宽吻海豚 (海豚截形) 精子: 收集、 冷冻保存和外源体外受精

摘要

在这里，我们目前成功地用于海豚精子收集、 冷冻保存和异源使用牛卵母细胞的体外受精效果的协议。

摘要

深低温保存的海豚精子的使用促进水生公园之间的遗传材料的交换，并使精子可到实验室进行研究，以进一步加深对海洋哺乳动物繁殖。外源体外受精，更换为异体受精，可以提供一种手段来测试精子生育潜力;研究生理学配子和胚胎的早期发育;和避免使用宝贵的海豚卵，很难获得。在这里，我们目前已成功地用于收集和海豚精子冷冻保存的协议。集合的精子进行人工刺激对经过训练的海豚。超低温保存是甘油使用三蛋黄基于扩展程序完成的。另外，我们提出一种协议，它描述使用海豚精子和牛卵母细胞的异种受精和用于验证所产生的胚胎，应用 pcr 技术的混合性质。异体受精提出了施肥的问题，可以作为一种工具用于研究配子生理学和早期胚胎发育。此外，异体受精成功演示这种技术的潜力，来测试海豚精子受精能力，值得进一步的检查。

引言

辅助生殖技术在野生动物，包括海洋哺乳动物发育不良。缺乏敏感的方法，以评估精子受精成功贡献的物种，如海豚生殖技术发展缓慢。它不是直到最近的宽吻海豚 (海豚截形) 基本精参数是报告的^1，2。但是，变量，如运动和形态，虽然广泛应用，给生殖效率的资料有限。精子质量的最佳指标是施肥潜力的评价。

最近，我们小组用一种方法来评估海豚精子通过评估雄原核形成和/或混合胚胎形成异源体外受精使用透明完整牛卵母细胞³后的施肥的潜力。海豚-牛异体受精使用作为它克服困难获得海豚卵母细胞的重要优点同源的体外受精，并有助于行之有效体外牛卵母细胞成熟系统的使用。为了避免种属特异性，异体受精通常被执行不到位的 ZP。虽然它允许对精子顶体反应的精子与卵黄膜融合的能力的评价，它损害的评价与施肥相关的其他功能。所述的过程使用透明完整卵母细胞和允许下列参数评价: 精子卵具约束力和附件、 渗透、 多精受精、 原核形成和混合胚胎卵裂。

在这里，我们目前为精子集合、 基本精子分析、 精子冷冻的海豚精子功能评价的几种协议通过评估雄性原核和/或混合胚胎的形成异源体外受精后使用透明完整牛卵母细胞。

研究方案

伦理声明: 所有的实验程序的审查和核准由体制动物护理和使用委员会和研究国家研究所 y y 法规国家博览会 （老龄研究所）。所有实验了按照指南 》 的护理和使用实验室的动物，通过社会的再生产研究和海洋哺乳动物照顾动物福利法。

1.海豚精子收集和冷冻保存

1. 制备
   1. 使 FERT 介质 （肝素和亚硫磺酸免）。准备 FERT 人 TALP 培养基 25 毫米碳酸氢盐、 乳酸钠 22 毫米，1 毫米丙酮酸钠、 6-毫克/毫升无脂肪酸牛血清白蛋白，与 10 毫克/毫升肝素 (pH 7.4)。
      注意: 使用日准备这种媒介和保持它在 38.5 ° C，5%CO ₂，并在使用前至少 2 小时最大湿度与空气气氛下。
   2. 准备三鸡蛋蛋黄基于缓冲区。溶解 30.28 g/L 三、 16.75 G-L 柠檬酸、 12.5 G-L 果糖 0.5 g/L 链霉素在纯水中的 (ph 值 7.3、 渗透压 = 310 收音机/公斤)。添加蛋黄 20%(v/v)。
2. 培训证明的育种男性的宽吻海豚躺在背 recumbence 附近游泳池边上，为自愿采精。
   注: 雄性海豚应培训 6 个月以上的正面，如前面所述 ⁴。
3. 通过轻轻按压在生殖器槽的海豚颅骨的区域，征求自愿挤压的阴茎从槽内生殖器执行各种触觉刺激。
4. 实现一个完整的勃起，直接后阴茎尖端到无菌容器中以获得射精。
5. 直到分析保持在 37 ° C 的精子样本。对于连续射精集合，每次使用新的丙烯玻璃重复步骤 1.3 和 1.4。
6. 集合后立即, 确定使用以前加热到 37 ° C.评价颜色、 ph 值和渗透压 （使用微压计） 射出精液的毕业的玻璃缸体积。
7. 评价在射精，精子的浓度将 10 微升的精子暂停添加到包含 90 µ L 的蒸馏水的离心管。确定使用计数室精子的精子浓度。
   注: 评估期间，剩下的留射出精液在 37 ° C.
8. 动力参数评估。
   1. 采取 10 微升的精子样本并将其放置在预热的精子会议厅。
   2. 评价动力使用计算机辅助精子分析系统，以前验证的宽吻海豚，能客观地评估精子动力 ².
      注: 如果有必要，样本的稀释精子 FERT 介质 （肝素和亚硫磺酸免） 与精子活力充分可视化。评估期间，维持在 37 ° C 样品加热的显微镜舞台上。
9. 20 微升的精子样本，并评价的可行性和精子形态作为先前描述 ⁵。
10. 转移到离心管中精子样本。离心机在 250 x g 5 分钟精子样本。后确定采用计数室的精子浓度，调整到 400 x 10 ⁶ 精子/毫升精子浓度。
    注意: 如果有必要，稀释与孤立精浆从同一射精过量体积从集中射精颗粒离心 （250 x g，10 分钟）。
    1. ，当然 5 分钟，慢慢稀释精子样本 1:1 (v/v) 与含有 1.5%甘油三鸡蛋蛋黄基于缓冲区。放置包含精子悬浮在 5 ° C，1 小时 30 分钟的管
    2. 执行第二次稀释的精子悬架的三蛋含有甘油获得 3%最后甘油浓度与终浓度为 200 x 10 ⁶ 精子/mL 的蛋黄基于缓冲区。保持精子悬浮在 5 ° C 10 分钟
11. 加载到 0.25 毫升吸管的精子悬浮。热封麦秆。在机架 4.5 厘米以上为 10 分钟的液态氮中稻草秸秆陷入液态氮和存储直到评价的地方。

2。异源 体外 受精使用透明完整牛卵母细胞

1. 制备
   1. 准备染色溶液和安装介质。
      1. 准备 Hoechst 股票溶液溶解 1 毫克的赫斯特在 1 毫升的蒸馏水。30 微升整除的数，保持他们在黑暗中在-20 ° C 直到使用。通过将 25 微升的赫司特公司股票解决方案添加到 5 毫升的磷酸盐缓冲液 (PBS) 辅以 1 g/L PVA 溶液染色。拌匀，保持在黑暗中在 4 ° C，直到使用。
      2. 准备安装介质混合 6.25 毫升的 PBS 6.25 毫升的甘油和 6.25 微升的赫司特公司股票解决方案。拌匀，保持在黑暗中在 4 ° C，直到使用。
   2. 介质准备卵母细胞的采集和 体外 受精。
      1. 盐溶液法制备水中加入 0.5 毫升的庆大霉素对 0.9%氯化钠蒸馏。
      2. 10 吴/mL 表皮生长因子 (EGF) 和 10%胎牛血清 (FCS) 加入 10 毫升的中医 199 准备股票成熟培养液。保持这两种媒体在 38.5 ° C，5%CO ₂，并在使用前至少 2 小时最大湿度与空气气氛下。
2. 收集在 33-35 ° C 的盐溶液中屠宰场卵巢，运到 4 小时内实验室从集合。
3. 一次在实验室里，清洗卵巢三次删除碎片和血液使用生理盐水以前加热到 37 ° C.保持卵巢在 37 ° C 的盐溶液中的过程。
4. 与 18 G 2 到 8 毫米蓇葖果抽吸针和 10 毫升注射器。收集 50 毫升管吸气的卵泡液。
5. 允许卵泡液含卵母细胞大约 15 分钟在 37 ° C，直到细胞沙站。删除与巴斯德吸管管上的清液和再次悬浮颗粒在 PBS。
6. 在 90 毫米菜在体视显微镜下恢复卵丘-卵母细胞复合体 (COCs)。
7. 洗 COCs 三次在 PBS 中和一次成熟培养液中。
8. 转让正常形态 COCs 4 井菜，每 500 毫升的培养液，每井 50 COCs 组含。
   注意: 在这里，三个井 – 异源体外受精、 一个控制好进行同源试管受精和一只含一井成熟 Coc 作为一个孤雌生殖的控件 – 使用了。
9. 孵育 24h 在 38.5 ° C，5%CO ₂，最大湿度与空气气氛下 COCs。
10. 准备介质和密度梯度。
    1. 准备受精介质 (FERT)，补充 25 毫米碳酸氢盐、 乳酸钠 22 毫米，1 毫米丙酮酸钠、 6 毫克/毫升无脂肪酸牛血清白蛋白，与 10 毫克/毫升肝素 FERT 人 TALP 介质。在 38.5 ° C，5%CO ₂，并在使用前至少 2 小时最大湿度与空气气氛下维护。
    2. 通过添加 1 毫升的密度梯度介质到 15 毫升管和 3 毫升的洗涤液 15 毫升管准备密度梯度。保持他们在至少 1 h.38.5 ° C
11. 洗 体外 成熟卵母细胞 FERT 介质中两次。
12. 转让，卵母细胞 4 井菜，每个含 50 COCs FERT 250 毫升。同时准备受精的精子保持 38.5 ° C，5%CO ₂，并在与最高湿度空气气氛下的 4 井菜。
13. 解冻冷冻的秸秆含海豚精子在水浴在 37 ° C 为 50 s.
    注: 牛精子进行同源试管受精必须被并行处理，对同源的牛体外受精后的标准协议。
14. 带 10 微升的精子样本，并将其置于预热的精子计数室。评估采用计算机辅助精子分析系统，以前验证的物种，能客观地评估精子活力的动力。在此期间，保持精子样本在 38.5 ° C.
15. 将精子样本添加到密度梯度管 （步骤 2.10.2）。离心机在 250 x g.10 分钟
16. 小心取出上清液使用巴斯德吸管。添加到包含颗粒管 3 毫升的洗涤液。再次通过轻轻搅拌悬浮颗粒。
17. 离心机在 250 x g.5 分钟删除与巴斯德吸管到 300 µ L 精子卷清。
18. 添加 5 µ L 的精子悬浮到离心含有 95 µ L 的蒸馏水。保持精子悬浮在 38.5 ° C.填充单元格计数室与 10 微升 1:20 的精子稀释和测量浓度。计算的金额必须添加到 100 μ L 的精子获得 2 x 10 ⁶ 精子/mL 的 FERT 介质。
19. 将计算的 FERT 和精子卷添加到 15 毫升管和轻轻地混用，巴斯德吸管。
20. 添加 250 µ L 的精子 FERT 悬浮每口井的含有 FERT 介质与成熟的卵母细胞获得终浓度为 1 × 10 ⁶ 精子/mL 4 井菜。
21. 共同孵育 18 小时在 38.5 ° C，5%CO ₂，并在与最高湿度空气气氛下配子。
22. 配制培养基的基础合成的输卵管液和 5 %fcs 的补充。准备 25 微升的合成输卵管液的培养液滴在 35 毫米菜满 3 毫升的矿物油。在 38.5 ° C，5%CO ₂，并在使用前至少 2 小时最大湿度与空气气氛下维护。
23. 在 2.5 h 后共同孵育，从盘子里删除 20 卵母细胞; 保持在相同的条件下孵化器中剩余的卵母细胞。
    1. 通过大力用一半的卵母细胞通过窄口径巴斯德吸管移液器 10 倍删除松散地连接的精子。
    2. 修复 20 的卵母细胞体外 50 µ L 的 0.5%的戊二醛 30 分钟洗 5 分钟 PBS 卵母细胞转移到 50 µ L 的赫斯特染液 15 分钟的卵母细胞和洗卵母细胞体外 PBS 为 5 分钟
    3. 单独将卵母细胞转移到 2 µ L 液滴的安装介质在每张幻灯片 10 卵率。轻轻地盖上盖玻片并加盖指甲油。
    4. 的附加到使用配有蓝光光学和 361 nm 励磁筛选器在放大 40 倍相衬显微镜的牛卵母细胞的精子计数。
24. 共同培养 12 小时后, 删除 10 推定受精卵从 4 井菜; 保持剩余的推定受精卵在相同的条件下孵化。
    1. 转让 10 推定受精卵到 15 毫升离心管 PBS 和涡流轻轻为 2 分钟，去除卵丘细胞含有 2 毫升。洗两次在 PBS，修复和污渍，如上文所述 （第 2.23.2 步。）
25. 18，20，22 和共同培养 24 小时删除 10 后推定受精卵从 4 井菜和涡，修复，和玷污它们如上文所述 （步骤 2.23.2）。保持其余的在相同的条件下孵化受精卵。
    1. Hoechst 染色评价原核形成和在同源和异源体外受精群体相-对比度/蓝光显微镜下的多精受精。
    2. 评估在每个采样 10 随机选择推定混合受精卵原核形成。确认下共焦激光扫描显微镜在 488 nm 氩激光激发和 515 到 530 nm 检测原核形成。
    3. 光节推定合子按顺序 （2 毫米） 和采集图像使用图像处理软件。可视化使用 3D 分析软件包。
    4. 后共同培养 24 小时，洗 50 推定合子四次在 PBS 中，两次在培养基。
26. 他们 25 组移交 microdroplets 培养基以前编写和平衡。
27. 维护在 38.5 ° C 下大气的 5%O ₂ / 5%CO ₂ 中与最大湿度空气。
28. 后 26 和 28 h 的共同孵育，从菜和涡、 修复、 删除 10 推定合子和玷污它们，如上文所述 （步骤 2.23.2）。
29. 后的文化的 48 h，观察在体视显微镜下的劈。
30. 通过将胚胎转移到 5 毫克/毫升蛋白酶解卸下卵透明带 (ZP)。
31. 三次单独在 PBS 洗每个胚胎。管理单元-冻结他们在 0.2 毫升的微量离心管中的液态氮内。在-80 ° C 保存它们，直到分析。

3。聚合酶链反应

1. 材料和试剂
   注: 试剂、 材料和设备用于执行 PCR 协议详细材料表和包括 PCR 管架和微 （P2，P20，P200，P1000），一套 1.5 毫升微量离心管、 PCR 管帽、 热循环、 紫外线照射、 琼脂糖凝胶和缓冲区 (三硼酸盐乙二胺四乙酸 (TBE))。
   1. 轻轻地解冻所有试剂在冰上的。在整个试验冰保持他们。使用 deoxynucleotides (dNTPs; dATP，dCTP，dTTP 和 dGTP)，目标引物对海豚 18 S 核糖体蛋白 (DQ404537.1); 参考基因编码R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG 和 F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA)，DNA 聚合酶、 DNA 聚合酶、 DNA 模板、 无菌水和氯化镁 (氯化镁 ₂ 在终浓度为 5.0 m m) 5 X 缓冲区。
   2. 琼脂糖凝胶和样品制备。
      1. 准备海豚和牛精子 DNA 样本。
         1. 解冻在 37 ° C 的水浴中每一物种冷冻秸秆 50 美国加入 3ml 的洗涤液。离心机在 250 x g 10 分钟，除去上清。添加 30 微升国有贸易企业裂解缓冲液 （50 毫米三-盐酸，ph 值 8; 20 毫米氯化钠; 和 1 毫米 0.1 %sds） 2 微升蛋白酶 K （20 毫克/毫升） 和 5 µ L 的醇 (DTT);最终浓度: 150 毫米。一夜之间保持在 55 ° C.添加 200 µ L 的超纯水。离心机在 250 x g 5 分钟保持上清液。DNA 浓度用分光光度计测量。
      2. 从海豚精子 (即， 40、 4 和 0.4 吴/mL) 用超纯水检查 PCR 条件有能力执行串行稀释度的 DNA检测少量的海豚 DNA。
      3. 执行牛精子 DNA (即 4,000、 400、 40 和 4 吴/mL) 用超纯水检查 PCR 条件是能够检测少量的牛 DNA 系列稀释。
      4. 编写的海豚和牛的胚胎。解冻胚胎在冰上。添加 8 µ L 的 100 微克/毫升蛋白酶 K 和维护一夜之间在 55 ° c。若要停止反应，请将样品放在 96 ° C 为 5 分钟
      5. 准备 2%琼脂糖凝胶电泳 TBE 缓冲液和添加的核酸染色使用标准技术 20 微升。
   3. 聚合酶链反应制备。
      1. 标签 PCR tube(s): 海豚系列稀释 (40、 4 和 0.4 吴/mL)、 牛系列稀释 （4,000、 400、 40 和 4ml 吴），同源牛的两个细胞的胚胎、 两细胞推定的外源胚胎和阴性对照。
      2. 编写一个主的混合物，在无菌 1.5 毫升离心管中给每个反应 25 微升最终卷。
         1. 添加 5 微升 5 X DNA 聚合酶弹性缓冲，0.5 微升的 dNTPs （10 毫米） 1.5 µ L 的氯化镁 ₂ （25 毫米），0.5 µ L 的正向和反向引物 (10 µ M)，1.5 微升的 DNA 模板 （精子） 或 8 µ L 的 DNA 模板 （2-细胞胚胎）由 25 微升最后一卷的 0.07 µ L Taq 聚合酶和无菌蒸馏水。拌匀。
2. 扩增
   1. 管置于热循环。选择以下程序: 94 ° C 3 分钟;94 ° C 为 15 的 40 个周期 25 59 ° C s s，72 ° C 为 20 s;和 72 ° C 为 5 分钟启动程序。
   2. 存储在 4 ° C.添加 2.5 微升的加载到每个 PCR 产物在 4 ° C 和负载 15 微升混合物的缓冲区到 2%琼脂糖凝胶的井管。一个 DNA 梯标记用于 PCR 片段的准确大小估计。
   3. 执行电泳 15 分钟，使 DNA 迁移。可视化乐队使用 UV 光源。

结果

所有结果，表和在这里提出的数字 （1 和 2） 被都转载权限³。

海豚精子有高动力后冻结和解冻

显示百分比 （%± SD） 84.5 ± 5.3 共能动和 69.1 ± 5.1 渐进式活动精子冷冻海豚射精。在动力方面，这些数字是代表高质量深低温保存的精子。

讨论

对于许多不同的哺乳类动物，有多样的优势，以利用冷冻精子。这些包括转移宝贵的遗传材料、 潜在的全球分布、 污染、 低风险和几十年来保持雄性配子的能力的能力。利用冷冻精子的宽吻海豚，至关重要，因为这一物种保护下附录 II 的引证，限制的运输和交换的动物之间不同的水上公园。海豚运输是创建后勤问题和危险的活动。然而，避免运送他们也有的后果，例如引入到动物圈养种群的血...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
FERT-TALP medium	Merck
TCM-199	Sigma	M-4530
Hoechst 33342	Sigma	B-2261
4-well dishes	Nunc	176740
Density gradient BoviPure	Nidacon International	BP-100
Washing solution Boviwash	Nidacon International	BW-100
Magnesium chloride	Promega	A35 1H
Sterile water	Mili Q sintesis A10 Millipore	A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA	Sigma	T4415
MB agarose	Biotools	20.012
5X GoTaq flexi buffer	Mili Q sintesis A10 Millipore	M 890 A
MB agarose	Biotools	20.012
Taq polymerase	Promega
SafeView	NBS Biologicals Ltd.	M 890 A
Makler counting chamber	Sefi Medical
Thoma chamber	Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000	Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300	Norwood
Computer assisted sperm analysis system	Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95	Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300	Nikon
Confocal assistant 4.02 software	Bio-Rad	3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy	Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)	Gilson
Microcentrifuge tubes	VWR
UV iluminator	Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus	MWG AG Biotech