Внутриклеточные Окрашивание и проточной цитометрии для идентификации субпопуляций лимфоцитов в пределах мышиной аорте, почек и лимфатических узлов в модели артериальной гипертензии

Резюме

В данной статье приводится подробная методика для идентификации и количественного определения функциональных подмножеств Т-лимфоцитов, присутствующих в мышиной почек, аорты и лимфатических узлов с помощью внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. была выбрана модель ангиотензина II, индуцированной гипертонии объяснить, шаг за шагом, процедуры и основополагающие принципы проточной цитометрии и внутриклеточного окрашивания.

Аннотация

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases^1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension⁶. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention^1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Введение

Последние данные свидетельствуют о том, что адаптивная иммунная система, в частности , Т - лимфоциты, играют решающую роль в развитии ряда сердечно - сосудистых заболеваний ^1,2,3,4,5. Например, в модели ангиотензина II , индуцированной гипертонии, накопление Т - клеток в сосудах и почках мышей было описано ^6. Накопление сосудистой преимущественно в адвентиции и периваскулярные жира. В почках, Т-клетки накапливаются в обоих мозговом веществе и корковом веществе почек. В зависимости от того, какое подмножество участвует, эти Т - клетки вызывают различные цитокины , которые могут влиять на сосудистую и функцию почек и приводят к развитию патологии (обзор McMaster и др. ^6).

CD4 ⁺ Т - хелперные лимфоциты могут быть разделены на несколько подмножеств: Т - хелперов 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, Т - регуляторные (Treg клетки), и Т фолликулярная хелперные (TFH) клеток на основе их функций и подписи цитоkines ^7. Точно так же, CD8 ⁺ , цитотоксические Т - клетки могут быть классифицированы как ТС1 Tc2, Tc17 или Tc9 ^8. Существуют также двойные негативные Т - клетки (например , клетки , которые не экспрессируют CD4 или CD8 Т - маркеров клетки). Часть этих клеток обладают альтернативный гамма-дельта-Т-клеточный рецептор (вместо классического альфа- и бета-рецепторы), и поэтому они упоминаются как гамма-дельта Т-клеток. Анализ многопараметрической проточной цитометрии поверхностным маркером, цитокина и фактора транскрипции представляет собой наилучший подход для идентификации этих клеток. Хотя этот метод широко используется в области иммунологии, он менее хорошо описаны в солидных органов и в условиях сердечно-сосудистых заболеваний.

Исторически сложилось так, идентификация лимфоцитов в тканях было ограничено иммуногистохимии или ОТ-ПЦР подходов. Хотя иммуногистохимии и иммунофлуоресценции мощные методы для определения распределения ткани антигена Interest, они недостаточны для того чтобы определить фенотипически подмножества участвующих. Кроме того, в то время как анализ ОТ-ПЦР является полезным для выявления экспрессии мРНК антигенов, как цитокины или факторы транскрипции, он не позволяет обнаруживать нескольких белков одновременно на уровне отдельных клеток.

Появление проточной цитометрии, особенно в сочетании с внутриклеточным окрашиванием для выявления цитокинов и факторов транскрипции, обеспечивает исследователей с мощной техникой, что позволяет идентифицировать и количественно определять на уровне одной клетки подмножеств иммунных клеток в солидных органов. Мы оптимизировали внутриклеточный анализ окрашивания для идентификации с помощью проточной цитометрии основных Т-клеточных подмножеств, присутствующих в мышиной почке, аорты и аортального дренирующих лимфатических узлов в модели ангиотензина II, индуцированной гипертонии. Оптимизация каждого шага: ткани пищеварения, исключая виво активации, пермеабилизации, и поверхностные и внутриклеточные результаты окрашивания в высоко повторнопроизводимое анализа, которые могут быть применены к другим сердечно-сосудистых и почечных моделей заболеваний.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Institutional Animal Care и использование комитет Университета Вандербильта утвердило процедуры, описанные в настоящем документе. Мыши размещены и уход в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальные академии прессы. Revised 2010).

1. Выделение аортального Слив лимфоузлах, почки и аорте мышей

1. Эвтаназии мышей CO ₂ ингаляции. Спрей груди с 70% этанолом и осторожно откройте кожу и стенки грудной клетки с ножницами, чтобы разоблачить сердце.
2. Для того, чтобы заливать сосудистую сеть, выполнить небольшой надрез в правое предсердие и устойчиво вводят по меньшей мере, 10 мл холодного PBS (приблизительно 1 мл / сек), в верхушке левого желудочка с использованием 21 или 23 G иглу. Заливать пока все органы не бланшируют. Сердце бледнеет в первую очередь. Побледнение печени указывает на то, что перфузия была хорошо выполнена.
3. Используя небольшие щипцы и тонких ножниц, аккуратно срезана и вытащить кишечник,желудка, селезенки, поджелудочной железы и печени, чтобы лучше визуализировать аорту.
   Примечание: Этот шаг должен быть сделан очень точно, как повреждения желудочно-кишечного тракта может вызвать загрязнение.
4. Вырезать и удалить каждое легкое с помощью ножниц. Промыть грудную полость фосфатно-солевым буфером (PBS) с использованием безыгольного шприца. Удалите излишки крови и жидкости с использованием стерильной марлей.
5. Удалите брюшной аорты дренирующих лимфатических узлов с использованием тонких препаровальный пинцет. Убедитесь в том, чтобы не привести к разрыву капсулы. Удалите остатки жира на поверхности каждого лимфатического узла с рассекает щипцов. Вырежьте две почки с тонкими ножницами.
6. Проанализируйте всю аорту (грудной и брюшной аорты) с тонкими изогнутыми ножницами. Старт на уровне сердца и тщательно отсечь от пищевода и позвонков вниз до уровня подвздошной бифуркацией, убедившись, что держать окружающий периваскулярное жир, присоединенный к аорте.
   Примечание: Дальнейшее рассечение аорты к удаливе окружающих структур может быть сделано под микроскопом. В частности, удалить артериальных ветвей (сонные артерии, подключичной артерии, целиакией, брыжеечных и почечных артерий) и лимфатических узлов. Держите последовательный слой периваскулярного жира вокруг каждой аорты, так как это место, где многие воспалительные клетки находятся в условиях гипертензии. Поместите каждую ткань в отдельные пробирки, содержащие холодной PBS.

2. Генерация одноклеточных суспензий из каждой ткани

1. почки
   Примечание: Почки могут быть диссоциированы в суспензии отдельных клеток путем сочетания механической диссоциации плюс ферментативное переваривание.
   1. Приготовьте раствор почек пищеварение путем добавления коллагеназы D (2 мг / мл) и ДНКазы I (100 мкг / мл) в среде RPMI 1640 (с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS)). Приготовьте 10 мл на пробу почек.
   2. Используйте пинцет, чтобы передать две почки в диссоциации пробирку, содержащую 10 мл почки переваритьраствор ионов.
   3. Выполните механическую диссоциацию с использованием полуавтоматического диссоциатора устройство в соответствии с инструкциями изготовителя.
   4. После механической диссоциации, отсоединить трубку от устройства и выполнять ферментативного пищеварения. Инкубируйте образцы в течение 20 мин при 37 ° С при непрерывном вращении. Немедленно остановить ферментативное переваривание путем добавления холодной среде RPMI 1640, дополненной 5% FBS.
   5. Переносят раствор пипеткой в ​​50 мл коническую пробирку, после фильтрации через сито 40 мкм. Задразните оставшиеся ткани друг от друга, нажимая с плунжерный шприц емкостью 1 мл. Гранул клетки (500 XG, 8 мин, 4 ° C).
   6. Ресуспендируют осадок в 3 мл 36% центрифугирование в градиенте плотности сред. Передача суспензии в коническую пробирку на 15 мл. Осторожно добавьте 3 мл 72% центрифугирование в градиенте плотности сред под суспензии 3 мл 36% клеток без какого-либо нарушения. Центрифуга (1000 XG без тормоза, 20 мин, 4 ° С).
   7. Иммунные клетки будут расположены на границе раздела. Снимите верхний желтоватый слой, содержащий клеточный мусор, а затем довести объем до 15 мл с использованием холодного PBS. хорошо взболтать к пробою градиент. Спин клетки (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют осадок в 3 мл среды RPMI с 5% FBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.
2. аорта
   1. Готовят раствор аорта пищеварение путем добавления коллагеназы А (1 мг / мл), коллагеназы В (1 мг / мл), и ДНКазы I (100 мкг / мл) в среде RPMI 1640 (с добавлением 5% FBS).
   2. Использование тонких щипцов, передать аорту в 2 мл пробирку, содержащую 1 мл раствора аорта пищеварения. Фарш всю аорту на очень мелкие кусочки с мелкими ножницами в растворе пищеварения 1 мл. Держите на льду. Инкубируйте образцы в течение 30 мин при температуре 37 ° С при непрерывном вращении.
   3. Переносят раствор в блюдо культуры ткани и остановить enzymaкрестики пищеварение путем добавления 5-кратного объема холодной RPMI с 5% FBS.
   4. Переносят раствор пипеткой в ​​50 мл коническую пробирку, после фильтрации через сито 40 мкм. Задразните оставшиеся ткани друг от друга в одной клеточной суспензии путем прессования с плунжерный шприц емкостью 1 мл. Промойте фильтр грубой очистки и осаждения клеток (300 XG, 8 мин, 4 ° С).
   5. Промывают осадок добавлением 10 мл RPMI с 5% FBS. Спин клетки (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют осадок в 3 мл среды RPMI с 5% FBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.
3. В аортальный осушение лимфатических узлов
   1. Поместите сетчатый фильтр 40 мкм в тканевой культуральной чашке (60 мм х 15 мм). Поместите лимфатические узлы на сетчатого фильтра и дразнить их друг от друга в одной клеточной суспензии путем прессования с плунжерный шприц емкостью 1 мл. Промыть сетчатый фильтр с 2 мл RPMI с 5% FBS. Собирают клетки в чашке.
   2. Переводклетки в сокола пробирку 15 мл и окатышей клетки (300 XG, 8 мин, 4 ° С). Ресуспендируют осадок в 500 мкл RPMI с 5% FBS. Подсчитайте количество живых клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.

3. Ex Vivo Стимуляция для обнаружения цитокина с помощью проточной цитометрии

1. Подготовка среды для культивирования клеток: RPMI с 5% FBS, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкМ -меркаптоэтанол и 1% пенициллина / стрептомицина.
2. Центрифуга каждой клеточной суспензии, полученный из почек, аорты и лимфатических узлов (300 XG, 8 мин, 4 ° С). Ресуспендируют каждую гранулу с клеточной культуральной среде при концентрации 1 × 10 ⁶ клеток на мл.
3. Стимулируют клетки путем добавления 2 мкл коктейля клеточной активации (содержащей форболовыми 12-миристат-13-ацетатом (РМА), Ионофор кальция Ionomycin и ингибитора Гольджи брефелдин А) на каждый 1 мл клеточной культуры.
   Примечание: конечная концентрацияс каждого компонента: 81 нМ РМА, 1,33 мкМ иономицина и 5 мкг / мл брефелдин A. Лечение ФМА и иономицином активирует клетки продуцировать цитокины. Цитокины секретируемые белки, которые должны быть пойманы в ловушку в клетках, чтобы обнаружить. Брефелдин А вызывает накопление обычно секретируемых белков в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Таким образом, способ, описанный здесь, усиливает детектируемость цитокинпродуцирующей лимфоцитов с помощью проточной цитометрии.
4. Пластина 1 до 2 миллионов клеток в 12-луночного (аорте или почек) или 24-луночного (лимфатических узлов) с низким уровнем приверженности пластин. Поместите пластинку в 37 ° C увлажненном CO ₂ инкубаторе в течение 3 часов.
   Примечание: Число посеянных клеток может быть ниже, в лимфатических узлах от контрольных мышей. Кроме того, время стимуляции должна быть определена эмпирически для каждой популяции клеток и цитокин изученной. В случае Т-клеток, выделенных из аорты, почечных или лимфатических узлов, мы рекомендуем стимулирующее течение от 3 до 4 часов. Более длинная стимуляция шбольным не увеличивает секрецию цитокинов и будет стимулировать дальнейшее понижающей регуляции нескольких маркеров клеточной поверхности Т как CD3, CD4 и CD8. (Обратите внимание, что даже стимуляция 3-4 часа будет вызывать некоторую понижающей регуляции этих маркеров.)

4. Поверхность Окрашивание

1. Перенести клетки в полистирола FACS пробирку и центрифугируют (300 XG, 8 мин, 4 ° С). Вымойте клетки дважды буфером FACS (Ca ²⁺ и Mg ⁺ свободный PBS , содержащий 4% FBS и 2 мМ ЭДТА) и разделить клеточную суспензию в равной степени в различных трубах FACS на основе количества панелей антител желательных и количество трубок , необходимых контрольных ( Смотри ниже).
2. Для выполнения компенсации для каждой панели, подготовить неокрашенные трубки управления и одиночные прокуренные трубки для каждого типа ткани и панели антител. Кроме того, готовят флуоресценция минус один (FMO) контрольных трубок для каждой панели антител, добавляя все, кроме одного из антител.
3. Отрегулируйте громкость каждой трубки до 2 мл FACSБуфер. Центрифуга клеточной суспензии (300 мкг, 8 мин, 4 ° С), удалить супернатант и блок Fc рецепторов путем инкубации клеток с 0,5 мкг анти-CD16 / CD32 антител на миллион клеток в течение 10 мин на льду.
   Примечание: CD16 является низким сродством IgG Fc-рецептор III (FcR III) и CD32 является FcR II. CD16 / CD32 экспрессируются на гранулоциты, тучные клетки, моноциты / макрофаги, естественных киллеров, В-клетки, дендритные клетки и некоторые активированных зрелых Т-клеток.
4. Выполните жизнеспособность окрашивания: Промывают клетки с 1x PBS, центрифугируют (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют в 1000 мкл 1х PBS. Добавить 1 мкл клеток-impermeant амин-реактивным красителя (жизнеспособность пятно). Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в защищенном от света месте.
5. Во время инкубации, готовят коктейль из антител (для поверхностного окрашивания) в соответствующем объеме буфера FACS. Вымойте клетки дважды с 1-2 мл буфера FACS, центрифуга (300 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют каждую гранулу со 100 мклсмеси антител. Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в защищенном от света месте.
   Примечание: Для каждого потока цитометрии антитела, полезно, чтобы определить оптимальное количество антител, необходимых при выполнении кривой титрования дозы.
6. Вымойте клетки дважды с 2 мл буфера FACS и осадка клеток (300 XG, 8 мин, 4 ° С).

5. Закрепление, пермеабилизирующего и внутриклеточное Окрашивание

1. Выполните внутриклеточное окрашивание с фиксирующей и пермеабилизации набор, содержащий соответствующие буферы, следуя инструкциям производителя. Закрепить и клетки проницаемыми путем ресуспендирования их в соответствующем буфере. Инкубируйте образцы в течение 40 мин при 4 ° С в защищенном от света месте.
2. Добавьте 1 мл 1x и пермеабилизации промывочного буфера непосредственно к неподвижным и проницаемыми клетками. Центрифуга (500 XG, 8 мин, 4 ° С) и удалить супернатант. Ресуспендируют осадок с помощью 2 мл 1х промывочного буфера.
3. Готовят смеси Антибodies (только для внутриклеточного окрашивания) в соответствующем объеме 1х промывочного буфера (обычно 100 мкл на пробирку).
   Примечание: Как указано выше, оптимальная концентрация антител должно быть определено для каждого антитела на панели. Например, на наличие антител к IL-17A или IL-17F, мы используем коэффициент разбавления 1:30, но на наличие антител к IFN & gamma; и Т-бет, мы используем коэффициент разбавления 1: 100.
4. Центрифуга клетки (500 XG, 8 мин, 4 ° С) и ресуспендируют каждую гранулу с помощью 100 мкл смеси антител. Инкубировать в течение 40 мин при 4 ° C в защищенном от света месте.
5. Вымойте клетки дважды с помощью 2 мл 1х промывочного буфера и осадка клеток (500 XG, 8 мин, 4 ° С). Ресуспендируют осадок 300 мкл 1х промывочного буфера и анализируют на проточном цитометре с соответствующими фильтрами.
6. Для количественного определения общего количества клеток на образце ткани, используют счетных бус. До приобретения, добавьте рекомендуемый объем / количество подсчета бусинки в каждую пробирку.

6. Компенсация, стробирования, нормализацию и советы

1. Компенсация и стробирования
   1. Запуск неокрашенные и одиночные запятнанные контрольные трубки для компенсации для корректировки спектрального перекрытия.
      Примечание: Использование компенсационных бусинок, а не клеточных элементов управления на основе компенсации необходимо в тех случаях, когда представляющий интерес антиген или популяции клеток в образце присутствует в таких малых количествах, что компенсация с использованием клеток будет трудно. Следует также отметить, при использовании тандемных красителей, рекомендуется подготовить компенсации для каждого эксперимента, поскольку тандемные красители варьируются от партии к партии, и с каждым днем.
   2. Запуск флуоресценции минус один контроль (лесозаготовительных предприятий) для всех флуорофоров в панели при запуске нового многоцветной эксперимента.
      Примечание: Элементы управления ФМО образцы, содержащие все антитела в панели кроме одного. Эти элементы управления позволяют точное дискриминацию положительных и отрицательных сигналов для опущенного антитела правильно регулировки оборотовт ворота. Эти элементы управления особенно важны, когда уровни экспрессии являются низкими или когда разделение целевой популяции бедна (например, когда мишень представляет собой цитокин или фактор транскрипции). Хотя это и не всегда необходимо, в некоторых случаях, контроль изотипа может быть предпочтительным вместо Предприятию управления, поскольку они обеспечивают надлежащую компенсацию за изотипа антитела и флуорофора конъюгат без специфичности антигена.
   3. Настройка основного ворота: регулировка рассеяния вперед Area (FSC-A) и боковое рассеивание (SSC Area-A) напряжение для того, чтобы обнаружить популяцию лейкоцитов.
   4. Исключить мертвые клетки.
      Примечание: Жизнеспособность пятно реагирует со свободными аминами присутствует как на поверхности и внутри клеток. В отличие от живых клеток, мертвые клетки (с ослабленной мембран) позволяют красителю войти в цитоплазму, увеличивая количество мечения белков. Таким образом, мертвые клетки будут ярче, чем живые клетки, позволяя легко дискриминации. Ворота на живойклетки.
      Примечание: Жизнеспособность клеточных суспензий из аорты и почек, может быть ниже, чем жизнеспособность клеточных суспензий из лимфатических узлов из-за дополнительной стадии пищеварения.
   5. Участок Forward Scatter Area (FSC-A) [Y-ось] и вперед Scatter Высота (FSC-H) [ось х]. Фуфайки появляются как диагональ на этом участке дот. Ворота на этой диагонали, чтобы исключить дублеты. Затем участок SSC-A [Y-ось] и CD45 [ось х].
   6. CD45 ⁺ лейкоциты населения могут быть легко идентифицированы. Ворота на этой группе населения. Последующие популяции могут быть идентифицированы из этой группы населения.
2. Нормализация кровяных клеток
   1. Счетные гранулы обладают характеристиками, которые приводят к низкой FSC и высокой SSC. Например, если 50000 гранулы добавляют в 300 мкл суспензии отдельных клеток, уравнение для вычисления абсолютного числа любого дают тип клеток на пробирку выглядит следующим образом:
      Количество ячеек рэр труба = (50000 / количество шариков, подсчитанных с помощью проточной цитометрии) х количество подсчитанных клеток.
      Используя этот расчет, абсолютное число любого данного типа клеток на пробирку может быть определена. На основании того, сколько трубок были получены от каждого органа, число клеток на орган можно рассчитать.
      Примечание: Храните все клетки и реагенты при температуре 4 ° С в течение протокола. Избегайте энергичной вихревание, потому что это может привести к повреждению клеток. Используйте минимальные силы для осаждения клеток. Избегайте пузырьков в трубке FACS, поскольку она может провоцировать гибель клеток. Не позволяйте гранулы высохнуть в любое время.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Протокол, описанный позволяет идентифицировать поверхностных и внутриклеточных маркеров в Т-клетках, выделенных из мышиной почки, аорты и аортального дренирующих лимфатических узлов в модели ангиотензина II, индуцированной гипертонии. Типичные результаты представл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue⁹. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	ROCHE	11088882001
Collagenase A	ROCHE	10103586001
Collagenase B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1x Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
DPBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A)	Biolegend	423303
anti-CD16/32	eBioscience	14-0161-81	dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
Transcription factor buffer set	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)	BioLegend	100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8)	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (clone 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)	BioLegend	644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2)	BD Biosciences	557724