-1) trois fois par centrifugation à 2250 xg pendant 10 min chacun. Pour les deux premiers lavages, resuspendre le culot dans 15 ml de 0,1 M de bicarbonate de sodium (pH 8,3). Après le troisième lavage, remettre en suspension dans 1 ml de tampon de solution saline équilibrée (BSS) (voir tableau 1).
5. Transférer les HKC-S-1 en suspension dans des tubes en aliquotes de 100 pi et de les stocker à -20 ° C.
   NOTE: Utiliser des tubes avec un matériau de liaison à faible surface, si possible, sous forme de particules HKC-S-1 peuvent se coller à la paroi des tubes à centrifuger normales.
6. Opsoniser HKC-S-1
   1. Pour les neutrophiles humains, ajouter 100 pi de sérum IgG humaine à 100 pi de décongelés HKC-S-1.
   2. Pour les neutrophiles de souris, ajouter 50 ul de sérum de souris normal et 50 ul de souris Candida sérum immun (généré à partir de souris C57B6 injectés avec Candida HK) ⁵ à 100 uLde HKC-S-1.
   3. Mélanger sur un agitateur à la chaleur à 37 ° C et 1 100 tours par minute pendant 60 à 90 min, puis sur un rouleau à 4 ° C pendant 2 h.
   4. Laver trois fois dans du tampon BSS par centrifugation à 17.200 g pendant 1 min à chaque fois. Remettre en suspension dans 100 ul de tampon BSS.

3. Isolation de polynucléaires neutrophiles

1. Pour les neutrophiles du sang périphérique humain, prendre 15 ml de sang par ponction veineuse d'un donneur sain et le placer dans une seringue de 20 ml contenant 90 uL de 1 000 UI / ml de solution de sodium de l'héparine (60 pl d'héparine / 10 ml de sang).
2. En utilisant une pointe de pipette, injecter 1,5 ml de solution de dextran à 10% dans la seringue. Renverser doucement 3 fois et laissez-le debout sur le banc.
3. Attendre 30 à 60 min, jusqu'à ce que le sang est divisé à peu près en deux, avec une couche supérieure de la couche leucocytaire qui est de couleur paille et une couche inférieure contenant les erythrocytes.
4. pousser doucement la couche supérieure à travers une aiguille ou l'enlever avec une pointe de pipette. Mettez iTube na 15 ml. Évitez de prendre la couche rouge. En utilisant une pipette de 5 ml, ajouter 3-4 ml de milieu de gradient de densité (voir Matériaux List) au fond du tube sous la couche leucocytaire pour obtenir deux couches distinctes. Centrifuger à 913 g pendant 10 min.
   NOTE: Si vous utilisez neutrophiles de souris (voir référence ¹⁷ pour l' isolement neutrophile de la souris), utilisez la suspension cellulaire qui a été rincée de la moelle osseuse à la place.
5. Verser le surnageant, laissant derrière lui une pastille rouge. Vortexer doucement pour perturber le culot. Ajouter 7 ml d'eau distillée, autoclavé H ₂ O au culot et inverser pendant 20 s pour remettre en suspension le culot. Ajouter 7 ml de solution saline 2x et retournant plusieurs fois pour mélanger, lyser les globules rouges restants.
6. Centrifuger à 300 g pendant 5 min. Verser le surnageant et remettre en suspension le culot dans du tampon BSS à environ 4 x 10 ⁶ / ml.
   NOTE: Pour la microscopie optimale des cellules, maintenir la concentration de la suspension cellulaire entre 1,5-6 x 10 ⁶ / ml.

4. Préparation des lames

1. Pré-traiter une plaque de microscopie 8 puits (voir Matériaux List) avec 200 ul de poly-L-lysine (solution à 0,01%) dans chaque puits pendant 40 à 60 min à la température ambiante.
2. Supprimer la poly-L-lysine (peut être réutilisée) et laver les puits deux fois avec 200 ul d'eau distillée ₂ O.
3. Ajouter 200 pi de suspension cellulaire préparée à l'étape 3.6 à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 30-60 min.
4. Préparer une fraction aliquote de 5- (et-6) -carboxy ester S-1 acétoxyméthyle (S-1-AM) (50 pg) en ajoutant 100 uL de DMSO de haute qualité pour un tube. Vortex à mélanger. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, le stockage à -20 ° C.
5. Dans un petit tube, ajouter 1,7 ml de tampon BSS et 20 ul de S-1-AM. Vortex à mélanger.
6. Laver les puits deux fois avec 200 ul de tampon BSS, puis remplacer le tampon avec la solution de S-1-AM. Prenez soin de ne pas perturber la monocouche de cellules attachées au fond du puits par pipetagesur les parois des puits. Incuber à température ambiante pendant au moins 25 min.
7. Laver les puits deux fois avec 200 ul de tampon BSS. Pour tester un inhibiteur, forment un « mélange maître » du médicament approprié dans un tampon BSS. Laver les puits deux fois dans la solution d'inhibiteur.
   REMARQUE: Assurez - vous d'utiliser la même quantité de véhicules de médicaments (par exemple, le DMSO ou l' éthanol) dans le contrôle et a été utilisé pour l'inhibiteur. Si le test de l'effet du chlorure de zinc, en utilisant un tampon BSS manque KH ₂ PO ₄ (l'HEPES peut tamponner la solution seul), comme le zinc précipite avec du phosphate.
8. Soniquer l'HKC-S-1 opsonisé (section 6.2) pendant environ 3 s à 5 um d'amplitude. Ajouter 10 pi à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 15 à 20 min pour permettre à la phagocytose, ce qui rend les cellules prêtes à être imagée pour les clichés de la phagocytose.

5. Microscopie confocale

1. En utilisant un microscope confocal, d'ajuster la longueur d'onde du laser de sorte thles cellules sont excités à 555 nm et l'émission est détectée par deux canaux, ou des détecteurs: 560-600 nm et plus de 600 nm.
   REMARQUE: Les paramètres de microscope spécifiques seront différents pour chaque microscope et doivent être optimisés par le chercheur.
2. Voir les cellules en utilisant une lentille 63X avec de l'huile. Utilisez une image de balayage de tuiles sur le réglage en continu pour voir la tuile centrale. Utilisation de l'intensité de fluorescence et le gain des canaux de détection, la mise au point et l'intensité du laser et le gain des deux canaux afin d'optimiser l'image.
3. Diviser l'image en utilisant les paramètres pour afficher les deux canaux; vérifier qu'il n'y a pas de saturation de l'intensité de fluorescence dans le cytoplasme ou les vacuoles. Saturation apparaît sous forme de points rouges. Réduire l'intensité du laser afin qu'il y ait un nombre minimal de points rouges, mais les cellules et phagosomes sont assez brillantes pour voir clairement.
4. Lorsque vous êtes satisfait, cliquez sur « Lancer expérience. » Une image de balayage 9-tuile est généré. Enregistrez l'image sous forme de fichier complexe recommandé parle logiciel qui contient une image composite des deux canaux (non JPEG ou TIFF).

6. Les expériences d'étalonnage

1. La construction de la courbe étalon de pH à Candida seul.
   1. Préparer les tampons de pH de 3,0 à 13,0, selon le tableau 1.
   2. Prendre une aliquote (100 ul) de HKC-S-1. Faites tourner vers le bas pendant 1 min à 17 200 x g. Remettre en suspension dans 500 ul de tampon assignée.
   3. A partir de la plage de pH plus bas, ajouter la suspension à un puits pré-traité (étape 4.2). Placer la lame sur le microscope confocal sur une platine chauffante réglée sur 37 ° C.
   4. Enregistrez la fluorescence toutes les minutes pendant 10 min. Répéter pour chaque tampon.
2. Saponine courbe standard.
   1. Isoler 1 x 10 ^{7 5} neutrophiles humains et de les remettre en suspension dans 1 ml de tampon de pH plus bas.
   2. Suivre la méthode décrite dans la section 4 pour la mesure de ppH hagosomal dans les neutrophiles.
   3. Après incubation avec la suspension Candida pendant 20 min, ajouter 0,3% de saponine (15 ul de bouillon de 10% à une pré-traité bien (étape 4.2)) à l'antenne, puis incuber pendant 20 min à 37 ° C. Prenez une image toutes les minutes pendant 10 min. Répéter pour chaque tampon.
3. Cytosoliques courbes standards de pH en utilisant la technique de haute K ⁺ / nigéricine ^{5, 18, 19.}
   1. Faire les tampons décrits dans le tableau 1, de pH 4,0 à 13,0.
   2. Suivre les étapes 4.1-4.7, ne laissant que des neutrophiles dans les puits prétraités - chaque puits pour contenir un tampon différent. Ajouter la diapositive à l'étage chauffé à 37 ° C et enregistrer la fluorescence toutes les min pendant 10 min.
   3. Note: Il peut prendre un certain temps pour le pH cytosolique pour stabiliser avec la solution externe, mais après ce point, la valeur du rapport S-1 devientconstante. La mesure des extracellulaires HKC-S-1 dans chaque expérience peut servir de témoin pour vérifier que les inhibiteurs ajoutés ne pas interférer avec la fluorescence émise S-1 ou affectent le pH du tampon.

7. Analyse de l'image

REMARQUE: Ici, les instructions pour l'analyse d'image (quantification de la fluorescence) en utilisant le logiciel ImageJ gratuit est fourni. L'utilisation de ImageJ est recommandé.

1. Téléchargez et installez la version ImageJ> 1.46r selon les instructions du développeur (https://imagej.nih.gov/ij/). Installez le fichier de code supplémentaire attaché avec ce protocole appelé « mesure du phagosome. »
2. Ouvrir une image J et charger le fichier d'image choisie pour l'analyse sur la barre d'outils. Pour combiner les deux canaux, utilisez Image> Couleur> Make Composite.
3. Faites un clic droit pour choisir un fichier dans lequel stocker les résultats.
4. Cliquez sur l'outil de ligne sur la barre d'outils et cliquez deux fois pour augmenter la largeur & #34; 2 « .
5. Tracer une ligne sur toute la largeur d'un phagosome, puis clic droit « pH mesure ». L'intensité moyenne des deux canaux est acquise, et leur rapport est calculé automatiquement par le fichier de code dans ImageJ.
6. Après avoir terminé les mesures, faites un clic droit choisir « Enregistrer le fichier. »
7. Pour mesurer la zone phagosome, utilisez la quatrième icône dans la barre d'outils pour dessiner à main levée dans la région. Faites un clic droit pour sélectionner « zone de mesure. »
   REMARQUE: Les résultats sont enregistrés et un fichier journal est généré dans le répertoire sélectionné. Les résultats peuvent être traités en utilisant un tableur, R, ou un logiciel équivalent. La relation entre le rapport de fluorescence à pH est approximativement sigmoïde, et les valeurs des rapports générés par l'analyse de ImageJ peut être converti à un pH en utilisant une fonction logistique ou sigmoïde généralisée ou linéaire ou l'interpolation spline cubique.
8. Pour mesurer cytoplasme, tracer une ligne à travers le cytoplasme et clic droit pour « pH mesure».

Résultats

La figure 1 présente des instantanés de neutrophiles d'origines différentes pour démontrer divers environnements du phagosome. Pour faciliter l'analyse quantitative, il est important de semer les puits avec un nombre approprié de cellules: un trop grand nombre ramènerai les cellules à couche sur l'autre, ce qui rend difficile de voir phagosomes clos avec précision; trop peu sera, bien sûr, fournir moins de résultats, notamment en ce ne sont pas tous neutrophile va phagocyter. La figure 2 est une image qui est sur-saturé; ce peut être évaluée en divisant l'image entre ses deux canaux (à l'aide du logiciel de microscope recommandé dans la Liste des matériaux ou un équivalent) - points rouges indiquent où la fluorescence maximale a été détectée. Cela peut être contré en réduisant l'intensité du laser. Des courbes d'étalonnage en utilisant les divers systèmes tampons sont représentés sur la figure 3, adapté de Levine et al. ^{5 <}/ Sup>. Les barres d'erreur montrent qu'il existe une certaine variation de la fluorescence entre les lectures. La figure 4 donne un exemple de la façon dont pourraient être présentées les données pour le pH du phagosome et la région. Cette approche permet à chaque mesure individuelle à afficher avec un boxplot over pose. Cependant, les données peuvent également être affichés dans un graphique à barres de l'histogramme.

Figure 1: les images instantanées appropriées des neutrophiles de l' homme et la souris. Pour l'extrême droite est une clé visuelle qualitative de la couleur approximative des phagosomes colorées S-1 correspondant au pH. La couleur jaune indique plus d'acidité, tandis que le rouge indique plus alcalinité. (A) montre Hvcn1 ^{- / -} neutrophiles de la moelle osseuse de la souris 20 min après phagocytose. Les phagosomes apparaissent très rouges, alcalines, et gonflé. La flèche rouge dans la partie inférieure droite de lales points d'image à un Candida intracellulaire, tandis que la flèche dans les points en haut à gauche à une particule extracellulaire. (B) montre des neutrophiles de la moelle osseuse de souris de type sauvage qui ont ingéré Candida; ils sont beaucoup moins alcalin que Hvcn1 ^{- / -} cellules. (C) montre les neutrophiles du sang périphérique humain au même point après phagocytose. Ils apparaissent un peu plus alcalin que les cellules de type sauvage de la souris, mais les phagosomes ne sont toujours pas aussi grand et rouge comme le Hcvn1 ^{- / -} cellules. (D) montre des neutrophiles humains qui ont phagocyté Candida en présence de 5 uM de diphénylène iodonium (DPI). Tous les phagosomes sont très acides, ayant un pH de 6 ou moins; le médicament inhibe la NADPH oxydase, donc il n'y a pas de mouvement d'ions compensatoires. Les protons libérés à partir des granulés acides qui fusionnent à la phagosome provoquent le pH acide de ^20, et le recrutement accru de la V-ATPase de the membrane du phagosome lors d'un traitement avec le DPI ^9. Le cytoplasme apparaît également plus alcalin par rapport aux cellules des autres conditions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: sursaturation de Hvcn1 ^{- / -} neutrophiles de la moelle osseuse de souris. Il est important d'exclure des images d'analyse dans lequel les données de fluorescence sont sursaturée. Comme cela est décrit dans la section 5.3, l'image composite est divisé en deux images (en haut à gauche, la flèche rouge) avec les deux canaux présentés individuellement. Dans ce logiciel, l'indicateur de gamme est vérifiée sur (en bas à gauche, la flèche rouge), puis tous les pixels qui sont sur-saturée sont de couleur rouge vif. Il est présent sur-saturation dans les deux canaux (1 et 2). A magnification de certaines cellules et extracellulaire Candida est montré en bas à droite, avec des flèches pointant vers les zones touchées. L'analyse de ces points conduirait à une fausse mesure radiométrique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: courbes d'étalonnage standard pour la conversion des rapports de fluorescence S-1 à des mesures de pH. Les courbes standard pour Candida seul dans les différents tampons (étiquetés comme « Tris ») , et lorsque les cellules sont perméabilisées avec de la saponine ( « saponine ») sont très similaires, montrant que le S-1 la lecture de l' intérieur et à l' extérieur de la cellule (phagosome et extracellulaire moyen) sont comparables. Les barres d'erreur représentent la moyenne ± écart-type. La courbe de rapport / pH S-1 est réduite lorsqu'elle est testée in le cytoplasme ( « Cytoplasme »), qui doit être pris en compte dans l'analyse de l'image. Ce chiffre a été modifié de Levine et al. ^5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Quantification de pH du phagosome et région. Cette figure présente un exemple de présentation des données. Les graphiques ont été générées à l' aide du logiciel de programmation R. A: représente le rapport du phagosome et à un pH correspondant à A (Hvcn1 ^{- / -} neutrophiles de la moelle osseuse de souris), B: neutrophiles de la moelle osseuse de souris de type sauvage, C: neutrophiles du sang périphérique humain, et D: humain neutrophiles avec 5 uM DPI n = 3/300. Les mesures individuelles sont représentées sous forme de petits carrés, avec un superposant boxplot avec médiun et écart interquartile. Une barre rouge représente la moyenne. Comme on le voit dans les images de la figure 1, Hvcn1 ^{- / -} cellules ont très alcalines phagosomes par rapport à la souris de type sauvage et neutrophiles humains. Ils ont aussi une plus grande surface de phagosome (figure 4B, n = 3/300). phagosomes neutrophile humains sont un peu plus alcalin et plus grand que les neutrophiles de souris de type sauvage, tandis que les neutrophiles humains mis en incubation avec le DPI ont très acides et petites phagosomes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Un tampon de solution saline équilibrée (BSS)
NaCl	156 mM
KCI	3 mM
MgSÛ4	2 mM
KH 2 PO 4	1,25 mM
CaCl2	2 mM
Glucose	10 mM
Hepes	10 mM
pH 7,4 avec du NaOH ou du HCl
bouillon YPD
bouillon YPD	50 grammes
Eau distillée	1 L
Autoclave à 121 ° C pendant 15 min
Pour agar YPD: avant autoclavage ajouter 15 g / L agar
10% de solution de dextran
grade clinique dextran		50 grammes
NaCl		4,5 g
Eau distillée		500 ml
Ajouter à la bouteille en verre et autoclave à 121 ° C pendant 15 min
2x solution saline
NaCl		18 g
Eau distillée		1 L
Ajouter à la bouteille en verre et autoclave à 121 ° C pendant 15 min
10% saponine stock
tampon BSS		50 ml
saponine		5 g
un tampon de chaleur du SRS à 37 ° C, ajouter la saponine et mélanger.
Ajouter 0,1% d'azide de sodium comme conservateur, le mélange de conserver à 4 ° C.
Tampons d'étalonnage
Candida courbe standard
Tout d'abord compenser 0,15 M de chaque stock tampon
Compenser une solution de NaCl 0,15 M
15 ml de volume final: 5 ml 0,15 M de solution tampon souhaitée + 10 ml de NaCl 0,15 M solution
pH 3	100 mM de NaCl	50 mM de glycine
pH 4	100 mM de NaCl	50 mM d'acétate
pH 5	100 mM de NaCl	50 mM d'acétate
pH 6	100 mM de NaCl	50 mM d'acétate
pH 7	100 mM de NaCl	Tris 50 mM
pH 8	100 mM de NaCl	Tris 50 mM
pH 9	100 mM de NaCl	Tris 50 mM
pH 10	100 mM de NaCl	50 mM de glycine
pH 11	100 mM de NaCl	50 mM de phosphate
pH 12	100 mM de NaCl	50 mM de phosphate
pH 13	100 mM de NaCl	50 mM de phosphate
Courbe standard cytosolique
Auparavant utilisé 0,15 M solutions tampons stock
Make up solution KCI 0,15 M
15 ml de volume final: 5 ml de tampon 0,15 M souhaitée + 10 ml 0,15 M KCl
10 mM stock d'nigéricine dans l'éthanol, ajouter 15 pi à chaque solution de volume final
pH 3	100 mM de KCl	50 mM de glycine	10 uM nigéricine
pH 4	100 mM de KCl	50 mM d'acétate	10 uM nigéricine
pH 5	100 mM de KCl	50 mM d'acétate	10 uM nigéricine
pH 6	100 mM de KCl	50 mM d'acétate	10 uM nigéricine
pH 7	100 mM de KCl	Tris 50 mM	10 uM nigéricine
pH 8	100 mM de KCl	Tris 50 mM	10 uM nigéricine
pH 9	100 mM de KCl	Tris 50 mM	10 uM nigéricine
pH 10	100 mM de KCl	50 mM de glycine	10 uM nigéricine
pH 11	100 mM de KCl	50 mM de phosphate	10 uM nigéricine
pH 12	100 mM de KCl	50 mM de phosphate	10 uM nigéricine
pH 13	100 mM de KCl	50 mM de phosphate	10 uM nigéricine
pH de toutes les solutions d'étalonnage soit avec HCl ou NaOH

Tableau 1: Composition des tampons. Le tableau suivant décrit les compositions appropriées des différents tampons utilisés dans le protocole.

Fichier de code supplémentaire. Ce fichier contient un certain nombre de macros, écrites par AP Levine, qui sont nécessaires pour l'analyse d'images. Les auteurs seraient heureux d'essayer de répondre à toutes les questions liées à l'utilisation de ce code. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Une fois que les réactifs appropriés, réglages du microscope et des expériences d'étalonnage sont mis en place, cette méthode est relativement simple à réaliser. Les étapes essentielles suivantes: l' étiquetage de la Candida avec S-1 afin d' assurer qu'il n'y a pas de surcharge du colorant, d' étalonnage et l' analyse de l'image.

S-1 est un réactif adapté à des environnements de plus de pH alcalin, ce qui est particulièrement important pour les neutrophiles ²¹ mais limite son utilisation dans certains types de cellules. Pour les environnements plus acides, tels que les phagosomes des macrophages, SNARF-4, ou S-4, est plus appropriée en raison de son pKa inférieur ^22. En outre, pour des lectures plus précises cytoplasmiques, il est préférable d'utiliser S-4, la courbe d' étalonnage pour le S-1 montre que les rapports de fluorescence commencent à plateau en dessous de pH 6 (Figure 3). D'autres colorants, tels que les 2' , 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine (BCECF) ou pHrodo Red peuvent aussi être plus approprié dans un contposte qui devrait être acide. Cependant , la coloration du cytoplasme est encore nécessaire pour l' identification correcte des phagosomes contenant Candida.

Une caractéristique importante d'un indicateur de pH du phagosome est qu'il ne soit pas modifiée de manière irréversible par l'environnement du phagosome réactif. S-1 semble être résistant au milieu neutrophile. Ceci est illustré par Levine et al. ⁵ (voir complémentaire vidéo de référence 4 ⁵⁾ qui démontrent la phagocytose et la libération ultérieure d'un S-1 marqué par une particule Candida Hvcn1 ^{- / -} neutrophiles. Lorsque phagocyté, la particule passe du jaune / orange au rouge (pH neutre à alcalin), mais quand la particule est libérée par le neutrophile, il retourne à sa couleur d'origine.

Il est important de mentionner quelques-unes des limitations associées à l'utilisation de S-1. Le fait que ce colorant présente deux spectres d'émission permettant meas ratiométriqueurement est un avantage, mais un équipement spécialisé est nécessaire pour acquérir des images; le microscope utilisé pour les expériences doivent être en mesure d'enregistrer deux images simultanément ou avec un retard insignifiant. Les auteurs supposent que le chercheur de tenter ce protocole a de l'expérience en utilisant la microscopie confocale, ou a accès à un professionnel qualifié. Nous ne pouvons pas lister tous les paramètres de microscope spécifiques car ils diffèrent pour chaque microscope et doivent être optimisés par le chercheur. L'ester d'acétoxyméthyle conjugué à S-1 qui permet au colorant de diffuser dans le cytoplasme cellulaire est dégradé par des esterases non spécifiques dans le cytoplasme de la cellule pour former la molécule fluorescente. Estérases, tels que la phosphatase alcaline, sont présents dans le sérum humain et du sérum de veau fœtal, qui sont utilisés pour compléter les milieux de culture cellulaire. En conséquence, le milieu dans lequel les cellules sont chargées avec S-1-AM (section 4.5) ne doit pas contenir du sérum. Cela peut se révéler difficile si l'utilisation de cellules qui nécessitent une plus-ric nutrimentsh moyen pour les soutenir que la solution saline équilibrée utilisé tout au long de ce protocole. De même, d'autres composants du milieu fluorescent, comme le rouge de phénol, peuvent interférer avec les mesures S-1.

Les barres d'erreur sur la figure 3 indiquent qu'il y a une certaine variation dans les mesures de rapport à chaque pH. Un nombre approprié de répétitions de chaque expérience (au moins n = 3) et le plus grand nombre de mesures individuelles dans chaque expérience unique sont nécessaires pour surmonter la variation inter-vacuolaire. Il est donc conseillé de mesurer le pH d'au moins 100 phagosomes pour chaque condition et autant de zones de phagosome qui semblent contenir qu'une seule Candida. Les phagosomes à mesurer pour la quantification doivent être ceux qui ont complètement englouti une particule Candida ( par exemple, ceux complètement entouré par le cytoplasme). Pour atténuer les préjugés involontaires dans la sélection des cellules / phagosomes pour la quantification, toutes les analyses doivent être effectuées enaveugle aux conditions expérimentales.

Ici, nous décrivons l'isolement des neutrophiles par sédimentation au dextrane de sang entier par centrifugation, suivie de la couche de plasma à travers un gradient de densité. Nous utilisons cette technique rapidement et produit efficacement un pur (> 95%) population de neutrophiles, bien qu'il existe d'autres méthodes disponibles, telles que la centrifugation de sang total par d'autres formules de gradient de densité ou la sélection négative des neutrophiles en utilisant des kits spécialisés avec des anticorps ou magnétiques perles. Toutefois, ce dernier peut être prohibitif pour la plupart des groupes qui isolent neutrophiles régulièrement. En outre, on utilise l'héparine anticoagulante dans le tube de collecte de sang, alors que d'autres chercheurs peuvent être plus habitués à utiliser l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou le citrate de sodium de l'acide (ACD). Comme il existe de nombreuses méthodes différentes à choisir, il est à la préférence personnelle du chercheur.

En outre,lors de l'isolation et la manipulation de neutrophiles, ils doivent être manipulés avec soin afin d'éviter une activation excessive. des mesures de précaution suivantes: en utilisant uniquement les articles en plastique, pas de verre; filtrage stériliser tous les tampons pour éliminer tout contaminant endotoxine; neutrophiles filature assurez-vous que la centrifugeuse est bien équilibrée pour éviter des vibrations excessives; limiter autant que possible les neutrophiles temps restent dans un culot après centrifugation; ne pas maintenir les neutrophiles en solution de plus de 5 x 10 ⁶ / ml; et réaliser l'expérience le plus tôt possible après l'isolement.

Ce procédé peut être adapté pour mesurer les variations du pH et de la zone phagosome au fil du temps en utilisant un ensemble de stade chauffé à 37 ° C sur le microscope et prendre des instantanés une fois tous les 30 à 60 s à partir de la même position, comme décrit pour les étapes d'étalonnage. Il pourrait également théoriquement être adapté pour des expériences à haut débit, par exemple dans des plaques à 96 puits, et pour les expériences de cytométrie en flux, où S-1 peutêtre utilisé comme un indicateur de pH ^23. Cependant, dans ces milieux, l'accent sur l'activité cellulaire individuelle est remplacée par un effet plus global sur la population cellulaire.

Cette méthode vise à fournir un dispositif expérimental relativement simple sur laquelle les chercheurs individuels peuvent adapter en fonction de leur domaine d'intérêt. Les chercheurs peuvent vouloir explorer neutrophile pH phagosome et de la zone tout en mesurant également le mouvement des autres ions, par exemple, la concentration de calcium intracellulaire. Il y a plusieurs Ca ²⁺ fluorescents indicateurs facilement disponibles pour la microscopie confocale, comme indo-1, qui a également des spectres à double émission à 400 et 475 nm ^24. Ces longueurs d'onde d'émission ne se chevauchent pas avec les spectres d'émission S-1, mais la longueur d'onde d'excitation est à l'extrémité ultraviolet (UV) du spectre, ce qui peut être dommageable pour les cellules, et un laser UV est pas courante sur tous les microscopes. Un examen complet des différents indicateurs pourmesurer le flux de calcium intracellulaire est couvert par Takahashi et al. ²⁵ et Hillson et al. ^26.

En conclusion, il existe d' autres méthodes pour mesurer le pH du phagosome en utilisant différents colorants fluorescents comme Nunes et al. ont montré ¹³ aussi bien que d' autres groupes ^{27, 28.} D' autres chercheurs ont également utilisé S-1 pour mesurer cytosolique pH ²⁹ ou pH ¹⁴ phagosome. Cependant, ce protocole est unique pour mesurer simultanément le pH des deux cytosol et phagosome, ce qui offre la possibilité d'observer les changements de surface de section transversale phagosome et de faire la distinction entre de type sauvage et Hvcn1 ^{- / -} neutrophiles de souris, et les neutrophiles humains avec et sans travail NADPH oxydase.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids  80 CFU	Sigma-Aldrich	RQC14003-10EA	Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions
YPD broth	Sigma-Aldrich	Y1375	Follow manufacturer's instructions, various providers exist
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000	MP Biomedicals	2101514	Use gloves
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL	Fannin, Wockhardt UK Ltd	FP1077	We purchased from UCH inpatient pharmacy
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging	Thermo Scientific/Invitrogen	SS22801	Use gloves
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate	Thermo Scientific/Invitrogen	C1272	Use gloves
Vivaglobin human IgG  160 mg/mL solution	CSL Behring	received as a gift	Various providers exist
Normal mouse serum	Abcam	ab7486	Various providers exist
Lymphoprep (density gradient medium)	Alere Ltd	1114547	Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toxic, use gloves, various providers exist
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Toxic, use gloves, various providers exist
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Toxic, use gloves, various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Various providers exist
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Various providers exist
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Various providers exist
Magnesium sulphate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Various providers exist
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Various providers exist
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Various providers exist
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434	Various providers exist
Absolute Ethanol	Sigma-Aldrich	2860	Various providers exist
Diphenylene iodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Various providers exist
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086	Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate
Poly L lysine	Sigma	P4707	Various providers exist
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)	Carl Zeiss		The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, >610 nm)
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat	Thistle Scientific	IB-80826	Other appropriate imaging dishes can be substituted
Soniprep 150	MSE		Any appropriate sonicator will suffice
TC20 Automated Cell Counter	BioRad		Various providers exist
1.5 mL Protein LoBind Tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA	Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs