JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Аннотация

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Введение

Человеческие развитие нервной системы расстройство, такие как микроцефалия, может быть плохо изучено только на животных моделей из-за того, что мозг человека имеет расширенную корковую поверхность, уникальную особенность, отличающуюся от животных, кроме человека.

Этот аспект делает развитие мозга человеческим сложный процесс , который не может быть достаточно изучен в 2D, в пробирке системы культивирования клеток. Новые методы 3D культур позволяют генерировать подобные ткани органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Дифференцировки в пробирке плюрипотентных стволовых клеток в 3D культуры подвески допускает образование различных типов клеток в области своевременного и конкретным образом, что приводит к организованной, стратифицированной ткани 1, 2, 3. Благодаря лаборатории, пионеры технологии 3D культур и демистифицировали сложность формирования органов, начиная от стволовых клеток,мы разработали надежный метод генерации органоиды мозга разграничить ранние события развития человеческого мозга и смоделировать микроцефалия в пробирке 1, 2, 3. Следует отметить , что мы адаптировали оригинальный метод , разработанный Lancaster и др. генерировать церебральных органоиды 1. Этот метод был модифицирован в соответствии с нашими экспериментальными требованиями.

Целью исследования с Габриэль и соавт. был проанализировать клеточные и молекулярные механизмы нейронального поддержания стволовых клеток в процессе развития мозга. Для того чтобы сделать это, механистическое исследование проводили с помощью анализа нейронных клеток - предшественников (НПС) в 3D органоидов головного мозга , полученных от пациента 4 микроцефалии. Этот пациент нес мутацию в ППДЕ, законсервированный центросомном белок , необходимый для центросом биогенеза 5. Широко принято гипо-тезис , что микроцефалия является результатом истощения пула NPC, и это может быть обусловлено либо к гибели клеток или к преждевременной дифференцировке 1, 6, 7, 8, 9.

Путем анализа желудочковых зон (VZS) микроцефалия органоидов мозга, было показано , что значительное число НПСА подвергается асимметричному делению клеток, в отличии от органоидов мозга , полученных от здорового донора 4. Обширные микроскопические и биохимические анализы микроцефальных органоидов мозга выявили неожиданную роль для ППДА в своевременной ресничек разборке 4. В частности, мутировали CPAP связано с запаздывающим реснички разборки и отсроченной клеточного цикла повторного входа, что приводит к преждевременному дифференциации РНУ 4. Эти результаты указывают на роль ресничек в микроцефалии и йEIR участие в процессе нейрогенеза и размера мозга управления 10.

Первая часть этого протокола является описанием способа трехступенчатого для создания однородных органоидов мозга. Как упоминалось ранее, оригинальный протокол Lancaster был адаптирован и изменен в соответствии с нашей цели 1. Во-первых, человеческие иПСК культивируют в определенном без фидерного слоя условие на матрице Engelbreth-Холм-рой (ГЭП). Этот шаг позволяет избежать вариаций фидерных-зависимых культур плюрипотентных стволовых клеток. В этом протоколе, индукция дифференцировки нервной с образованием нейронной эпителии начинается непосредственно из ИПСКА. Путем пропуска шага эмбриоидного тела (EB) образования, нейронная дифференциация протекает в более контролируемый и направленный образе. Этот подход ограничивает спонтанное и неориентированное образование других слоев зародышевых клеток, такие как мезодермы и энтодерма. Применяя этот протокол, нейросферы содержащие нейронные розетки могут быть собраны на 5-й день для EHS матрицы вложение и стационарные суспензионной культуры. Органоид среда, используемая для третьего этапа нашего протокола дополняется dorsomorphin и SB431542. Dorsomorphin является ингибитором малых молекул костного морфогенетического белка (BMP), и SB431542 ингибирует / активин / узловой сигнальный путь TGF-beta. Сочетание этих факторов может способствовать нейронной дифференциации более эффективны , чем в одиночку 11, 12, 13, 14 ретиноевой кислоте.

В целом, эти модификации позволяют воспроизводимое поколение органоидов мозга, с минимальными различиями между органоидами. Важно отметить, что этот метод был применен для генерации энергично микроцефальных органоидов мозга от ИПСКА пациентов, которые несут мутации в генах, которые влияют на центросомы и динамику клеточного цикла.

Вторая часть этого протокола дает указание по подготовке брAin органоиды для анализа и интерпретации клеточных дефектов в микроцефалии. Это включает в себя фиксацию, cryosectioning, иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальной микроскопический анализ. Этот протокол обеспечит читатель с подробным описанием ожидаемых результатов и руководством для интерпретации.

протокол

1. Генерация мозга органоиды (23 дней)

  1. Инициирование нейроэктодермы (5 дней)
    Примечание: Следующие пункты должны быть рассмотрены до начала дифференцировки. Метод перепрограммирования (lentiviral-, Сендайте-проявления вирусного, episomal- или микроРНК основы и т.д.) для получения человеческого ИПСКА в идеале должен быть одинаковым для все пациента и контролировать Ipsc линию. Различные наборы перепрограммирования и инструкция , основанная на опубликованных протоколах доступны 15, 16, 17, 18. Качество человеческих линий IPSC является ключом к реализации оптимальной дифференциации. Монитор колонии и морфологии клеток с помощью микроскопа и проверки плюрипотентности путем тестирования экспрессии маркеров, таких как Oct3 / 4, Nanog, или TRA-1-60.
    1. Культура человека иПСК под фидерных свободных условиях в среде А на блюдо, покрытой Engelbreth-Holm-Swarm(ГЭП) матрица.
      Примечание: Grow человека ИПСК фидерных бесплатно и без сыворотки, чтобы поддерживать определенное состояние культуры и, чтобы избежать дополнительной стадии для удаления мышей эмбриональных клеток (фидеров) MEFs перед началом дифференцировки. Оптимальное количество прохода для человека, чтобы начать ИПСК диапазонов дифференциации от прохода 15 при перепрограммировании, чтобы канал 70 в общей сложности. Когда пассирования, отделить hiPSC колонии клеток, как агрегат, используя соответствующее решение открепления клеток с малой механической нагрузкой и серологические пипетки 2-мл перевести агрегаты на новое блюдо. Избегайте диссоциации на отдельные клетки, так как это может индуцировать дифференцировку и апоптоз в большинстве линий IPSC. Было сообщено , что в долгосрочной перспективе, одноклеточный пересев может увеличить геномные изменения в человеческом ИПСКЕ 19, 20. Избегайте отрыв процедуры клеток, которые требуют стадий центрифугирования для удаления раствора для отсоединения, так как это уменьшает общую жизнеспособность ИПСКА. Контрольная работавсе культуры для микробных загрязнений, в частности, микоплазм, на регулярной основе, так как это может изменить качество ИПСКА и их дифференцировка потенциал.
      1. Пальто 60 мм культуры ткани блюдо с матрицей EHS в соответствии с инструкциями изготовителя.
      2. Оттепель аликвоту 1 × 10 6 человека ИПСКА. Семя ИПСКА в 60-мм блюда культуры ткани с покрытием в виде матрицы , содержащего EHS и 5 мл среды А (см Материалов таблицы). Изменение среды ежедневно и прохождения через 5 до 7 дней, когда клетки достигают ~ 80% сплошности.
        Примечание: Прохождение талой ИПСК на 80% конфлюэнтности с использованием стандартных методов, таких как фермент , свободной от отряда колонии 21, по крайней мере , один раз перед началом дифференцировки. Короче говоря, удалить носитель Ipsc, промыть клетки один раз с подогретой 37 ° C Дульбекка модифицированной среды Иглы: питательная смесь F12 (DMEM / F12), и инкубировать ИПСК следующих изготовителяинструкции с использованием реагента А (смотри таблицу материалов). Не превышать рекомендуемое время инкубации, чтобы избежать диссоциации на отдельные клетки. Человеческие иПСК должны быть отделены и плавающие в виде агрегатов, а не в виде отдельных клеток. Затем они могут быть переданы к новому EHS матричных покрытым блюдам; например, Ipsc агрегаты из одного 60-мм блюда может быть распределены до 4 новых 60-мм чашек.
      3. Проверка на микоплазму с комплектом обнаружения микоплазм в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте только микоплазмы свободного ИПСК, так как микоплазма может изменить способность дифференцировки ИПСКА.
    2. Диссоциируют ИПСК (80% сливающийся) и подготовить одну клеточную суспензию с использованием реагента В.
      1. Промывают ИПСК один раз подогретого (37 ° С) DMEM / F12.
      2. Добавить подогретого реагента B (например, 1 мл в 60 мм чашку) и инкубировать ИПСК в течение 5 мин при 37 ° С и 5% CO 2.
      3. Флик 20 раз с пальцем на стороне и нижнемблюдо, чтобы отделить ИПСК. Проверьте отряд клеток под микроскопом.
      4. Пипетировать клеточную суспензию вверх и вниз в блюде 5 раз с помощью микропипетки 1-мл.
      5. Добавьте 3 мл среды А для разбавления 1 мл реагента В и собирают суспензию клеток в центрифужной пробирке 15 мл.
      6. Осторожно спин вниз ИПСК (500 XG) в течение 4 мин при комнатной температуре.
      7. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды В и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра.
        Примечание: Имейте в виду, используя только средний B для взмучивания. Избегайте использования среды А, так как она содержит слишком высокую концентрацию bFGF, который может ингибировать дифференцировку.
    3. Развести клеточной суспензии до 4,5 × 10 5 клеток на мл в среде B , дополненной 10 мкМ Rho-ассоциированный ингибитор протеинкиназы (Y-27632).
    4. Добавьте 100 мкл на лунку в не-присоединенными, V-нижней, 96-луночный планшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что клетки равномерно распределены в СУСпенсионного встряхиванием трубку каждый раз, прежде чем принимать 100 мкл порции. Важно, что каждая скважина должна содержать эквивалентное количество клеток, чтобы получить нейросферы однородные по размеру и форме (круглые, определенные поверхности).
    5. Аккуратно спин вниз пластины с клетками при 500 Xg и комнатной температуры в течение 3 мин и инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2.
    6. Изменение среды ежедневно путем удаления 50 мкл и добавлением 50 мкл свежей среды В в каждую лунку в течение следующих 5 дней.

2. Встраивание Нейросферы в ГЭП матрице (4 дня)

  1. Подготовка нейросфера среды путем смешивания следующей: 1 смеси DMEM / F12 и среды С (об / об), 1:: 1 200 (об / об) дополнения 1, 1: 100 (объем / объем) дополнения 2 без (ж / о) Витамин а, 1: 100 L-глутамина, 0,05 мМ заменимых аминокислот (MEM), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1,6 г / л инсулина, и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола.
  2. Сбор Нейросферы остроумиега 200 мкл с помощью микропипетки мм наконечник ~ 2 предварительно разрезанную стерильными ножницами.
  3. Поместите нейросферы приблизительно 5 мм друг от друга на парафиновой пленке (3 х 3 см 2) в пустой 100 мм чашке и тщательно удалить как можно больше оставшуюся среду , насколько это возможно.
  4. Добавить каплю (7 мкл) матрицы EHS на каждом отдельном нейросфера.
  5. Выдержите матрицу EHS падает с нейросферами в течение 15 мин в термостате.
  6. Вымойте нейросферы тщательно от парафиновой пленки путем промывки их нейросфера среды. Для промывки используйте 1 мл микропипетки и новый 100 мм чашку Петри, содержащую 10 мл среды нейросфера.
  7. Инкубация нейросферы в течение следующих 4 дней и добавьте 2 мл свежей среды нейросферы на 2-е дня.
    Примечание: Убедитесь, что полки в инкубаторе являются плоскими, так что EHS матрицы встраиваемых нейросферы не слипаются на одной стороне тарелки.

3. органоидов в Ротари ПодвескаКультура (14 дней)

  1. Подготовка мозг Органоида среды путем смешивания следующая: 1 смеси DMEM / F12 и среду С (об / об), 1:: 1 200 (об / об) дополнениях 1, 1: 100 (объем / объем) добавка 2 Вт / о Витамин а, 1: 100 L-глутамина, 0,05 мМ МЕМ, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1,6 г / л инсулина, 0,5 мкМ dorsomorphin, 5 мкМ SB431542 и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола.
  2. Добавляют 100 мл мозга Органоид среды к каждой вращающейся колбе через ее боковые руки и поместить их в инкубатор для предварительного нагрева, по меньшей мере, 20 мин.
  3. Установите программу для перемешивания при 25 оборотах в минуту, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Перед переносом EHS матрицы встраиваемых нейросфер в вращающиеся колбы, убедитесь, что все они разделены. Если два или более соединены через матрицу EHS, разделите их разрезанием соединяющей матрицы с помощью скальпеля.
  4. Аккуратно перенести EHS матрицы с внедренными нейросферами в центрифужные колбы, содержащих 100 мл среды Органоида насING серологической пипетки 2 мл. Используйте боковые кронштейны вращающейся колбы для передачи нейросферы в колбу.
  5. Поместите вращающиеся колбы на магнитной перемешивающей платформы в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2; это день 0 из органоидных культур.
  6. Изменение среды один раз в неделю (или чаще, когда происходит изменение цвета), удаляя половину среды и добавляя такое же количество свежей среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении Вертушки колб из инкубатора, подождать 3-5 минут, чтобы позволить органоидам опуститься на дно колбы. Удалить среду, помещая наконечник стеклянной пипетки (соединенный с насосом) на поверхности жидкости; аспирата среду тщательно через одну боковое отверстие / руку колбы. Эти манипуляции должны проводиться под ламинарным укрытием.

4. Анализ мозга органоидами

  1. Фиксация органоидов
    1. Сбор органоиды на 14-й день культивирования Wi вращающаяся колбаго разреза в 1 мл микропипетки (вырезать ~ 5 мм). Поместите все из них в 60 мм чашку и промыть их один раз с 5 мл теплой DMEM / F12 в течение 3 мин.
    2. Подготовьте 1,5 мл пробирку с 500 мкл теплой 4% параформальдегида (PFA).
      Внимание: Носить кожу и средства защиты глаз и работать под колпаком безопасности при обращении с PFA фиксатором.
    3. Поместите каждый Органоид отдельно в каждой пробирке и зафиксировать их в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. Не закрепляйте органоиды дольше, чем 60 мин. Чтобы переместить органоиды, использовать петлю посевной или любое другое Завещание, которое удобно.
    4. Удалите PFA и мыть фиксированные органоиды два раза в течение 10 мин каждый с 1 мл PBS.
    5. Хранить не органоиды в 1 мл PBS при 4 ° С в течение до 7 дней, до дальнейшего использования.
  2. Встраивание органоидов для cryosectioning
    1. Удалить PBS и добавляют 1 мл 30% сахарозы в дистиллированной воде раствора на пробирку, чтобы обезвоживают перед органоидами cryofreezing их; после добавления sucroРешение себе, что органоиды должны быть плавающими на поверхности. Хранить органоиды в течение ночи в растворе сахарозы при 4 ° С; на следующий день, то органоиды должен запали в нижней части трубы.
      Примечание: органоиды можно хранить до 3-5 дней при температуре 4 ° С в растворе сахарозы, если это необходимо.
    2. Заполните винилового образец формы с 400 мкл Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения и использовать петлю инокуляции, чтобы поместить Органоид в центре пресс-формы. Этикетка край пресс-формы с именем образца.
    3. Зафиксировать на Органоид содержащих формы при температуре -80 ° C до cryosectioning.
    4. Coat стекло cryoslides с 0,1% лизина поли-L-раствора (ФАПЧ) в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, и пусть слайды высохнуть в течение 3 ч. Храните слайды при температуре 4 ° С и нагреть их до комнатной умеренного перед использованием.
      Примечание: ФАПЧ-покрытие является важным шагом, поскольку это позволит предотвратить Органоид ломтиков от плавающих прочь. Собирать и хранить раствор ФАПЧ при температуре 4 ° С в течение до 3месяцы. Перед повторным использованием, фильтровать ее с шприц 0,22 мкм, и пусть он нагреться до комнатной температуры.
    5. Раздел cryofrozen органоиды в 20-50 мкм толщиной срезов на стекле ФАПЧ с покрытием cryoslides 22. Пусть слайды с секциями сохнуть в течение 1 ч при комнатной температуре. Хранить секции при температуре -80 ° С до дальнейшей обработки.

5. Иммунофлуоресцентного Окрашивание Органоид секций

Примечание: Для общей характеристики органелл, окрашивание нестин, нервной прародительницы маркера и TUJ1, пан-нейронный маркер, рекомендуется. В качестве дополнительных примеров, иммунофлуоресцентного окрашивания с фосфо-Виментин (п-VIM), который маркирует митотические апикальные радиальные глиальные клетки, и Arl13b, для реснички, описаны. Для проверки апоптоза, используйте анализ терминальной дезоксинуклеотидтрансферазы (TdT) дУТФ Nick-End Этикетировочного (TUNEL). Поместите слайды в пластиковой коробке во время инкубационных, чтобы защитить их от пыли, свет,и высыхания.

  1. Оттепель слайдов в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть слайдов дважды 200 мкл PBS-глицина (0,225 г глицина в PBS) в течение 3 мин, чтобы погасить ПФА-индуцированной флуоресценции.
  3. Проницаемыми секции с 200 мкл 0,5% Тритона Х100 / 0,1% твина в растворе PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  4. Промыть их в два раза с помощью 200 мкл PBS-глицина раствор в течение 3 мин.
  5. Инкубируйте их с 200 мкл 0,5% рыбьего желатина / 0,1% Triton X100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° С, чтобы блокировать неспецифическое связывание антигена.
    Примечание: Если требуется анализ TUNEL, выполнение анализа в соответствии с протоколом производителя. Начнет с анализом TUNEL перед выполнением иммунного окрашивания, как это могло бы мешать вторичные антитела и гасят флуорофоры при использовании впоследствии.
  6. Развести антитела в блокирующем растворе при следующих концентрациях: нестин, 1: 200; п-Вим, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 1:20; и вторичные антитела, 1: 1000.
  7. Инкубируют 200 мкл первого первичного антитела (например, нестин) в течение 1-2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
  8. Промыть 3 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
  9. Развести первый (анти-мышь 488) вторичное антитело 1: 1000 в блокирующем растворе и инкубировать слайд в 200 мкл в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Отныне, всегда защищать слайды от света.
  10. Промыть 3 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
  11. Инкубируют 200 мкл следующего первичного антитела (например, TUJ1) в течение 1-2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
  12. Промыть 3 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
  13. Добавьте 200 мкл следующего вторичного антитела (анти-кроличьего 647) в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
  14. Промыть 3 х 3 мин. с 200 мкл блокирующего раствора.
  15. Добавляют 200 мкл 4' , 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) при 30 нМ концentration в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре в течение ядерного окрашивания.
  16. Промыть 2 х 3 мин с 200 мкл блокирующего раствора.
  17. Промыть 1 х 1 мин с помощью 200 мкл дистиллированной воды и пусть секции сохнуть в течение 10-20 мин, пока не очевидно, капли воды не видно больше.
  18. Установить участки с вложением среды. Храните их в защищенном от света при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
  19. Далее с микроскопическим анализом изображения на общий обзор Органоид, желудочковой зоны, примитивного кортикальной пластинки, и в других областях, представляющих интерес.
  20. С помощью конфокальной микроскопии с 63X нефти объективных и флуоресцентных фильтров, выбранных в соответствии с флуоресцентным красителем-меченый вторичных антител , используемых 1, 10.

Результаты

Поколение органоидов мозга требует , по крайней мере , три недели непрерывного культивирования (рис 1А). Для достижения воспроизводимых результатов, мы рекомендуем, чтобы исследователь документы каждый шаг и, что немаловажно, позволяют избежать каких-либо изм...

Обсуждение

MCPH является сложным человеком психомоторного расстройства , которое не может быть обобщенно на животных моделей в естественных условиях или в простой культуре клеток человека подходов в пробирке. Клиническое проявление MCPH начинает появляться в течение первого триместра бе?...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фриц Тиссен фондом (Az.10.14.2.152). Мы благодарны ткани вложения объекта и основной микроскоп объект в CMMC. Мы благодарны за обсуждения и технической поддержки, предоставляемой членами Лаборатории Центросома и цитоскелета биологии. Мы благодарим Ли Мин Gooi за вычитку рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse 488InvitrogenA-11001Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647InvitrogenA-21245Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13bproteintech17711-1-APARL13B rabbit polyclonal antibody 
CELLSPIN systemIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US326704′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12Gibco, US31331093Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 
DorsomorphinSigma-Aldrich, USP5499Compound C; multiple suppliers
Embedding mediumAppliChemA9011, 0100Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrixCorning354277Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin Sigma-Aldrich, USG7765-250MLGelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
GlycineAppliChemA1067,1000Glycine for molecular biology; multiple suppliers 
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)Sigma Aldrich, USBR452201-1000EAmultiple suppliers 
InsulinSigma-Aldrich, USI3536-100MGmultiple suppliers
L-glutamineGibco, US25030081L-glutamine (200 mM)
Medium AStem cell technologies#05850mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium BStem cell technologies#05835Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium CGibco, US21103049Neural Basal Medium
MEMGibco, US11140035MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonza, Switzerland#LT07-218Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
NestinNovus biologicalsNBP1-92717Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)AppliChemA3813, 05004% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood 
PBS tabletsGibco, US18912014See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Gibco, US15140122Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)Sigma-Aldrich, USP8920-100MLMultiple suppliers
pVimMBLD076-3SPhospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A Stem cell technologies# 05872Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B Sigma-Aldrich, USA6964-100MLAccutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” 
Research Cryostat Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 SMultiple suppliers
SB431542Selleckchem.comS1067Multiple suppliers
Spinner flask 250 mLIBS Integra Bioscience182026
SucroseAppliChemA4734, 1000Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slidesThermo scientific, USJ3800AMNZSlides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1Gibco, US17502048N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin AGibco, US12587010B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek CryomoldSakura, NL4565Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura, NL4583Multiple suppliers
Triton X-100AppliChemA1388,0500Multiple suppliers
TUJ1Sigma-Aldrich, UST2200β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assayPromega, USG3250DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biologyAppliChemA4974,0500Multiple suppliers
waterproof sheetBEMIS company, inc.PM996Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632 Selleckchem.comS1049ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanolGibco, US313500102-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers

Ссылки

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?. Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены