La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

Resumen

Este artículo proporciona una metodología detallada para identificar y cuantificar los subconjuntos de linfocitos T funcionales presentes dentro de riñón murino, la aorta y los ganglios linfáticos mediante tinción intracelular y citometría de flujo. El modelo de hipertensión inducida por angiotensina II fue elegido para explicar, paso a paso, los procedimientos y los principios fundamentales de la citometría de flujo y tinción intracelular.

Resumen

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases^1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension⁶. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention^1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Introducción

La evidencia reciente demuestra que el sistema inmune adaptativo, en particular los linfocitos T, juegan un papel crítico en el desarrollo de varias enfermedades cardiovasculares ^1,2,3,4,5. Por ejemplo, en el modelo de la hipertensión inducida por la angiotensina II, una acumulación de células T en los vasos y los riñones de ratones se ha descrito ^6. La acumulación vascular es predominantemente en la adventicia y la grasa perivascular. En el riñón, las células T se acumulan tanto en la médula y la corteza renal. Dependiendo de qué subconjunto está involucrado, estas células T dan lugar a diferentes citoquinas que pueden afectar la función vascular y renal y conducir al desarrollo de la patología (revisado por McMaster et al. ^6).

Los linfocitos T auxiliares CD4 ⁺ se pueden dividir en varios subconjuntos: las células T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, las células T reguladoras (Treg), y T helper folicular (TFH) en base a sus funciones y cito firmakines ^7. Del mismo modo, las células CD8 ⁺ T citotóxicos se pueden clasificar como Tc1, Tc2, TC17 o TC9 ^8. También hay células T negativas dobles (es decir, células que no expresan el CD4 o CD8 marcadores de células T). Un subconjunto de estas células poseen una gamma delta del receptor de células T alternativa (en lugar de los receptores alfa y beta clásicas) y por lo tanto se conocen como células T gamma delta. El análisis de múltiples parámetros mediante citometría de flujo de marcador de superficie, citoquinas y factores de transcripción constituye el mejor enfoque para identificar estas células. Aunque este método se usa ampliamente en el campo de la inmunología, es menos bien descrito en órganos sólidos y en el contexto de las enfermedades cardiovasculares.

Históricamente, la identificación de los linfocitos en los tejidos se limitó a inmunohistoquímica o enfoques de RT-PCR. Aunque inmunohistoquímica e inmunofluorescencia son poderosos métodos para determinar la distribución tisular de un antígeno de interest, son inadecuados para identificar fenotípicamente los subconjuntos implicados. Además, mientras que el análisis RT-PCR es útil para detectar la expresión de ARNm de antígenos, citoquinas o factores de transcripción, que no permite la detección de múltiples proteínas simultáneamente a nivel de células individuales.

El advenimiento de la citometría de flujo, especialmente cuando se combina con la tinción intracelular para detectar citoquinas y factores de transcripción, proporciona a los investigadores con una técnica poderosa que permite la identificación y cuantificación en el nivel de células individuales de subconjuntos de células inmunes en órganos sólidos. Hemos optimizado un ensayo de tinción intracelular para identificar mediante citometría de flujo las principales subconjuntos de células T presentes dentro de riñón murino, aorta y aorta ganglios linfáticos de drenaje en un modelo de hipertensión inducida por la angiotensina II. La optimización de cada etapa: la digestión de tejidos, la activación ex vivo, la permeabilización, y la superficie y resultados de la tinción intracelular en una altamente reensayo producible que se puede aplicar a otros modelos de enfermedades cardiovasculares y renales.

Protocolo

Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Vanderbilt ha aprobado los procedimientos descritos en el presente documento. Los ratones se encierran y se cuidan de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academies Press. Revisada en 2010).

1. Aislamiento del Drenaje aórtica ganglios linfáticos, riñón y aorta de los ratones

1. La eutanasia a los ratones mediante inhalación de _CO2. Pulverizar el pecho con un 70% de etanol y abrir con cuidado la piel y la pared torácica con unas tijeras para exponer el corazón.
2. Para la perfusión de la vasculatura, realizar una pequeña incisión en la aurícula derecha e inyectar de manera constante al menos 10 ml de PBS frío (aproximadamente 1 ml / seg) en el vértice del ventrículo izquierdo usando una aguja de 21 o 23 G. Perfundir hasta que todos los órganos han blanqueado. El corazón se blanquea en primer lugar. El blanqueo del hígado indica que la perfusión ha sido bien realizado.
3. El uso de pequeñas pinzas y tijeras finas, con suavidad cortar y sacar los intestinos,estómago, el bazo, el páncreas y el hígado para visualizar mejor la aorta.
   NOTA: Este paso tiene que ser hecho con mucha precisión como daños en el tracto gastrointestinal puede inducir la contaminación.
4. Cortar y retirar cada pulmón con unas tijeras. Enjuague la cavidad torácica con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa sin aguja. Eliminar el exceso de sangre y el líquido con una gasa estéril.
5. Extraer los ganglios linfáticos que drenan la aorta abdominal utilizando unas pinzas de disección finas. Asegúrese de no romper la cápsula. Eliminar la grasa que queda en la superficie de cada uno de los ganglios linfáticos con el fórceps de disección. Cortar los dos riñones con unas tijeras finas.
6. Diseccionar toda la aorta (aorta torácica y abdominal) con finas, tijeras curvas. Comenzar a nivel del corazón y diseccionar cuidadosamente lejos del esófago y las vértebras hasta el nivel de la bifurcación ilíaca asegurándose de mantener la grasa perivascular que rodea unido a la aorta.
   NOTA: Además la disección de la aorta a remocinco estructuras circundantes se pueden hacer con un microscopio. En concreto, eliminar las ramas arteriales (arterias carótidas, las arterias subclavias, celiaco, mesentéricas, renales y las arterias) y los ganglios linfáticos. Mantenga una capa consistente de la grasa perivascular alrededor de cada aorta ya que este es un sitio donde muchas células inflamatorias residen en el entorno de la hipertensión. Coloque cada tejido en tubos separados que contienen PBS frío.

2. Generación de suspensiones de células individuales de cada tejido

1. Los riñones
   NOTA: El riñón puede disociarse en una única suspensión de células mediante la combinación de disociación mecánica además de la digestión enzimática.
   1. Preparar la solución de digestión de riñón mediante la adición de colagenasa D (2 mg / ml) y ADNasa I (100 mg / ml) a RPMI 1640 (suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS)). Preparar 10 ml por muestra de riñón.
   2. El uso de fórceps para transferir los dos riñones en un tubo de disociación que contiene 10 ml de riñón digerirsolución de iones.
   3. Realizar la disociación mecánica utilizando un dispositivo disociador semi-automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   4. Después de disociación mecánica, separar el tubo del dispositivo y realizar la digestión enzimática. Se incuban las muestras durante 20 minutos a 37 ºC bajo rotación continua. Inmediatamente detener la digestión enzimática mediante la adición de frío medio RPMI 1640 suplementado con 5% de FBS.
   5. Transferir la solución con la pipeta en un tubo cónico de 50 ml después de la filtración a través de un filtro de 40 micras. Tease el tejido restante aparte pulsando con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Sedimentar las células (500 xg, 8 min, 4 ° C).
   6. Resuspender el sedimento en 3 ml de 36% de medio de centrifugación en gradiente de densidad. Transferir la suspensión en un tubo cónico de 15 ml. añadir con cuidado 3 ml de 72% de medios de centrifugación en gradiente de densidad por debajo de la suspensión celular 3 ml de 36% sin ninguna interrupción. Se centrifuga (1.000 xg sin freno, 20 min, 4 ° C).
   7. Las células inmunes se encuentran en la interfaz. Eliminar la capa superior de color amarillento que contiene restos celulares y luego llevar el volumen hasta 15 ml utilizando PBS frío. Agitar bien para la descomposición del gradiente. Girar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C) y resuspender el precipitado en 3 ml de RPMI con 5% de FBS. Contar el número de células vivas en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano.
2. La aorta
   1. Preparar la solución de digestión aorta mediante la adición de colagenasa A (1 mg / ml), colagenasa B (1 mg / ml), y la DNasa I (100 mg / ml) a RPMI 1640 (suplementado con 5% de FBS).
   2. Usando unas pinzas finas, la transferencia de la aorta en un tubo de 2 ml que contiene 1 ml de solución de digestión aorta. Picar toda la aorta trozos muy pequeños con tijeras finas en la solución de digestión 1 ml. Mantener en hielo. Se incuban las muestras durante 30 minutos a 37 ° C bajo rotación continua.
   3. Transferir la solución a una placa de cultivo de tejidos y detener el Enzymadigestión tic añadiendo 5 veces el volumen de RPMI frío con 5% de FBS.
   4. Transferir la solución con la pipeta en un tubo cónico de 50 ml después de la filtración a través de un filtro de 40 micras. Tease el tejido restante aparte en una sola suspensión celular presionando con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Enjuague el filtro y sedimentar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C).
   5. Lavar el sedimento por adición de 10 ml de RPMI con 5% de FBS. Girar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C) y resuspender el precipitado en 3 ml de RPMI con 5% de FBS. Contar el número de células vivas en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano.
3. Los aórtica ganglios linfáticos de drenaje
   1. Colocar un colador de 40 micras en una placa de cultivo de tejido (60 mm x 15 mm). Coloque los ganglios linfáticos en el filtro y se burlan de ellos separados en una sola suspensión celular presionando con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Lavar el filtro con 2 ml de RPMI con 5% de FBS. Recoger las células en el plato.
   2. Transferirlas células en un tubo Falcon de 15 ml y sedimentar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspender el precipitado en 500 l de RPMI con 5% de FBS. Contar el número de células vivas en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano.

3. La estimulación ex vivo para la detección de citoquinas por citometría de flujo

1. Preparar los medios de cultivo de células: RPMI con FBS al 5%, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 50 mM β-mercaptoetanol y 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Centrifugar cada suspensión de células obtenida a partir de los nodos de riñón, la aorta y los ganglios (300 xg, 8 min, 4 ºC). Resuspender cada sedimento con los medios de cultivo celular a una concentración de 1 x 10 ⁶ células por ml.
3. Estimular las células mediante la adición de 2 l de cóctel de la activación de las células (que contiene de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), el ionóforo de calcio ionomicina, y el inhibidor de Golgi Brefeldina A) por cada 1 ml de cultivo celular.
   NOTA: La concentración finals de cada componente son: 81 nM de PMA, 1,33 M de ionomicina y 5 mg / ml de Brefeldina A. El tratamiento con PMA y ionomicina activa las células para producir citocinas. Las citoquinas son proteínas secretadas que deben ser atrapadas en las células para ser detectado. Brefeldina A causa de la acumulación de las proteínas secretadas normalmente en el aparato de Golgi y retículo endoplasmático. Por lo tanto, la técnica descrita aquí aumenta la detectabilidad de los linfocitos productoras de citoquinas por citometría de flujo.
4. Plate 1 a 2 millones de células en un 12 pocillos (de aorta o riñón), o 24 pocillos (ganglios linfáticos) placas de baja adherencia. Colocar la placa en un incubador de _CO2 humidificado 37 ° C durante 3 horas.
   NOTA: El número de células cultivadas en placas puede ser menor en los ganglios linfáticos de los ratones de control. Además, el tiempo de estimulación tiene que ser determinado empíricamente para cada población celular y de citoquinas estudiadas. En el caso de las células T aisladas de la aorta, riñón o de los ganglios linfáticos, se recomienda la estimulación de 3 a 4 horas. A la estimulación ya wenfermo no aumentar la secreción de citoquinas y la inducirá una regulación a la baja adicional de varios marcadores de superficie de células T tales como CD3, CD4 y CD8. (Tenga en cuenta que incluso una estimulación 3-4 hr inducirá alguna regulación a la baja de estos marcadores.)

La tinción 4. Superficie

1. Transferencia de las células en un tubo de poliestireno de FACS y se centrifuga (300 xg, 8 min, 4 ° C). Lavar las células dos veces con tampón FACS (Ca ^{2 +} y Mg ⁺ PBS libre que contiene 4% de FBS y 2 mM EDTA) y dividir la suspensión celular en partes iguales en diferentes tubos de FACS basado en el número de paneles de anticuerpos deseados y el número de tubos de control necesarias ( vea abajo).
2. Para realizar la compensación para cada panel, se preparan tubos de control sin teñir y tubos manchados individuales para cada tipo de tejido y el panel de anticuerpos. Además, preparar los tubos de control de fluorescencia menos uno (FMO) para cada panel de anticuerpo mediante la adición de todos menos uno de los anticuerpos.
3. Ajustar el volumen de cada tubo a 2 ml con FACSBuffer. Centrifugar la suspensión celular (300 xg, 8 min, 4 ° C), eliminar los receptores de sobrenadante y el bloque de Fc mediante la incubación de las células con 0,5 mg de anticuerpos anti-CD16 / CD32 por millón de células por 10 min en hielo.
   NOTA: CD16 es baja afinidad del receptor Fc de IgG III (FCR III) y CD32 es FcR II. CD16 / CD32 se expresa en granulocitos, mastocitos, monocitos / macrófagos, células asesinas naturales, células B, células dendríticas y algunas células T maduras activadas.
4. Realizar tinción de viabilidad: Lavar las células con PBS 1x, centrifugar (300 x g, 8 min, 4 ° C) y se vuelve a suspender en 1.000 l de PBS 1x. Añadir 1 l de un medio de contraste (tinción de viabilidad) amino-reactivo de células impermeable. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C protegido de la luz.
5. Durante la incubación, preparar el cóctel de anticuerpos (por tinción de la superficie) en un volumen apropiado de tampón de FACS. Lavar las células dos veces con 1-2 ml de tampón FACS, de centrifugación (300 xg, 8 min, 4 ° C) y volver a suspender cada sedimento con 100 lde la mezcla de anticuerpos. Incubar durante 30 minutos a 4 ° C protegido de la luz.
   NOTA: Para cada citometría de flujo de anticuerpos, es útil para determinar la cantidad óptima de anticuerpo necesaria mediante la realización de una curva de titulación de la dosis.
6. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón de FACS y sedimentar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C).

5. La fijación, permeabilización y tinción intracelular

1. Realizar la tinción intracelular con un kit de fijación y permeabilización que contiene tampones apropiados, siguiendo las instrucciones del fabricante. Fijar y permeabilizar las células mediante resuspensión en el tampón apropiado. Incubar las muestras durante 40 minutos a 4 ° C protegido de la luz.
2. Añadir 1 ml de 1x permeabilización y el tampón de lavado directamente a las células fijadas y permeabilizadas. Se centrifuga (500 x g, 8 min, 4 ° C) y eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 2 ml de tampón de lavado 1x.
3. Preparar las mezclas de antibodies (por tinción intracelular solamente) en un volumen apropiado de tampón de lavado 1x (por lo general 100 l por tubo).
   NOTA: Como se describió anteriormente, la concentración de anticuerpos óptima debe determinarse para cada anticuerpo en el panel. Por ejemplo, para los anticuerpos de IL-17A o IL-17F, se utiliza un factor de dilución de una y media, pero para los anticuerpos de IFN y T-bet, se utiliza un factor de dilución de 1: 100.
4. Centrifugar las células (500 xg, 8 min, 4 ° C) y volver a suspender cada sedimento con 100 l de la mezcla de anticuerpos. Incubar durante 40 minutos a 4 ° C protegido de la luz.
5. Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón de lavado 1x y sedimentar las células (500 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspender el precipitado con 300 l de tampón de lavado 1x y analizar en un citómetro de flujo con filtros adecuados.
6. Para la cuantificación del número total de células por muestra de tejido, el uso contar bolas. Antes de la adquisición, añadir el volumen / número recomendado de cuenta granos a cada tubo.

6. Compensación, apertura de puerta, normalización, y consejos

1. Compensación y gating
   1. tubos de control sin teñir y manchadas solo plazo de compensación para ajustar el solapamiento espectral.
      NOTA: El uso de bolas de compensación en lugar de controles de compensación basados ​​en células es necesaria en los casos en que está presente en niveles tan bajos que la compensación utilizando células será difícil el antígeno de interés o una población de células en una muestra. También hay que resaltar, al utilizar colorantes en tándem, es aconsejable preparar compensaciones para cada experimento ya que los tintes tándem varían de lote a lote, y con cada día.
   2. Ejecutar la fluorescencia menos uno controles (FMOs) para todos los fluoróforos en el panel cuando se inicia un nuevo experimento multicolor.
      NOTA: Los controles FMO son muestras que contienen todos los anticuerpos en el panel a excepción de una. Estos controles permiten una discriminación precisa de positivo frente a las señales negativas para el anticuerpo omitido Adjus adecuadamentet las puertas. Estos controles son particularmente importantes cuando los niveles de expresión son bajos o cuando la separación de la población objetivo es pobre (por ejemplo, cuando la diana es una citoquina o factor de transcripción). Aunque no siempre es necesario, en algunos casos, controles de isotipo se pueden preferir en lugar de FMO controla, ya que proporcionan una compensación adecuada para el isotipo de anticuerpo y el conjugado fluoróforo sin la especificidad del antígeno.
   3. Configurar la puerta principal: ajuste dispersión hacia adelante de la zona (FSC-A) y dispersión lateral en la zona (SSC-A) de tensión con el fin de detectar la población de leucocitos.
   4. Excluir las células muertas.
      NOTA: La mancha viabilidad reacciona con aminas libres presentes tanto en la superficie y el interior de las células. En contraste con las células vivas, las células muertas (con membranas comprometidas) permiten que el medio de contraste para entrar en el citoplasma, el aumento de la cantidad de etiquetado de proteínas. Por lo tanto, las células muertas serán más brillantes que las células vivas que permiten la discriminación fácil. Puerta en el vivoCélulas.
      NOTA: La viabilidad de las suspensiones de células a partir de la aorta y el riñón puede ser menor que la viabilidad de las suspensiones de células de los ganglios linfáticos debido a la etapa de digestión adicional.
   5. Terreno Área Avanzada de dispersión (FSC-A) [eje Y] y dispersión frontal Altura (FSC-H) [eje x]. Singletes aparecen como una diagonal en este gráfico de puntos. Puerta en esta diagonal para excluir dobletes. Se representa la CSS-A [eje Y] y CD45 [eje x].
   6. La población CD45 ⁺ leucocitos pueden ser fácilmente identificados. Puerta en esta población. poblaciones siguientes pueden ser identificados a partir de esta población.
2. La normalización de los recuentos de células
   1. contar bolas tienen características que resultan en baja SSC FSC y alta. Por ejemplo, si 50.000 perlas se añadieron en 300 l de la suspensión de células individuales, la ecuación para el cálculo del número absoluto de cualquier tipo de célula dar por tubo es el siguiente:
      Número de celdas ptubo er = (50000 / número de cuentas contadas por el citómetro de flujo) x número de células contadas.
      Usando este cálculo, el número absoluto de cualquier tipo de célula dado por tubo se puede determinar. Basado en el número de tubos fueron generados a partir de cada órgano, el número de células por órgano se puede calcular.
      NOTA: Mantenga todas las células y reactivos a 4 ° C durante el protocolo. Evitar el vórtice vigoroso, ya que puede dañar las células. Utilice fuerzas mínimas para sedimentar las células. Evitar hacer burbujas en el tubo de FACS, ya que puede precipitar la muerte celular. No deje que los gránulos se secan en cualquier momento.

Resultados

El protocolo descrito permite la identificación de marcadores de superficie e intracelulares en células T aisladas de riñón murino, la aorta y aórtica ganglios linfáticos que drenan en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Los resultados representativos se presentan a continuación.

La Figura 1 demuestra la estrategia de gating utilizado para identificar la población de células T en ...

Discusión

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue⁹. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	ROCHE	11088882001
Collagenase A	ROCHE	10103586001
Collagenase B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1x Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
DPBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A)	Biolegend	423303
anti-CD16/32	eBioscience	14-0161-81	dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
Transcription factor buffer set	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)	BioLegend	100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8)	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (clone 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)	BioLegend	644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2)	BD Biosciences	557724