병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

요약

여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.

초록

Cryopreserved 돌핀 정 충의 사용 수 중 공원 사이 유전 물질의 교환을 용이 하 게 하 고 정 충은 해양 포유 동물 복제에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 연구 실험실에 액세스할 수 있습니다. 분리 IVF, 동종 IVF에 대 한 대체 잠재적인; 정자 비 옥을 테스트 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 연구 생식 체 생리학 및 초기 배아 발달; 그리고 얻기 어려운 귀중 한 돌고래 oocytes의 사용을 피하기 위해. 여기, 우리는 성공적으로 수집 하 고 돌고래 정 충 cryopreserve 사용 된 프로토콜을 제시. 정액의 컬렉션은 훈련 된 돌고래에 수동 자극에 의해 수행 됩니다. Cryopreservation은 글리세롤과 트리 스 달걀 노른자위 기반 extender를 사용 하 여 수행 됩니다. 또한, 우리는 분리 IVF 돌고래 정 충와 소 oocytes를 사용 하 여 설명 하 고는 PCR를 사용 하 여 결과 배아의 하이브리드 성격을 확인 하는 프로토콜을 제시. 분리 수정 수정에 대 한 질문을 제기 하 고 생식 체 생리학과 초기 배아 발달을 공부 하는 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, 분리 IVF의 성공 테스트 돌고래 정자 비 옥 하 게 용량을 추가 검사의 가치가이 기술의 잠재력을 보여 줍니다.

서문

보조 생식 기술 해양 포유류를 포함 하 여 야생 동물에 가난 하 게 개발 된다. 정자 기름 성공 평가에 중요 한 방법의 부족 느린 돌고래 종에서 생식 기술 개발에 기여 한다. 그것은 아니었다 최근까지 bottlenose 돌고래 (Tursiops truncatus)의 기본 정액 매개 변수 보고^1,2했다. 그러나, 운동 성 및 형태학, 같은 변수 널리 사용 되 고 있지만 생식 효율성에 제한 된 정보 제공. 정자 품질 최고의 지표는 기름 잠재력의 평가.

최근, 우리의 그룹 돌고래 정자 남성 pronuclear 형성 및 zona 그대로 소 oocytes³를 사용 하 여 분리 IVF 후 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 잠재적인 비 옥 평가 메서드를 사용 합니다. 돌고래 소 분리 IVF 사용 하 여 중요 한 이점이 동종 IVF, 돌고래 oocytes를 얻기의 어려움 극복으로 있으며 소 oocyte 성숙 시스템 잘 테스트 체 외에서 사용을 용이 하 게. 종 특이성을 피하려면 분리 수정 ZP의 부재에서 일반적으로 수행 됩니다. Vitelline 막으로 융합 acrosome 반응 정 충의 능력의 평가 대 한 수 있습니다, 하지만 그것은 수정에 관련 된 다른 기능 평가 손상 한다. 설명 하는 절차 zona 그대로 oocytes를 사용 하 고 다음 매개 변수 평가: 정자 zona 바인딩 및 첨부 파일, 침투, polyspermy, pronuclear 형성 및 하이브리드 배아 분열.

여기, 우리가 현재 정자 컬렉션, 기본 정자 분석, 정 충 동결 뿐만 아니라 돌고래 정자 기능 평가 대 한 여러 가지 프로토콜 heterologous 체 외 수정 후 남성 pronuclear 및 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 zona 그대로 사용 하 여 소 oocytes입니다.

프로토콜

윤리 성명: 실험 절차를 모두 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 Instituto Nacional de Investigación y 기술과 Agraria y 섬유 (INIA)의 위원회에 의해 승인 했다. 복제의 연구, 그리고 해양 포유 동물의 배려를 위한 동물 복지 행위는 사회에 의해 채택 모든 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었습니다.

1. 돌고래 정자 수집과 Cryopreservation

1. 준비
   1. 게 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-무료). 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6-mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린 (pH 7.4) 보완 준비.
      참고: 사용 당일이 매체를 준비 하 고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에 5% CO ₂ 분위기 아래 38.5 ° C에서 보관.
   2. 준비 TRIS 계란 노 른 자 기반 버퍼입니다. 30.28 g/L 트리 스, 16.75 g/L 구 연산과 당 12.5 g/L, 그리고 초순에 0.5 g/L 스 분해 (pH 7.3, osmolality = 310 mOsm/kg). 추가 20% 계란 노 른 자 (v/v).
2. 등 recumbence 자발적인 정액 컬렉션에 대 한 수영장의 가장자리 근처에 거짓말을 입증 된 번 식 남성 bottlenose 돌고래 훈련.
   참고: 남성 돌고래 훈련 되어야 6 개월 이상 긍정적인 보강 하 여 앞에서 설명한 ⁴.
3. 부드럽게 성 기 groove에서 남근의 자발적인 압출을 유도 하는 돌고래의 생식 기 홈의 두개골 영역에 누르면 다양 한 촉각 stimulations 수행.
4. 완전 한 발기를 달성 한 후 직접 음 경 끝에 정액을 무 균 용기에.
5. 분석까지 37 ° C에서 정자 샘플을 유지합니다. 1.3 및 1.4 단계를 반복 하 여 때마다 새로운 프로필 렌 유리를 사용 하 여 연속 사정 컬렉션.
6. 즉시 수령 후, 37 ° C. 평가 색, pH, 그리고 osmolarity (를 사용 하 여 마이크로-osmometer)는 정액의 이전 예 열 졸업된 유리 실린더를 사용 하 여 볼륨을 결정.
7. 정액, 정 충의 농도 평가 하는 증류수 90 µ L를 포함 eppendorf 관에 정자 서 스 펜 션의 10 µ L를 추가 합니다. 챔버를 계산 하는 정자를 사용 하 여 정자 농도 결정.
   참고: 평가, 동안 유지는 정액의 나머지 37 ° c.
8. 운동 매개 변수 평가.
   1. 정자 샘플의 10 µ L을 미리 데워 진된 정자 챔버에 배치.
   2. 이전 bottlenose 돌고래에 대 한 유효성을 검사 하는 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 사용 하 여 정자의 운동 성 ²를 객관적으로 평가 하는 운동 성 평가.
      참고: 필요한 경우, 정자의 운동 성의 적절 한 시각화를 위한 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-프리)와 정자 샘플을 희석. 평가, 중 온수 현미경 무대에서 37 ° C에서 샘플 유지.
9. 정자 샘플의 20 µ L 고 평가 하는 앞서 설명한 ⁵ 생존 능력 및 정자 형태.
10. 원심 분리기 튜브에 정자 샘플을 전송. 5 분 동안 250 x g에서 정자 샘플 원심 후 세 챔버를 사용 하 여 정자 농도 결정, 400 x 10 ⁶ 정 충/mL을 정자 농도 조정.
    참고: 필요한 경우 원심 분리 (250 x g, 10 분)에 의해 같은 정액의 초과 볼륨에서 고립 된 정액 플라스마와 집중된 ejaculates에서 펠 릿을 희석.
    1. 5 분 동안 천천히 희석 정액 샘플 1:1 (v/v) 1.5% 글리세롤을 포함 하는 트리 스 계란 노 른 자 기반 버퍼. 1 h 30 분 5 ° C에서 정자 현 탁 액을 포함 하는 튜브를 놓고
    2. 수행은 트리 스와 정자의 서 스 펜 션의 두 번째 희석 달걀 노 른 자 기반 버퍼 3% 최종 글리세롤 농도 및 200 x 10 ⁶ 정자/mL의 최종 농도 글리세롤을 포함. 10 분 5 ° C에서 정자 현 탁 액을 유지
11. 0.25 mL 빨 대에 정자 현 탁 액을 로드. 빨 대 heat-seal 랙 10 분에 대 한 액체 질소 위에서 4.5 cm에에서 빨 대 액체 질소에 빨 대를 빠지게 하 고 평가까지 저장.

2. Heterologous 체 외에서 수정 사용 하 여 구역 그대로 소 Oocytes

1. 준비
   1. 준비는 얼룩이 솔루션 및 장착 매체.
   2. Hoechst의 1 밀리 그램의 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 준비 Hoechst 재고 솔루션
      . 30 µ L aliquots를 확인 하 고 계속 그들은 어둠 속에서-20 ° C에서 사용까지. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1 g/L PVA와 보충의 5 mL에 Hoechst 재고 솔루션의 25 µ L을 추가 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 유지.
      1. 준비 글리세롤의 6.25 mL와 Hoechst 재고 솔루션의 6.25 µ L의 PBS 6.25 mL를 혼합 하 여 설치 미디어. 잘 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 유지.
   3. Oocyte 수집 및 체 외에서 수정에 대 한 매체 준비.
      1. 0.9 %NaCl 증 류 물에 gentamycin의 0.5 mL를 추가 하 여 생리 식 염 수를 준비.
      2. 는 TCM-199의 10 ml 10 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF) 및 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)를 추가 하 여 재고 성숙 매체를 준비 합니다. 38.5 ° c, 5% CO ₂, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기 분위기에서 두 미디어 유지.
2. 33-35 ° C에서 염 분 해결책에 도살에 난소를 수집 하 고 컬렉션에서 4 h 이내 실험실에 그들을 수송.
3. 한번 실험실에서 씻어 난소 세 번 파편을 제거 하 고 이전 37 예 십 분 해결책을 사용 하 여 혈액을 ° C 유지 난소 37 ° C에서 염 과정.
4. 18 g aspirate 2 ~ 8 mm 낭 바늘 그리고 10 mL 주사기. 50 mL 튜브에 aspirated follicular 액체 수집.
5. 셀 앙금까지 37 ° C에서 약 15 분 동안 서 서 oocytes를 포함 하는 소 낭 모양 액체 허용. 파스퇴르 피 펫과 튜브의 상쾌한을 제거 하 고 다시 PBS에 펠 릿을 중단.
6. 90mm 요리는 stereomicroscope 아래에 적 운 oocyte 단지 (COCs)를 복구.
7. PBS에 그리고 한 번 성숙 매체에는 COCs 세 번 세척.
8. 전송 형태학 상으로 정상적인 COCs 4 잘 요리, 각 잘 잘 당 50 COCs의 그룹에서 성숙 매체의 500 mL.
   참고: 여기, 3 우물 – 분리 IVF 동종 IVF, 적합 한 제어, 잘만 포함 한 잘 성숙 parthenogenetic 컨트롤로 COCs – 사용 되었다.
9. 최대 습도 공기에 5% CO ₂의 분위기 아래 38.5 ° C에서 24 h COCs를 품 어.
10. 매체 및 밀도 그라데이션 준비.
11. 수정 매체 (페르) 준비, 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6 mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린을 보충을
    . 5% CO ₂, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지.
    1. 밀도 그라데이션 중간 15 mL 튜브 및 솔루션 15 mL 관을 세척 3 mL의 1 mL을 추가 하 여 밀도 그라디언트를 준비 합니다. 1 헤 적어도 38.5 ° C에서 유지
12. 워시는 체 외에서 성숙 페르 매체에 두 번 oocytes.
13. 4 잘 요리는 oocytes 전송 각 잘 50 COCs 페르의 250 ml 정자의 수정에 대 한 준비 하는 동안 5% CO ₂, 그리고 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 4-잘 요리를 유지.
14. 녹여 냉동된 밀 짚 50 37 ° C에서 물 탕 정 충 돌고래를 포함 미
    참고: 동종 IVF에 대 한 소 정액 동종 소 IVF에 대 한 표준 프로토콜을 따라 병렬로 처리 해야 합니다.
15. 걸릴 10 µ L 정자의 샘플 및 챔버 세 미리 데워 진된 정자에. 운동 성 정자 운동 성을 객관적으로 평가를 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 이전, 종족에 대 한 유효성 검사를 사용 하 여 평가 합니다. 이 시간 동안 유지 38.5에 정자 샘플 ° c.
16. 밀도 그라데이션 튜브 (2.10.2 단계)에 정자 샘플을 추가합니다. 250 x g.에서 10 분 원심 분리기
17. 신중 하 게 상쾌한 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다. 펠 릿을 포함 하는 튜브를 세척 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 다시 부드럽게 혼합 하 여 펠 릿을 중단.
18. 250 x g.에서 5 분 동안 원심 분리기 제거 300 µ L의 정자 볼륨을 파스퇴르 피 펫과 상쾌한.
19. 증류수의 95 µ L을 포함 하는 microcentrifuge에 정자 서 스 펜 션의 추가 5 µ L. 38.5에 정자 현 탁 액을 유지 ° C. 채우기 셀 계산 1시 20분의 10 µ L와 챔버 정자 희석 및 측정 농도. 2 x 10 ⁶ 정 충/mL를 정자의 100 µ L에 추가 되어야 합니다 페르 매체의 양을 계산.
20. 15 mL 튜브에 계산된 페르와 정자 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 혼합.
21. 1 x 10 ⁶ 정 충/mL의 최종 농도 성숙된 oocytes와 페르 매체를 포함 하는 4-잘 접시의 각 음에 정자-페르 정지의 추가 250 µ L.
22. 공동 5% CO ₂, 그리고 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에 18 h gametes를 품 어.
23. 5 %fcs 보충 합성 oviductal 액체에 따라 문화 매체를 준비 합니다. 35 mm 요리 3 mL의 미네랄 오일으로 덮여 합성 oviductal 액체 문화 방울의 25 µ L를 준비 합니다. 5% CO ₂, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지.
24. 2.5 h 게시물 공동 보육에서 20 oocytes 접시에서 제거; 동일한 조건 하에서 인큐베이터에서 나머지 oocytes 유지.
    1. 적극적으로 좁은 구멍 파스퇴르 피 펫을 통해 oocytes의 10 배를 pipetting으로 느슨하게 연결 된 정 충을 제거.
    2. 15 분 동안 Hoechst 얼룩 솔루션의 50 µ L에 oocytes 50 µ L 30 분 5 분에 대 한 PBS에 oocytes 전송 세척에 대 한 0.5%도에서 20 oocytes를 해결 하 고 5 분에 대 한 PBS에 oocytes를 세척
    3. 는 슬라이드 당 10 oocytes의 속도로 설치 매체의 2 µ L 방울을 개별적으로 oocytes를 전송. 부드럽게는 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.
    4. Epifluorescent 광학과 40 x 확대 361 nm 여기 필터 단계 대조 현미경을 사용 하 여 소 oocytes에 연결 하는 정 충의 수를 계산 하.
25. 후 공동 보육의 12 h 10 추정 zygotes 4-잘 접시에서 제거; 동일한 조건 하에서 인큐베이터에서 나머지 추정 zygotes 유지. 15 mL 원심 분리기에
    1. 전송 10 추정 zygotes 튜브 포함 2 mL PBS와 2 분 동안 부드럽게 소용돌이 적 운 세포를 제거 하. 워시 두 번 PBS, 수정, 및 얼룩, 앞에서 설명한 (단계 2.23.2.)
26. 18, 20, 22, 및 공동 보육의 24 h 10을 제거 후 4-잘 요리와 소용돌이에서 추정 zygotes 수정, 그리고 그들 앞에서 설명한 (단계 2.23.2) 얼룩. 동일한 조건 하에서 인큐베이터에서 추정 zygotes의 나머지를 유지.
    1. Hoechst와 얼룩에 의해 pronuclear 형성 및 polyspermy 모두 동종 및 분리 IVF 그룹에서 단계-대비/epifluorescent 현미경 평가.
    2. 샘플 당 10 무작위로 선택한 추정 하이브리드 zygotes pronuclear 형성 평가. 공초점 레이저 현미경 488 nm 아르곤 레이저 여기에서 검색과 515에서 530 nm 탐지에서 pronuclear 형성 확인.
    3. 광학 추정 zygotes 순차적으로 섹션 (2mm) 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고. 3D 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 시각화.
    4. 공동 보육의 24 h 후 씻고 50 추정 zygotes 4 회 PBS에 문화 매체에 두 번.
27. 이전 준비 및 equilibrated 문화 매체의 microdroplets에 25의 그룹에서 그들을 전송.
28. 5% / 5% O ₂의 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지 CO ₂ 및 최대 습도 공기.
29. 후 26 고 공동 보육의 28 h 10 추정 zygotes 요리와 소용돌이, 수정, 제거 하 고 얼룩, 앞에서 설명한 (단계 2.23.2).
30. 문화의 48 h 후 관찰 한 stereomicroscope 아래 분열.
31. 5 mg/mL protease 솔루션에 배아를 전송 하 여 zona pellucida (ZP) 제거.
32. 는 개별적으로 씻어 각 배아 세 번 PBS에. 스냅-동결 그들 0.2 mL microcentrifuge 튜브에 액체 질소. 분석까지-80 ° C에 저장.

3. PCR

1. 재료 및 시 약
   참고: PCR 프로토콜을 수행 하는 데 사용 하는 장비, 재료, 시 약 재료의 테이블에 자세히 나와 있습니다 및 PCR 튜브 랙 및 micropipettes (P2, P20, P200, P1000) 집합이 포함 1.5 mL microcentrifuge 튜브, PCR 튜브 및 cap, 열 cycler는 자외선 조명 기, agarose 젤, 고 버퍼 (Tris Borate EDTA (TBE)).
   1. 부드럽게 녹여 얼음에 모든 시 약. 실험을 통해 얼음에 그들을 유지 합니다. Deoxynucleotides를 사용 하 여 (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP), 돌고래 18 S ribosomal 단백질 (DQ404537.1);에 대 한 참조 유전자 코딩에 뇌관을 대상 R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG 및 f 2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA 중 합 효소, DNA 중 합 효소, DNA 템플릿, 메 마른 물 및 염화 마그네슘 (MgCl ₂ 5.0 m m의 최종 농도에) 5 X 버퍼.
   2. Agarose 젤과 샘플 준비입니다.
      1. 준비 돌고래와 소 정자 DNA 샘플.
         1. Thaw 37 ° C에서 물 욕조에 각 종족의 언된 빨 대 50 미 세척 솔루션 3 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 250 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 제거 합니다. 30 µ L의 STES 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8; 20 m m NaCl; 그리고 1 mM 0.1 %SDS), 추가 2 µ L의 성분 K (20 mg/mL), 및 dithiothreitol (DTT);의 5 µ L 최종 농도: 150 mM. 초순의 55 ° C. 추가 200 µ L에서 하룻밤 유지 합니다. 5 분에 대 한 250 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 유지. 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정.
      2. 초순 PCR 조건 수 확인으로 돌고래 정 충 (즉, 40, 4, 및 0.4 ng/mL)에서 DNA의 직렬 희석을 수행 적은 양의 돌고래 DNA 검출.
      3. 초순 PCR 조건 소 DNA의 작은 금액을 감지 할 수 있다 확인 하와 소 정자 DNA (즉, 4000, 400, 40, 및 4 ng/mL)의 직렬 희석 수행.
      4. 는 돌고래와 소 배아를 준비합니다. 배아를 얼음에 녹여 100 µ g/mL 가수분해 K의 8 µ L을 추가 하 고 밤새 55 ° c.에 유지 반응을 중지 하려면 96 ° c 5 분에 대 한 샘플 배치
      5. 2 %agarose 젤 TBE 버퍼를 준비 하 고 추가 하는 표준 기술을 사용 하 여 핵 산 얼룩의 20 µ L.
   3. PCR 준비.
      1. 레이블 PCR tube(s): 돌고래 직렬 희석 (40, 4, 및 0.4 ng/mL), 소 직렬 희석 (4000, 400, 40, 및 4 ng/mL), 동종 소 냉동 배아, 2 셀 추정 heterologous 배아, 그리고 부정적인 제어.
      2. 반응 당 25 µ L의 최종 볼륨을 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 마스터 섞어를 준비합니다.
      3. 5 X DNA 중 합 효소 flexi 버퍼, (10mm) 1.5 dNTPs의 0.5 µ L의 추가 5 µ L
         µ L MgCl ₂ (25 m m), 앞으로 역 뇌관 (10 µ M), DNA 템플렛 (정자)의 1.5 µ L 또는 DNA 템플렛 (냉동 배아)의 8 µ L의 0.5 µ L의 0.07 µ L Taq 중 합 효소, 및 살 균 증류수 25 µ L 최종 볼륨까지. 잘 믹스.
2. 증폭 프로토콜
   1. 열 cycler에 튜브를 놓습니다. 다음 프로그램을 선택: 3 분;에 대 한 94 ° C 15 94 ° C의 40 주기 s, 59 ° C 25에 대 한 s, 20 72 ° C s; 그리고 프로그램 시작 5 분을 위한 72 ° C.
   2. 2 %agarose 젤의 우물에 혼합물의 4 ° C와 부하 15 µ L에서 각 PCR 제품에 버퍼를 로드의 4 ° C. 추가 2.5 µ L에서 튜브를 저장 합니다. DNA 사다리 마커를 사용 하 여 PCR 파편의 정확한 크기 추정.
   3. DNA 마이그레이션 수 있도록 15 분에 대 한 수행 법. 밴드는 자외선 조명 기를 사용 하 여 시각.

결과

모든 결과, 표 및 그림 (1 및 2) 여기에 제시 된 권한³으로 재현 했다.

돌핀 정 충 중지 및 재개 후 높은 운동 성을

냉동-해 동 돌고래 ejaculates 84.5 ± 5.3 총 운동 및 69.1 ± 5.1 진보적인 운동 정 충의 백분율 (% ± SD) 보여주었다. 운동 성 측면에서이 숫자는 높은-품질 cryopres...

토론

많은 다른 포유류 종에 대 한 동결-해 동 정자를 사용 하 여 다양 한 장점이 있다. 이 귀중 한 유전 물질, 전세계 유통에 대 한 가능성, 오염, 낮은 위험 그리고 수십 년 동안 남성 gametes를 보존 하는 기능을 전송 하는 기능을 포함 합니다. Cryopreserved의 사용이이 종 부록 II의 인용, 전송 및 다른 수 중 공원 사이 동물의 교류를 제한 하는 보호 때문에 bottlenose 돌고래에 대 한 필수적입니다. 돌고래 수송 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
FERT-TALP medium	Merck
TCM-199	Sigma	M-4530
Hoechst 33342	Sigma	B-2261
4-well dishes	Nunc	176740
Density gradient BoviPure	Nidacon International	BP-100
Washing solution Boviwash	Nidacon International	BW-100
Magnesium chloride	Promega	A35 1H
Sterile water	Mili Q sintesis A10 Millipore	A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA	Sigma	T4415
MB agarose	Biotools	20.012
5X GoTaq flexi buffer	Mili Q sintesis A10 Millipore	M 890 A
MB agarose	Biotools	20.012
Taq polymerase	Promega
SafeView	NBS Biologicals Ltd.	M 890 A
Makler counting chamber	Sefi Medical
Thoma chamber	Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000	Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300	Norwood
Computer assisted sperm analysis system	Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95	Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300	Nikon
Confocal assistant 4.02 software	Bio-Rad	3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy	Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)	Gilson
Microcentrifuge tubes	VWR
UV iluminator	Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus	MWG AG Biotech