源自iPSC的人脑组织体的一代新型早期神经发育障碍

摘要

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

摘要

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

引言

人类神经发育障碍，如小头畸形，只能研究甚少在动物模型中由于人类大脑有较长的皮质表面，独特的功能，从非人类动物不同。

该方面使得人脑发育一个复杂的过程，不能被充分研究在2D， 体外细胞培养系统。新兴的3D培养技术允许从诱导的多能干细胞（iPS细胞）的组织样类器官的生成。在3D悬浮培养多能干细胞的体外分化允许各种细胞类型的及时和特定区域的方式形成的，从而产生了一个有组织的，分层组织^1，2，3。多亏了3D先锋文化技术和揭秘的器官形成的复杂性，从干细胞开始实验室，我们开发大脑产生对类器官描绘人类大脑发育的早期事件和小头畸形体外 ^1，2，3模型的鲁棒性的方法。值得注意的是，我们适于通过兰开斯特等人开发的原始方法。以产生脑类器官^1。这种方法是根据我们的实验要求进行修改。

从加布里埃尔等人的一项研究的目的。是分析大脑发育过程中的神经干细胞维持的细胞和分子机制。为了做到这一点，一种机械的研究是通过分析在从一个小头畸形患者⁴衍生的三维大脑类器官的神经祖细胞（NPC）进行。这个病人在CPAP，中心体生物发生所需要⁵保守中心体蛋白进行的突变。一个被广泛接受的低论点是，小头畸形是NPC池的耗尽的结果，这可能是由于无论是细胞死亡或过早分化^{1，6，7，8，9。}

通过分析头畸形脑类器官的心室区（VZS），已显示的NPC的显著数进行不对称细胞分裂，不同于来自健康供体⁴衍生的脑类器官。 microcephalic脑组织体的广泛微观和生化分析揭示了及时纤毛拆卸⁴ CPAP意想不到的作用。具体地，突变的CPAP与延迟纤毛拆卸和延迟细胞周期重新条目相关联，从而导致的NPC ⁴的过早分化。这些结果表明，在小头畸形和日纤毛作用神经和大脑的大小控制在¹⁰ EIR参与。

该协议的第一部分是一个三步骤的方法的描述，以产生均匀的脑类器官。正如前面提到的，原来的兰开斯特协议进行调整和修改，以适应我们的宗旨^1。首先，人类iPSC在上Engelbreth-Holm的-群（EHS）矩阵定义的无饲养条件下培养。这一步骤避免了馈线依赖性多能干细胞培养物的变体。在这个协议中，神经分化的诱导以形成神经上皮直接从iPSC的开始。通过跳过胚状体（EB）形成步骤中，以更受控和定向的方式的神经分化前进。该方法限制了其他生殖细胞层，例如中胚层和内胚层的自发和无向的形成。通过施加这个协议中，含有神经花环神经球可以在第5天收获为EHS矩阵的嵌入和固定的悬浮培养。用于我们的协议的第三步骤中的类器官培养基补充有dorsomorphin和SB431542。 Dorsomorphin是骨形态发生蛋白（BMP）的小分子抑制剂，和SB431542抑制TGFβ/激活素/ Nodal信号通路。这些因素的组合可以促进神经分化比更有效地单独^{11，12，13，14}视黄酸。

总之，这些修饰使再现的生成脑组织体，并在保持类器官最小变化。重要的是，施加这种方法来鲁棒地产生从患者的iPSC，其携带突变影响中心体和细胞周期动力学的基因microcephalic脑类器官。

此协议的第二部分发出指令，以制备BR艾因类器官的分析和畸形细胞缺陷的解释。这包括固定，冷冻切片，免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析。该协议会为读者提供了预期结果的详细说明和解释为指导。

研究方案

1.脑类器官的生成（23天）

1. 神经外胚层的启动（5天）
   注:以下几点值得分化开始前予以考虑。重编程方法（lentiviral-，仙台病毒，附加体，或微小RNA-基于等 ）以获得人类iPSC理想地应为所有患者同一和控制iPSC系。各种重编程工具包，并根据公布的方案说明，请^{15，16，17，18。}人类iPSC系的质量的关键是实现最佳的分化。监测菌落和细胞形态用显微镜和通过测试标记物的表达，如OCT3 / 4，Nanog的，或TRA-1-60验证多能性。
   1. 培养人无饲养条件下的iPSC在介质A上涂覆有Engelbreth-Holm的-群菜（EHS）矩阵。
      注:生长人类iPSC无饲养和维持确定的培养条件，并避免对分化开始前除去小鼠胚胎饲养细胞（MEF中）的附加步骤的无血清。对于人类iPSC的最佳通道编号，以从通道15重新编程时开始分化范围到通道70的总额。传代时，分离的hiPSC菌落作为细胞聚集使用具有低机械应力的适当细胞剥离溶液和2毫升血清移液管的聚集体转移到新的培养皿中。避免解离为单细胞，因为这可能会诱导分化和凋亡在大多数iPSC系。据报道，长期，单细胞传代会增加基因组改变在人iPSC ^19，20。避免细胞脱离程序，这需要离心步骤以除去剥离液，因为这降低iPSC的整体可行性。测试微生物污染，特别是支原体，定期，所有的文化，因为这可能会改变iPS细胞的质量和分化能力。
      1. 外套60毫米组织培养皿中以EHS矩阵按照制造商的说明书。
      2. 解冻的1×10 ⁶人类iPSC的等分试样。种子的iPSC在涂在EHS基质和含有5毫升培养基A（参见材料表 ）60毫米组织培养皿中。每日更换培养基和传代后5至7天当细胞达到〜80％汇合。
         注意:在传代80％汇合使用标准方法，如集落²¹的不含酶的分离，至少一次在开始分化前的解冻的iPSC。简言之，移除的iPSC介质，具有预温37℃，Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基一次洗涤细胞:营养混合物F12（DMEM / F12），并孵育的iPSC按照生产商的使用试剂A指令（见材料表）。不要为了避免解离为单细胞超过推荐的培养时间。人类iPSC应分离及浮动聚集，而不是单个细胞。然后可以将它们转移到新的EHS基质包被的培养皿;例如，iPSC集聚集来自一个60-mm皿可以被分配到4个新的60-mm培养皿。
      3. 根据制造商的说明与支原体检测试剂盒检查支原体。只使用无支原体的iPSC，支原体可以改变iPS细胞的分化能力。
   2. 解离的iPSC（80％汇合），并使用试剂B.制备单细胞悬浮液
      1. 用预热（37℃）的DMEM / F12洗涤的iPSC一次。
      2. 添加预热的试剂B（ 例如，1毫升在60毫米培养皿）和孵育的iPSC在37℃5分钟和5％CO _2。
      3. 上的侧部和底部的指尖轻弹20倍培养皿以分离的iPSC。检查细胞在显微镜下分离。
      4. 用1毫升微量移液管将细胞悬浮液上下在培养皿5倍。
      5. 加入3毫升培养基A稀释1mL的试剂B和收集细胞悬浮液在15mL的离心管中。
      6. 轻轻降速的iPSC（500×g下），用于在室温下4分钟。
      7. 重悬在1mL介质B的细胞沉淀和计数与血球细胞数目。
         注意:请注意只使用介质B的再悬浮。避免使用介质A，因为它包含一个过于高浓度的bFGF，这可能会抑制分化。
   3. 稀释细胞悬浮液，以每毫升4.5×10 ⁵个细胞在培养基B补充有10μMRho相关蛋白激酶抑制剂（Y-27632）。
   4. 添加每孔100μL在非贴壁，V形底，96孔板。
      注:确保细胞均匀分布在SUS通过取出100μL的部分之前每次摇动管退休金。使每孔应包含以获得神经球在尺寸和形状（圆形，限定的表面）均匀的等效细胞数量是重要的。
   5. 与细胞在500×g下和室温下温和降速板3分钟，并在37℃和5％CO ₂孵育。
   6. 每日通过去除50微升和加入新鲜培养基B的50μL到每个孔中用于接下来5天改变介质。

2.嵌入神经球在EHS矩阵（4天）

1. 200（V / V）的补充1，1:1:1:1:DMEM / F12和介质C（V / V），1的1:1混合物100（V / V）补充2无（重量/通过以下混合制备神经球介质○）维生素A，1:100 L-谷氨酰胺，0.05 mm，非必需氨基酸（MEM），100U / mL青霉素，100微克/ mL链霉素，1.6 g / L的胰岛素，和0.05mMβ巯基乙醇。
2. 收集神经球机智公顷使用〜2毫米尖端200μL微量预先切割用无菌剪刀。
3. 放置神经球大约5mm远离彼此上石蜡膜（3×3厘米^2）在一个空的100mm培养皿，并小心地取出尽可能剩余的培养基。
4. 添加EHS矩阵一滴（7微升）到每个单个神经球。
5. 孵育EHS矩阵与用于神经球在培养箱中15分钟下降。
6. 通过与神经球中冲洗它们从石蜡膜仔细清洗的神经。要刷新，使用1mL的微量和含有10毫升神经球介质的新百毫米培养皿。
7. 孵育神经球在接下来的4天，添加在第2天2毫升的新鲜神经球培养基。
   注:确保在孵化器的货架上是平的，这样的EHS基质埋入神经球不会对菜的一侧聚集在一起。

3.在旋转悬挂类器官文化（14天）

1. 200（V / V）的补充1，1:100（V / V）补充2 W / O 1:DMEM / F12和介质C（V / V），1的混合物通过以下混合制备脑类器官介质维生素A，1:100 L-谷氨酰胺，0.05毫MEM，100 U / ml的青霉素，100μg/ mL链霉素，1.6 g / L的胰岛素，0.5μMdorsomorphin，5μMSB431542，和0.05mMβ巯基乙醇。
2. 加入100毫升脑类器官培养基到每个转瓶中通过其侧臂并将它们放置在用于预热的培养箱中至少20分钟。
3. 在25rpm设置搅拌程序，根据制造商的说明。
   注:EHS基质埋入神经球转移到转瓶中之前，确保它们都分开。如果两个或多个通过EHS矩阵连接，通过用手术刀切割所述连接矩阵将它们分开。
4. 小心转移EHS基质包埋神经球到含有100毫升类器官培养基的旋转烧瓶我们荷兰国际集团2毫升血清移液管。使用旋转瓶的侧臂的神经球转移到烧瓶中。
5. 放置在培养箱中的磁搅拌下平台旋转瓶在37℃和5％CO _2;这是化培养的第0天。
6. 改变介质每周一次（或更经常时，有一个颜色的变化）通过除去一半的培养基并添加新鲜培养基的相同的量。
   注意:当取旋转烧瓶出培养箱，等待3-5分钟，以让类器官下沉到烧瓶的底部。通过将液体的表面上的玻璃移液管尖端（连接到泵）拆下介质;小心通过一个侧部开口/烧瓶的臂吸出培养基。这些操作必须在层流罩下进行。

4.脑组织体分析

1. 组织体固定
   1. 收集转瓶中培养无线的第14天的类器官TH切割1mL的微量（切割约5毫米）。把它们都在60毫米培养皿中并用5毫升温暖的DMEM / F12的一次洗3分钟。
   2. 制备1.5mL管500μL温暖4％多聚甲醛的（PFA）。
      注意:处理PFA固定时，戴上皮肤和眼睛的保护和工作安全罩下。
   3. 将每个器官样分别在每个管和解决这些问题，在室温下至少30分钟。不要修复类器官的时间超过60分钟。要移动类器官，用接种环或其他任何设计出方便。
   4. 除去PFA和洗涤固定类器官两次，每次10分钟，用1mL的PBS中。
   5. 存储在1mL PBS的类器官在4℃至7天，直至进一步使用。
2. 嵌入类器官的冷冻切片
   1. 除去PBS并在每管脱水cryofreezing他们之前的类器官蒸馏水溶液加入1毫升30％蔗糖的;加入SUCRO后SE溶液，所述类器官应在表面上浮动。在4℃下过夜存储类器官中的蔗糖溶液;在第二天，类器官应该已经沉没到管的底部。
      注意:可以类器官在4℃如有必要，可以保存长达3-5天在蔗糖溶液。
   2. 填充400μL最佳切割温度（OCT）化合物的乙烯基标本模具，并使用接种环将一个类器官在模具的中心。标记与样品名称模具的边缘。
   3. 冷冻在-80℃下的含类器官模直到冷冻切片。
   4. 用PBS中0.1％的聚-L-赖氨酸溶液（PLL），在室温下5分钟，涂层玻璃cryoslides并让干燥载玻片3小时。在4℃保存幻灯片，使用前预热起来到室温温和。
      注:PLL涂层是重要的一步，因为它会阻止该组织体片漂浮之遥。收集并在4℃下存储PLL溶液长达3个月。重新使用前，用0.22微米注射器过滤它，让它温暖至室温。
   5. 部cryofrozen类器官成20-50微米厚的切片上PLL涂布的玻璃cryoslides ^22。让与所述部分中的干燥载玻片在室温下1个小时。在-80℃直到进一步处理存储该部分。

5.类器官切片的免疫荧光染色

注:有关组织体的一般特征，与巢蛋白，神经祖细胞标记，TUJ1，泛神经元标记染色，值得推荐。作为附加示例，免疫荧光染色与磷酸化波形蛋白（P-VIM），哪些标签有丝分裂顶端径向胶质细胞，和Arl13b，为纤毛，进行说明。为了测试细胞凋亡，使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定法。放置在塑料盒中载片温育期间，以保护它们免受灰尘，光，和干燥。

1. 解冻载玻片在室温下30分钟。
2. 用PBS-甘氨酸200μL（在PBS中0.225克甘氨酸）3分钟洗两次滑动以淬灭PFA诱导的自体荧光。
3. 透化切片用/ 0.5％的Triton X100的200μL中在室温下10分钟的PBS溶液0.1％吐温。
4. 用3分钟PBS-甘氨酸溶液200微升洗两次。
5. 与/ 200μL0.5％鱼明胶的0.1％的Triton X100的PBS孵育它们在室温下或在4℃下过夜1个小时，以封闭非特异性的抗原结合。
   注:如果需要TUNEL分析，进行测定按照制造商的方案。进行免疫，因为它可能与第二抗体干扰和以后使用时，荧光淬灭之前与TUNEL法启动。
6. 稀释的抗体在阻断以下列浓度溶液:巢蛋白，1:200; P-Vim的，1:500; TUJ1，1:200;Arl13b，1:20;抗体和第二抗体，1:1,000。
7. 与所述第一初级抗体的200μL（ 例如，巢蛋白）1-2小时，在室温下或在4℃下孵育过夜。
8. 洗3×3分钟用封闭溶液的200μL。
9. 稀第一（抗小鼠488）的第二抗体1:1000在封闭溶液中孵育在200μL滑动，在室温下1-2小时。从现在起，始终保护将幻灯片从光。
10. 洗3×3分钟用封闭溶液的200μL。
11. 与下一个初级抗体的200μL（ 例如，TUJ1）孵育在室温下1-2小时或过夜，在4℃。
12. 洗3×3分钟用封闭溶液的200μL。
13. 添加下一个第二抗体（抗 - 兔647）的200μL，在室温下1-2小时。
14. 洗3×3分钟。用封闭溶液的200μL。
15. 添加200μL的4' ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在30nM的浓entration的PBS在室温下核染色15分钟。
16. 洗2×3分钟用封闭溶液的200μL。
17. 洗1×1分钟用蒸馏水200μL，并让部分干燥10-20分钟，直到没有明显的水滴是可见的了。
18. 安装与包埋剂的部分。将它们储存在4℃下避光长达数周。
19. 与微观分析图像的组织体，脑室区，原始的骨板，以及其他感兴趣的领域的概述进行。
20. 使用与63X油浸物镜和荧光滤光器的共聚焦显微镜，根据所使用的^1，10中的荧光染料标记的第二抗体选择。

结果

脑类器官的生成需要至少三周连续培养（ 图1A）的。为了实现可重复的结果，我们建议，研究人员记录了每一步，更重要的，避免了关于培养基成分，时间点和细胞处理任何改变。在这里，我们给出了如何在关键的里程碑，是为了在实验结束时获得足够的质量达到类器官评估总结。神经球在96孔板的形成应该是从第4天的神经球能够识别在每个孔的底部（

讨论

MCPH是一个复杂的人类神经发育障碍，不能在动物模型中在体内或在简单的人细胞培养物在体外方法中重现。 MCPH的临床表现开始在第一孕期出现，早期的神经开始时。因此，3D脑组织体代表了可靠的实验系统，MCPH发展模式。此外，三维人体脑组织体是一种理想的方法，因为i）它们允许与各种遗传背景的患者样本的光谱的适配，ⅱ）它们显示包含不同的神经细胞类型组织的组织，并?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers