Афалин (Tursiops truncatus) Дельфин сперматозоидов: сбор, криоконсервация и гетерологичных В экстракорпорального оплодотворения

Резюме

Здесь мы представляем протоколы, которые успешно использовались для сбора сперматозоидов Дельфин, криоконсервация и гетерологичных эко производительности с помощью бычьего ооцитов.

Аннотация

Использование Дельфин Криоконсервированные сперматозоидов облегчает обмен генетического материала между водных парков и делает доступными для лаборатории для исследования для дальнейшего понимания воспроизводства морских млекопитающих сперматозоидов. Гетерологичных Эко, замена для гомологичных Эко, может служить средством для тестирования фертильности спермы потенциал; Изучение физиологии гамет и раннего развития эмбрионов; и чтобы избежать использования ценных Дельфин ооцитов, которые трудно получить. Здесь мы представляем протоколы, которые были успешно использованы для сбора и криоконсервировать Дельфин сперматозоидов. Коллекция спермы производится ручной стимуляции на подготовленных дельфинов. Криоконсервация осуществляется с помощью медиаприставки трис-желток яйца на основе с глицерином. Кроме того мы представляем протокол, который описывает гетерологичных ЭКО с использованием Дельфин сперматозоидов и говядину ооцитов и что проверяет гибридный характер полученный эмбрион с помощью ПЦР. Гетерологичных оплодотворение поднимает вопросы на оплодотворение и может использоваться в качестве инструмента для изучения физиологии гамет и раннего эмбрионального развития. Кроме того успех гетерологичных эко демонстрирует потенциал этой техники для тестирования Дельфин спермы подкормки потенциала, который заслуживает дальнейшего изучения.

Введение

Вспомогательные репродуктивные технологии слабо развиты в диких животных, включая морских млекопитающих. Отсутствие чувствительных методов оценки спермы подкормка успех способствует медленного развития репродуктивных технологий в таких видов, как дельфин. Он не был до недавнего времени основные параметры семенных афалины (Tursiops truncatus) были сообщил^1,2. Однако такие переменные, как подвижность и морфологии, хотя широко используется, дают ограниченную информацию о репродуктивной эффективности. Лучшим показателем качества спермы является оценка возможностей внесения удобрений.

Недавно наша группа используется метод для оценки Дельфин спермы подкормки потенциал путем оценки мужской pronuclear формирования и/или гибридных формирование эмбриона после гетерологичных ЭКО с использованием zona нетронутыми говядину ооцитов³. Использование Дельфин говядину гетерологичных эко имеет важные преимущества над гомологичных Эко, как он преодолевает трудности получения Дельфин ооцитов и облегчает использование систем испытанный в vitro говядину яйцеклетка созревания. Во избежание видов специфика гетерологичных оплодотворение обычно выполняется в отсутствие ZP. Хотя это позволяет для оценки способности отреагировали Акросома сперматозоидов предохранитель с vitelline мембраной, он повреждает оценки других функций, связанных с оплодотворения. Процедура, описанная использует zona нетронутыми ооцитов и позволяет оценку следующих параметров: спермы zona привязки и привязанности, проникновения, polyspermy, pronuclear формирования и гибридные расщепления эмбрионов.

Здесь мы представляем несколько протоколов для сбора семени, анализ основных спермы, замораживание сперматозоидов, а также оценки Дельфин спермы функциональность путем оценки мужской pronuclear и/или гибридных формирование эмбриона после гетерологичных ЭКО с использованием zona нетронутыми говядину ооцитов.

протокол

этика заявление: все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (МИС). Все эксперименты были проведены в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных, принятые обществом для изучения воспроизводства и Закон о благосостоянии животных за заботу о морских млекопитающих.

1. Дельфин сбора спермы и криоконсервацию

среднего

1. Подготовка
   1. сделать FERT (гепарин - и hypotaurine бесплатно). Подготовка среднего FERT-TALP, дополненный бикарбонат 25 мм, 22 мм натрия лактата, пируват натрия 1 мм, BSA свободных жирных кислот 6-мг/мл и 10 мг/мл гепарина (рН 7,4).
      Примечание: Подготовить это средство в день использования и держать его в 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью для по крайней мере 2 ч перед использованием.
   2. Подготовить трис яичный желток-буфера на основе. Распустить 30.28 г/Л трис, 16,75 г/Л лимонной кислоты, фруктоза 12,5 г/Л и 0,5 г/Л стрептомицина в ультрачистая вода (pH 7,3, осмоляльность = 310 мОсм/кг). Добавить яичный желток 20% (v/v).
2. Поезд проверенные разведения мужской афалины лежат в спинной recumbence у края бассейна для сбора добровольных спермы.
   Примечание: Мужчин дельфин должны быть обучены более 6 месяцев, положительное подкрепление, как описано ранее ⁴.
3. Выполнять различные тактильную стимуляцию, осторожно нажав на черепной области половых паз дельфина добиться добровольного экструзии пениса от половых groove.
4. После достижения полной эрекции, прямые кончик пениса в стерильный контейнер для получения эякулята.
5. Сохранить образец спермы при 37 ° C до анализа. Повторите шаги 1.3 и 1.4 для последовательных эякулята коллекции, используя новое стекло пропилена каждый раз.
6. Сразу же после сбора, определить громкость с помощью градуированный стеклянный цилиндр, ранее прогреты до 37 ° C. Evaluate цвет, рН и осмолярности (с помощью микро осмометре) эякулята.
7. Для оценки концентрации сперматозоидов в эякуляте, добавить 10 мкл суспензии спермы eppendorf тубы 90 мкл дистиллированной воды. Определение концентрации сперматозоидов, с использованием спермы, считая камеры.
   Примечание: В ходе оценки, держите остальная часть эякулята в 37 ° C.
8. Оценки параметров подвижности.
   1. Взять 10 мкл пример спермы и поместить его в камере подогретым спермы.
   2. Оценки подвижности, используя систему анализа спермы, компьютерный, ранее проверены для афалины, объективно оценить подвижности спермы ².
      Примечание: При необходимости разбавляют образца спермы с FERT среднего (гепарин - и hypotaurine бесплатно) для адекватной визуализации сперматозоидов. В ходе оценки, сохранить образец при 37 ° C подогревом микроскопа.
9. Взять 20 мкл пример спермы и оценить жизнеспособность и спермы морфология как описано ⁵.
10. Передача спермы для пластиковых пробирок. Центрифуга для образца спермы в 250 g x 5 мин. После определения концентрации сперматозоидов, с помощью Счетной палаты, отрегулировать концентрация сперматозоидов до 400 x 10 ⁶ сперматозоидов/мл.
    Примечание: При необходимости разбавляют лепешка из концентрированной эякуляции с изолированной семенной плазмы от избыточного объема эякулята же центрифугированием (250 x g, 10 мин).
    1. В течение 5 мин, медленно разбавить сперму образец 1:1 (v/v) с трис яйцо желток буфера на основе содержащего 1,5% глицерина. Место трубка, содержащая спермы подвеска на 5 ° C в течение 1 ч 30 мин
    2. Выполнить второй разбавления спермы подвеска с трис яичный желток основе буфер, содержащий глицерин для получения окончательного глицерин концентрации 3% и конечная концентрация 200 x 10 ⁶ сперматозоидов/мл. Поддерживать спермы подвеска на 5 ° C в течение 10 мин
11. Загрузить подвеска спермы в 0,25 мл соломинки. Выпотрошенного соломинки. Место соломки в стойку 4,5 см выше жидкого азота для 10 минут окунуться соломинки в жидкий азот и хранить до оценки.

2. Гетерологичных In Vitro оплодотворение с помощью Zona нетронутыми говядину ооцитов

1. Подготовка
   1. подготовить окрашивание раствора и монтажа среднего.
      1. Подготовить Hoechst Стоковый раствор путем растворения Hoechst 1 мг в 1 мл дистиллированной воды. Сделать 30 мкл аликвоты и держать их в темноте при температуре-20 ° C до использования. Подготовьте окрашивание раствора путем добавления 25 мкл Hoechst Стоковый раствор 5 мл фосфат амортизированное saline (PBS) дополнены 1 г/Л ПВА. Хорошо перемешать и хранить в темноте при температуре 4 ° C до использования.
      2. Подготовка монтажа среднего, смешивая 6,25 мл PBS с 6.25 мл глицерина и 6,25 мкл Hoechst Стоковый раствор. Хорошо перемешать и хранить в темноте при температуре 4 ° C до использования.
   2. Подготовить среды для сбора и в пробирке оплодотворения ооцитов.
      1. Подготовить физиологический раствор, добавив гентамицина 0,5 мл 0,9% NaCl дистиллированной воды.
      2. Подготовить складе созревания средний, добавив 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 10% плода телячьей сыворотки (FCS) до 10 мл TCM-199. Поддерживать оба СМИ на 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью для по крайней мере 2 ч перед использованием.
2. Собирать яичников на бойню в солевой раствор на 33-35 ° C и транспортировки их в лабораторию в течение 4 ч от коллекции.
3. Раз в лаборатории, мыть яичников три раза для удаления мусора и крови с помощью физиологический раствор, ранее прогреты до 37 ° C. поддерживать яичников в солевой раствор при 37 ° C во время процесса.
10-мл шприцев и
4. фолликулов аспирата 2 до 8 мм с 18G. Собирать без наддува фолликулярной жидкости в 50 мл трубки.
5. Позволяют фолликулярной жидкости, содержащие ооциты стоять около 15 минут при 37 ° C, до клетки отложений. Удалить супернатант трубку с пипетка Пастера и вновь приостановить гранулы в PBS.
6. Восстановить кучевые ооцитов комплексы (КОК) в 90 мм блюда под стереомикроскопом.
7. Мыть Кок три раза в PBS и один раз в среде созревания.
8. Передачи морфологически нормальных Кок блюд 4-хорошо, хорошо содержащих 500 мл среднего созревания, группами по 50 Кок за хорошо.
   Примечание: Здесь, три скважины – одной скважиной для гетерологичных Эко, один элемент управления хорошо для гомологичных ЭКО и один, также содержащие только созрела Кок как элемент партеногенетических – были использованы.
9. Инкубировать Кок для 24 ч составляет 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью.
10. Подготовить среды и градиент плотности.
    1. Подготовить оплодотворение среднего (FERT), дополнение FERT-TALP среде с бикарбонат 25 мм, 22 мм натрия лактата, пируват натрия 1 мм, BSA свободных жирных кислот 6 мг/мл и 10 мг/мл гепарина. Сохранить на 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью для по крайней мере 2 ч перед использованием.
    2. Подготовить градиент плотности, добавив 1 мл раствора градиент средней плотности 15 мл и 3 мл моющего раствора до 15 мл. Поддерживать их на 38,5 ° C для по крайней мере 1 ч.
11. Мыть в vitro созрел ооциты дважды в среде Г.Г.
12. Передавать яйцеклеток блюд 4-хорошо, каждый хорошо содержит 50 Кок в 250 мл Г.Г. Поддерживать 4-ну блюда на 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью при подготовке спермы для оплодотворения.
13. Оттепель замороженных соломы, содержащий Дельфин сперматозоидов в водяной бане при 37 ° C 50 s.
    Примечание: Говядину спермы для гомологичных эко должны обрабатываться параллельно, после стандартный протокол для гомологичных говядину IVF.
14. Взять 10 мкл спермы образца и поместите его в подогретым спермы, считая камеры. Оценка подвижности, используя систему анализа спермы, компьютерный, ранее проверены для видов, чтобы объективно оценить сперматозоидов. В это время, сохранить образец спермы на 38,5 ° C.
15. Добавить спермы в трубку градиента плотности (шаг 2.10.2). Центрифуги для 10 мин на 250 x г.
16. Тщательно удалить супернатант с помощью пипетки Пастера. Добавьте 3 мл моющего раствора в пробирку, содержащую гранулы. Вновь приостановить гранулы, аккуратно смешивая.
17. Центрифуги для 5 мин на 250 x g. удалить супернатант с пипетка Пастера спермы объемом 300 мкл.
18. Добавить 5 мкл спермы подвески к microcentrifuge, содержащих 95 мкл дистиллированной воды. Поддерживать спермы подвеска на 38,5 ° C. Fill подсчета клеток камеры с 10 мкл в 1:20 разбавления спермы и измерения концентрации. Рассчитать количество FERT среды, которые должны быть добавлены к 100 мкл спермы для получения 2 х 10 ⁶ сперматозоидов/мл.
19. Добавить вычисляемый А.ФЕРОМ и спермы тома в 15 мл и осторожно перемешать с помощью пипетки Пастера.
20. Добавить 250 мкл спермы FERT подвески для каждой скважины блюдо 4-хорошо, содержащие FERT средних с созрели яйцеклеток для получения конечной концентрации сперматозоидов/мл, 1 x 10-⁶.
21. Совместного инкубировать гамет для 18 h на 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью.
22. Подготовить питательной среды на основе синтетических oviductal жидкости, дополнена 5% FCS. Подготовка 25 мкл синтетических oviductal жидкости культуры капель в 35-мм блюда с 3 мл минерального масла. Сохранить на 38,5 ° C под атмосферу 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью для по крайней мере 2 ч перед использованием.
23. На 2,5 ч пост совместного инкубации, удалить 20 яйцеклеток из блюдо; сохранить остальные ооциты в инкубаторе на тех же условиях.
    1. Удалить слабо прилагаемый сперматозоидов, энергично закупорить половина яйцеклеток через пипетку Pasteur УЗК родила 10 раз.
    2. Исправить 20 яйцеклеток в 50 мкл глютаральдегид 0,5% для 30 min. мыть яйцеклеток в PBS на 5 мин передачи яйцеклеток для 50-мкл Hoechst окрашивание раствора 15 мин и мыть яйцеклеток в PBS на 5 мин
    3. Яйцеклеток индивидуально передать 2 мкл капельки монтажа среды со скоростью 10 яйцеклеток на слайд. Аккуратно крышка с coverslip и уплотнение с лак.
    4. Количество сперматозоидов, придает говядину ооцитов, с помощью микроскопа фазово контрастной с epifluorescent оптикой и 361 Нм фильтра возбуждения на 40 кратном.
24. После 12 h совместно инкубации, удалить 10 предполагаемого зигот из блюд 4-ну; сохранить оставшиеся предполагаемого зигот в инкубаторе на тех же условиях.
    1. Передачи 10 предполагаемого зигот на центрифугу 15 мл трубки содержащий 2 мл PBS и вихревой мягко в течение 2 мин, чтобы удалить кучевые клетки. Мыть дважды в PBS, исправить и пятно, как описано выше (шаг 2.23.2.)
25. , После 18, 20, 22 и 24 h совместно инкубации, удалите 10 предполагаемого зигот от 4-ну блюда и вихря, исправить и выведение их как описано выше (шаг 2.23.2). Сохранить остальной части предполагаемого зигот в инкубаторе на тех же условиях.
    1. Оценить pronuclear формирования и polyspermy под микроскопом этап контраст/epifluorescent в гомологичных и гетерологичных эко групп путем пятнать с Hoechst.
    2. Оценить pronuclear формирование в 10 случайно выбранных предполагаемого гибрид зигот на сэмпл. Подтвердить pronuclear формирования под конфокальное лазерное сканирование Микроскоп на аргон 488 нм лазер возбуждения и 515 до 530 Нм обнаружения.
    3. Оптически раздел предполагаемого зигот последовательно (2 мм) и собирать изображения с помощью визуализации программного обеспечения. Визуализировать, используя пакет программного обеспечения 3D анализа.
    4. После 24 ч Сопредседатель инкубации, мыть 50 предполагаемого зигот четыре раза в PBS и дважды в среде культуры.
26. Передать их в группы 25 microdroplets питательной среды ранее подготовленных и достижение равновесного уровня.
27. Обслуживание на 38,5 ° C под атмосферу 5% O ₂ / 5% CO ₂ и в воздухе с максимальной влажностью.
28. После 26 и 28 h совместно инкубации, удалите 10 предполагаемого зигот из блюда и вихревые, исправить и выведение их, как описано выше (шаг 2.23.2).
29. После 48 ч культуры, наблюдать расщепление под стереомикроскопом.
30. Удалить вителлинового (ZP), перенос эмбрионов до 5 мг/мл раствора протеазы.
31. Индивидуально мыть каждый эмбрион три раза в PBS. Snap заморозить их в жидком азоте в 0,2 мл пробирок microcentrifuge. Хранить их при температуре-80 ° C до анализа.

3. ПЦР

1. материалы и реагенты
   Примечание: Реагенты, материалы и оборудование, используемое для выполнения протокол PCR, подробно изложены в таблице материалов и включают в себя стойку трубки ПЦР и набор micropipettes (P2, P20, Р200, P1000), 1,5 мл Microcentrifuge трубы, трубы ПЦР и шапки, тепловая велосипедист, УФ осветитель, геля агарозы и буфера (Tris Борат ЭДТА (КЭ)).
   1. Нежно оттепель все реагенты на льду. Поддерживать их во льду на протяжении всего эксперимента. Используйте deoxynucleotides (дНТФ; dATP, дЦТФ, dTTP и dGTP), цель грунтовки на ссылку кодирования гена белка рибосомальной S Дельфин 18 (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG и F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), ДНК-полимеразы, 5 X буфер для ДНК-полимеразы, шаблон ДНК, стерильной воды и хлорида магния (₂ MgCl в конечной концентрации 5,0 мм).
   Подготовка геля и образец
   2. агарозы.
      1. Подготовить Дельфин и бычьего спермы ДНК образцов.
         1. Оттепель замороженных соломы каждого вида в водяной бане при 37 ° C 50 s. Добавить 3 мл моющего раствора. Центрифуга на 250 x g 10 мин удалить супернатант. 30 мкл буфера lysis STES (50 мм трис-HCl, рН 8; 20 мм NaCl; и 0.1% SDS 1 мм), 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и 5 мкл Дитиотреитол (DTT); конечная концентрация: 150 мм. На ночь поддерживать на 55 ° C. добавить 200 мкл ультрачистая вода. Центрифуга на 250 x g 5 мин держать супернатант. Измерение концентрации ДНК, используя спектрофотометр.
      2. Выполняют серийных разведений ДНК от Дельфин сперматозоидов (т.е., 40, 4 и 0,4 нг/мл) с ультрачистая вода для проверки, что условия PCR способны Обнаружение небольшое количество Дельфин ДНК.
      3. Выполнять серийных разведений говядину спермы ДНК (т.е., 4000, 400, 40 и 4 нг/мл) с ультрачистая вода для проверки, что условия PCR способны обнаруживать небольшое количество рогатого ДНК.
      4. Подготовить Дельфин и бычьего эмбрионов. Размораживание эмбрионов на льду. Мкл 8 100 µg/mL протеиназы K и поддерживать на ночь при 55 ° C. Чтобы остановить реакции, поместите образцы на 96 ° C за 5 мин
      5. Подготовить 2% гель агарозы КЭ буфера и 20 мкл пятен нуклеиновой кислоты, с использованием стандартных методик.
   3. Подготовка ПЦР.
      1. Label ПЦР трубки: Дельфин серийных разведений (40, 4 и 0,4 нг/мл), говядину серийных разведений (4000, 400, 40 и 4 нг/мл), гомологичных говядину двухкамерные эмбриона, двухкамерные предполагаемого гетерологичных эмбрионов и отрицательный контроль.
      2. Подготовка мастер смеси в стерильных microcentrifuge 1,5 мл трубку в окончательный объем 25 мкл в реакции.
         1. Добавить 5 мкл 5 X ДНК полимеразы flexi буфера, 0.5 мкл дНТФ (10 мм) 1.5 мкл MgCl ₂ (25 мм), 0.5 мкл прямого и обратного праймера (10 мкм), 1,5 мкл ДНК шаблона (спермы) или 8 мкл ДНК шаблона (два клеток эмбрионов) , 0,07 мкл Taq-полимеразы и стерильной дистиллированной водой до 25 мкл окончательный объем. Хорошо перемешайте.
2. Усилители протокол
   1. место трубы в тепловая велосипедист. Выберите следующую программу: 94 ° C 3 мин; 40 циклов 94 ° C 15 s, 59 ° C 25 s, 72 ° C для 20 s; и 72 ° C для 5 минут запустить программу.
   2. Хранить трубы на 4 ° C. добавить 2,5 мкл загрузки буфера для каждого продукта ПЦР на 4 ° C и нагрузке 15 мкл смеси в скважины 2% агарозном геле. Используйте маркер лестница ДНК для оценки точных размеров ПЦР фрагментов.
   3. Электрофорез выполнять за 15 минут, чтобы позволить ДНК миграции. Визуализируется полос с использованием УФ осветитель.

Результаты

Все результаты, таблицы и цифры (1 и 2), представленные здесь, были воспроизведены с разрешением³.

Дельфин сперматозоидов имеют высокую подвижность после замораживания и оттаивания

Эякуляции ?...

Обсуждение

Для многих различных видов млекопитающих есть разнообразные преимущества использования деконсервированных спермы. К ним относятся возможность передачи ценный генетический материал, потенциал для распространения во всем мире, низкий риск загрязнения и возможность сохранения мужски...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
FERT-TALP medium	Merck
TCM-199	Sigma	M-4530
Hoechst 33342	Sigma	B-2261
4-well dishes	Nunc	176740
Density gradient BoviPure	Nidacon International	BP-100
Washing solution Boviwash	Nidacon International	BW-100
Magnesium chloride	Promega	A35 1H
Sterile water	Mili Q sintesis A10 Millipore	A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA	Sigma	T4415
MB agarose	Biotools	20.012
5X GoTaq flexi buffer	Mili Q sintesis A10 Millipore	M 890 A
MB agarose	Biotools	20.012
Taq polymerase	Promega
SafeView	NBS Biologicals Ltd.	M 890 A
Makler counting chamber	Sefi Medical
Thoma chamber	Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000	Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300	Norwood
Computer assisted sperm analysis system	Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95	Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300	Nikon
Confocal assistant 4.02 software	Bio-Rad	3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy	Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)	Gilson
Microcentrifuge tubes	VWR
UV iluminator	Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus	MWG AG Biotech