细胞内染色和流式细胞仪识别鼠主动脉，肾脏和淋巴结内淋巴细胞亚群的高血压模型

摘要

本文提供了详细的方法来识别和量化细胞内染色鼠肾，主动脉和淋巴结中存在功能性T淋巴细胞亚群和流式细胞仪。被选中的血管紧张素II诱导高血压模型来解释，一步一步的程序和流式细胞仪的基本原则和细胞内染色。

摘要

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases^1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension⁶. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention^1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

引言

最近的证据表明，适应性免疫系统，特别是T淋巴细胞，在几个心血管疾病^1,2,3,4,5的发展中发挥了关键作用。例如，在血管紧张肽II引起的高血压模型中，T细胞在血管和小鼠的肾脏的累积已经描述^6。血管积累主要是在外膜和血管周围的脂肪。在肾脏中，T细胞堆积在髓质和肾皮质两者。取决于哪个子集参与，这些T细胞产生不同的细胞因子，可以影响血管和肾功能，并导致病理的发展（由麦克马斯特等 ⁶中综述）。

CD4 ⁺ T辅助淋巴细胞可分为几个子集:根据其职能和签名CYTO T辅助1（Th1细胞），Th2细胞，TH9，Th17细胞，TH22，调节性T（Treg细胞）细胞和T滤泡辅助（Tfh发挥细胞）基恩斯^7。同样，CD8 ⁺细胞毒性T细胞可以被分类为TC1，TC2，TC17或TC9 ^8。也有（不表达的CD4或CD8 T细胞的标志物即细胞）双阴性T细胞。这些细胞的一个子集具有一个备用的γδT细胞受体（而不是经典α和β受体），因此，被称为的γδT细胞。通过表面标记，细胞因子和转录因子的流式细胞仪的多参数分析构成，以确定这些细胞中的最好的方法。虽然这种方法是在免疫学领域广泛使用，这是不那么在实体器官和在心血管疾病的设置说明。

从历史上看，在组织中的淋巴细胞的识别仅限于免疫组化或RT-PCR的方法。虽然免疫组织化学和免疫功能强大的方法来确定一个int抗原的组织分布erest，他们是不足以表型鉴定所涉及的子集。此外，虽然RT-PCR分析是检测抗原，细胞因子或转录因子的mRNA表达是有用的，它不允许在单个细胞水平同时多种蛋白质的检测。

流的出现术，特别是当与细胞内染色组合以检测细胞因子和转录因子，提供了强大的技术，其允许鉴定和定量在固体器官的免疫细胞亚群的单个细胞水平的调查。我们已经优化了细胞内染色法，流式细胞仪鼠肾，主动脉和主动脉淋巴结内出现在血管紧张素II诱发的高血压模型中的主要T细胞亚群鉴别。在一个高度重新组织消化， 离体活化，透化，并且表面和细胞内染色结果:每一步的优化可生产测定可应用于其他心血管和肾脏疾病模型。

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研究方案

范德比尔特大学的机构动物护理和使用委员会已批准本文所述的程序。小鼠被收容并按照指南实验动物的护理和使用照顾（美国国家科学院出版社2010年修订）。

1.主动脉淋巴结，肾和主动脉的小鼠隔离

1. 安乐死的CO ₂吸入老鼠。喷用70％乙醇的胸部和小心地打开皮肤和胸壁用剪刀以暴露心脏。
2. 灌注脉管，在右心房执行一个小切口，并稳定地注入至少10毫升冷的PBS（约1毫升/秒）的成使用21或23政针左心室的心尖。灌注，直到所有机关烫一下。的心脏第一次Blanches的。肝脏热烫表明灌注已经很好完成。
3. 用小镊子和剪刀精，轻轻切开，拉出肠子，胃，脾，胰腺和肝脏，以更好地可视化的主动脉。
   注意:此步骤必须非常精确地完成作为破坏胃肠道可诱发污染。
4. 切出来，删除每个肺用剪刀。冲洗使用无针注射器用磷酸缓冲盐水（PBS）的胸腔。用无菌纱布去除多余的血液和液体。
5. 取出用细镊子解剖腹主动脉淋巴结。确保不破裂胶囊。与解剖镊每个淋巴结的表面上除去剩余的脂肪。切出两肾细剪刀。
6. 解剖整个主动脉（胸，腹主动脉）有细，剪子弯。开始在心脏的电平，并仔细解剖从食道和椎骨向下至髂分叉确保保持附着到主动脉周围血管周围脂肪的水平距离。
   注:主动脉进一步解剖以圣雷莫已经周围结构可以在显微镜下进行。具体而言，除去动脉分支（颈动脉，锁骨下动脉，腹腔干，肠系膜和肾动脉）和淋巴结。别保持的左右各主动脉血管周围脂肪一致层，因为这是在许多炎性细胞驻留在高血压的设置的部位。将含冷PBS分离的管各组织。

2.从生成每个组织单细胞悬浮液

1. 肾
   注:肾脏可以通过结合机械解离加酶消化来解离成单细胞悬浮液。
   1. 通过加入胶原酶D（2毫克/毫升）和DNA酶I（100微克/毫升），以RPMI1640培养基（补充有5％胎牛血清（FBS））制备肾消化溶液。每个准备样品肾脏10毫升
   2. 使用镊子将两个肾脏转移到装有10ml肾消化解离管离子溶液。
   3. 执行根据制造商的说明使用半自动化的离解器装置中的机械解离。
   4. 机械解离后，分离从设备管并执行酶促消化。孵育样品在37ºC下连续旋转20分钟。通过添加补充有5％FBS的冷的RPMI 1640培养基立即停止酶促消化。
   5. 通过移液将溶液转移到50毫升锥形管通过40微米的过滤器过滤之后。通过用1ml注射器的活塞加压分开逗剩余组织。沉淀细胞（500 XG，8分钟，4℃）。
   6. 重悬沉淀于3ml 36％的密度梯度离心介质。转移悬浮液到15毫升锥形管中。轻轻加3毫升72％的密度梯度离心介质的3ml的36％的细胞悬浮液的下方而没有任何中断。离心机（1000 XG不带刹车，20分钟，4℃）。
   7. 免疫细胞将位于界面。删除含有细胞碎片最上面的黄色的层，然后把音量使用冷PBS15毫升。摇匀击穿梯度。旋细胞（300 XG，8分钟，4℃），重悬沉淀在3毫升的RPMI有5％FBS。指望使用台盼蓝排除血球活细胞的数量。
2. 主动脉
   1. 通过加入胶原酶A（1毫克/毫升），胶原酶B（1毫克/毫升）制备主动脉消化溶液中，DNA酶I（100微克/毫升），以RPMI1640培养基（补充有5％FBS）中。
   2. 用细镊子，转移到主动脉含1毫升主动脉消解液2毫升管。切碎整个主动脉成小片，在1ml的消解液精剪。置于冰上。孵育样品为下连续旋转，在37℃30分钟。
   3. 该解决方案转移到组织培养皿和停止enzyma通过加入冷的RPMI 5倍体积有5％FBS抽动消化。
   4. 通过移液将溶液转移到50毫升锥形管通过40微米的过滤器过滤之后。通过用1ml注射器的活塞加压分开逗剩余组织成一个单一的细胞悬浮液。冲洗过滤器和颗粒细胞（300 XG，8分钟，4℃）。
   5. 通过加入10ml的RPMI有5％FBS洗涤沉淀。旋细胞（300 XG，8分钟，4℃），重悬沉淀在3毫升的RPMI有5％FBS。指望使用台盼蓝排除血球活细胞的数量。
3. 主动脉淋巴结
   1. 放置一个40μm的过滤器在组织培养皿（60毫米×15毫米）。放置在过滤器的淋巴结和通过用1ml注射器的活塞加压分开逗他们成单细胞悬浮液。冲洗用2ml的RPMI有5％FBS的过滤器。收集在盘中的细胞。
   2. 转让将细胞入15ml falcon管和沉淀细胞（300 XG，8分钟，4℃）。重悬在500微升的RPMI有5％FBS的颗粒。指望使用台盼蓝排除血球活细胞的数量。

3. 离体刺激细胞因子流式细胞仪检测

1. 制备细胞培养基:RPMI有5％FBS，非必需氨基酸为0.1mM，50μMβ巯基乙醇和1％青霉素/链霉素。
2. 离心机从肾脏，主动脉和淋巴结获得的每个细胞悬液（300 XG，8分钟，4℃）。以每毫升1×10 ⁶个细胞的浓度重悬在细胞培养基每个粒料。
3. 通过加入2微升细胞活化鸡尾酒（含有佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA），钙离子载体离子霉素，和高尔基抑制剂布雷菲德菌素A）的每1 ml细胞培养物刺激细胞。
   注:终浓度各组分的s为:的PMA 81纳米，用PMA 1.33μM离子霉素和5微克/毫升布雷菲德菌素A.治疗和离子霉素激活细胞产生的细胞因子。细胞因子分泌，必须截留在细胞中检测到的蛋白质。布雷菲德菌素一个使正常分泌的蛋白质的内质网和高尔基体的积累。因此，这里所描述的技术可增强细胞因子产生的淋巴细胞通过流式细胞术可检测性。
4. 板1〜2百万细胞在12孔（主动脉或肾）或24孔（淋巴结）的低粘附板。放置板在37℃增湿_的 CO ₂培养箱中培养3小时。
   注:铺板的细胞的数目可以是在淋巴结下从对照小鼠。此外，刺激的时间必须为每个细胞群和细胞因子研究根据经验确定。在从主动脉，肾或淋巴结中分离的T细胞的情况下，我们建议刺激3〜4小时。较长的刺激W¯¯生病不增加细胞因子的分泌，并会诱发多种T细胞表面标志CD3一样，CD4和CD8进一步下调。 （请注意，即使3-4小时的刺激会诱发这些标记的一些下调。）

4.表面染色

1. 转移细胞进入聚苯乙烯FACS管和离心机（300 XG，8分钟，4℃）。用FACS缓冲液洗涤细胞两次（ ^钙和镁⁺含4％FBS和2mM的EDTA的自由PBS中），并等分细胞悬浮液成根据所需抗体的面板的数目和所需的控制管的数目不同FACS管（见下文）。
2. 要执行每个小组的补偿，未染色准备对照管和单管染色每个组织类型和抗体的面板。此外，通过将所有，但抗体之一制备用于各抗体面板荧光减一（FMO）对照管。
3. 调整各管的体积至2ml用FACS缓冲。离心细胞悬浮液（300 XG，8分钟，4℃），通过孵育细胞与抗CD16 / CD32抗体的0.5微克除去上清液和块Fc受体每百万个细胞，在冰上10分钟。
   注:CD16是低亲和力的IgG Fc受体III（FCR III）和CD32是Fc受体II。 CD16 / CD32是在粒细胞，肥大细胞，单核细胞/巨噬细胞，自然杀伤细胞，B细胞，树突状细胞和某些活化成熟T细胞中表达。
4. 执行生存力染色:在1000微升1×PBS中的用1×PBS，离心（300 XG，8分钟，4℃），重悬洗涤细胞。加入1微升细胞透性胺活性染料（染色的可行性）的。孵育在4℃下15分钟，避光。
5. 在温育后，在FACS缓冲液的适当体积制备抗体（用于表面染色）的鸡尾酒。用1-2毫升FACS缓冲液洗涤细胞两次，离心（300 XG，8分钟，4℃）并重新悬浮用100μl每个粒料的抗体混合物。孵育在4℃下30分钟，避光。
   注:对于每一个流式细胞术抗体，它是有用的，以确定抗体的通过进行剂量滴定曲线所需的最佳量。
6. 用2ml FACS缓冲液洗涤细胞两次，并沉淀细胞（300 XG，8分钟，4℃）。

5.固定，通透性和细胞内染色

1. 执行与通过按照制造商的说明，含有合适的缓冲液的固定和透化试剂盒中的细胞内染色。固定并通过在适当的缓冲液中重悬浮这些透化细胞。孵育的样品在4℃下40分钟，避光。
2. 加入1 ml 1X通透性和洗直接缓冲到固定和通透的细胞。离心机（500 XG，8分钟，4℃），去除上清。悬浮颗粒用2毫升1X洗涤缓冲液。
3. 制备antib的混合物odies（仅用于细胞内染色）在1×洗涤缓冲液（每管通常为100微升）的一个适当的量。
   注:如上所述，最佳抗体浓度需要在面板中的每个抗体来确定。例如，对于抗体与IL-17A或IL-17F，我们使用的1:30的稀释因子，但对于抗体IFNγ和T-bet的，我们使用的1稀释因子:100。
4. 离心将细胞（500 XG，8分钟，4℃）并重新悬浮用100μl的抗体混合物的各粒料。孵育在4℃下40分钟，避光。
5. 用2ml 1×洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并沉淀细胞（500 XG，8分钟，4℃）。悬浮颗粒用300μl1X洗涤缓冲和流量与适当的过滤器分析仪。
6. 对于每个组织样品的细胞的总数的定量，使用计数珠。之前获取，添加计数珠每个管的推荐的体积/数。

6.补偿，门控，规范化和技巧

1. 补偿和浇口
   1. 补偿运行未染色和单染色控制管，以调整光谱重叠。
      注意:使用的补偿珠而不是基于细胞的补偿控制是必要的情况下，样品中的兴趣或细胞群的抗原存在在如此低的水平，使用的细胞将是困难的补偿。还值得注意的，使用串联染料时，最好因为串联染料变化很大到大量和与每个天以制备用于每个实验补偿。
   2. 开始一个新的多色实验运行时，荧光减去面板所有的荧光团人控制（FMOs）。
      注:FMO控件是包含所有在面板除了一个抗体的样品。这些控件允许阳性与阴性信号进行精确判别为省略抗体正常adjust为门。这些控制时的表达水平低，或者当目标人群的分离是不良（例如，当目标是细胞因子或转录因子）特别重要。虽然并不总是必要的，在某些情况下，同种型对照可代替优选的FMO控制，因为它们提供了抗体同种型和荧光团共轭无抗原的特异性适当的补偿。
   3. 设置主门:调整前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）的电压，以检测白细胞人口。
   4. 排除死细胞。
      注:活力染色与存在于表面和细胞内部上都游离胺反应。在对比活细胞，死细胞（受损的膜）允许染料进入细胞质，增加蛋白标记的量。因此，死细胞会比活细胞可方便的歧视亮。门上的活细胞。
      注意:从主动脉和肾细胞悬浮液的存活率可能比从淋巴结细胞悬浮液的生存能力降低由于额外的消化步骤。
   5. 绘图前向散射面积（FSC-A）[Y轴]和前向散射高度（FSC-H）x轴。汗衫出现在这个点图对角线。门上的这个角排除双峰。然后绘制SSC-A [Y轴]和CD45 [x轴。
   6. 该CD45 ⁺白细胞群容易识别。门上的这部分人口。随后群可以从这个人口被识别。
2. 细胞计数正常化
   1. 算珠具有导致低FSC和高的SSC特性。例如，如果50000珠加入到300微升的单细胞悬浮液中，出于任何绝对数量的计算公式得到的细胞类型每管如下:
      细胞数p器管=（由流动计数仪珠50,000 /数）计数的细胞的x个。
      利用该计算，能够确定每管任何给定细胞类型的绝对数量。根据多少管从每个器官生成，可以计算每个器官的细胞的数目。
      注意:保持所有细胞和试剂在4℃的协议中。避免剧烈涡旋，因为它可以破坏细胞。使用最少的力量以沉淀细胞。避免在FACS管，因为它可以沉淀的细胞死亡使得泡沫。不要让小球在任何时候干出来的。

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结果

协议中所述的许可表面和细胞内标志物，从小鼠肾脏，主动脉及主动脉淋巴结在血管紧张素Ⅱ引起的高血压模型中分离的T细胞识别。代表性的结果介绍如下。

图1显示了用于从WT小鼠与血管紧张素II输注以诱导高血压的主动脉制得的单细胞悬液，以确定T细胞群体的门控策略。类似的策略在肾脏和淋巴结中。的前向?...

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讨论

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue⁹. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	ROCHE	11088882001
Collagenase A	ROCHE	10103586001
Collagenase B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1x Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
DPBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A)	Biolegend	423303
anti-CD16/32	eBioscience	14-0161-81	dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
Transcription factor buffer set	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)	BioLegend	100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8)	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (clone 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)	BioLegend	644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2)	BD Biosciences	557724