Generazione di IPSC-derivati ​​cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce

Riepilogo

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Abstract

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduzione

disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani.

Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione 3D permette la formazione di vari tipi di cellule in un modo tempestivo e regione specifica, dando origine ad un organizzato, tessuto stratificato ^{1, 2, 3.} Grazie a laboratori che pionieri tecnologie di coltura 3D e demistificato la complessità della formazione degli organi, partendo da cellule staminali,abbiamo sviluppato un metodo robusto di generare organoidi cerebrali delineare eventi precoci di sviluppo del cervello umano e modellare microcefalia in vitro ^{1, 2, 3.} È da notare che abbiamo adattato il metodo originale sviluppato da Lancaster et al. generare organoidi cerebrali ^1. Questo metodo è stato modificato in base alle nostre esigenze sperimentali.

L'obiettivo di uno studio da Gabriel et al. sia per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari della neurale mantenimento delle cellule staminali durante lo sviluppo cerebrale. Per fare questo, uno studio meccanicistico è stato effettuato analizzando le cellule progenitrici neurali (NPC) in organoidi cervello 3D derivate da un paziente microcefalia ^4. Questo paziente portava una mutazione in CPAP, una proteina conservata centrosomica richiesto per la biogenesi centrosome ^5. Una crisi ipoglicemica ampiamente accettatatesi è che microcefalia è il risultato di una deplezione del pool NPC, e questo potrebbe essere dovuto sia a morte cellulare o alla differenziazione precoce ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Analizzando le zone ventricolari (VZS) di organoidi cerebrali microcefalia, è stato dimostrato che un numero significativo di NPC subisce divisione cellulare asimmetrica, a differenza organoidi cerebrali derivate da un donatore sano ^4. Ampie analisi microscopiche e biochimiche del cervello organoidi microcefalia hanno rivelato un ruolo inaspettato per CPAP in tempo utile lo smontaggio cilia ^4. Specificamente, CPAP mutato è associato ritardato smontaggio cilium e ritardata ciclo cellulare rientro, porta alla differenziazione precoce di NPC ^4. Questi risultati suggeriscono un ruolo per cilia in microcefalia e THcoinvolgimento EIR durante la neurogenesi e le dimensioni del cervello di controllo ^10.

La prima parte di questo protocollo è una descrizione di un metodo in tre fasi per generare organoidi cerebrali omogenei. Come accennato prima, il protocollo Lancaster originale è stato adattato e modificato per soddisfare il nostro scopo ^1. In primo luogo, iPSCs umani sono coltivate in una condizione priva di alimentazione definita sulla matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Questo passaggio evita le variazioni di colture di cellule staminali pluripotenti alimentatore-dipendente. In questo protocollo, l'induzione della differenziazione neurale per formare epitelio neurale parte direttamente dal iPSCs. Saltando la fase di formazione del corpo embrioide (EB), i neurali procede differenziazione in maniera più controllata e diretta. Questo approccio limita la formazione spontanea e non orientato di altri strati di cellule germinali, come mesoderma e endoderma. Applicando questo protocollo, neurosfere contenenti rosette neurali possono essere raccolte il giorno 5 per EHS matrice incorporamento e coltura in sospensione stazionario. Il mezzo organoide utilizzato per il terzo gradino del nostro protocollo è completato con dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin è un inibitore della piccola molecola di proteina morfogenica ossea (BMP), e inibisce la SB431542 / activin / via di segnalazione nodale TGFp. La combinazione di questi fattori potrebbe promuovere la differenziazione neuronale più efficiente rispetto all'acido retinoico solo ^{11, 12, 13, 14.}

Complessivamente, queste modifiche consentono la generazione riproducibile di organoidi cerebrali, con variazioni minime attraverso organoidi. È importante sottolineare che questo metodo è stato applicato per generare robusto organoidi cerebrali microcefalia da iPSCs paziente, che portano le mutazioni nei geni che influiscono centrosomi e dinamiche del ciclo cellulare.

La seconda parte di questo protocollo fornisce le istruzioni per preparare brain organoidi per l'analisi e l'interpretazione dei difetti cellulari in microcefalia. Questo include la fissazione, criosezionamento, colorazione di immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale. Questo protocollo fornirà al lettore una descrizione dettagliata dei risultati attesi e con la guida per l'interpretazione.

Protocollo

1. Generazione di Brain organoidi (23 giorni)

1. Avvio di neuroectoderma (5 giorni)
   Nota: I seguenti punti dovrebbero essere considerati prima dell'inizio della differenziazione. Il metodo riprogrammazione (ecc lentiviral-, basata microRNA Sendai-virus-, episomal-, o) per ottenere iPSCs umani dovrebbe essere idealmente la stessa per tutti i pazienti e controllare linee IPSC. Vari kit e le istruzioni sulla base di protocolli pubblicati riprogrammazione sono disponibili ^{15, 16, 17, 18.} La qualità delle linee IPSC umani è la chiave per realizzare una differenziazione ottimale. Monitorare colonia e la morfologia delle cellule con un microscopio e convalidare pluripotency testando l'espressione di marcatori come Oct3 / 4, Nanog, o TRA-1-60.
   1. iPSCs cultura umani in condizioni di assenza di alimentazione di mezzo A su un piatto rivestito con Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) matrice.
      NOTA: Grow iPSCs umane e di mantenere una condizione di cultura definita e per evitare un ulteriore passo per la rimozione di cellule feeder embrionali di topo (MEF) prima dell'inizio della differenziazione senza siero privo di alimentatore. Il numero di passaggio ottimale per iPSCs umani per iniziare intervalli differenziazione dal passaggio 15 sulla riprogrammazione del passaggio 70 in totale. Quando passaging, staccare colonie hiPSC come cellule aggregato utilizzando una soluzione distacco cellulare appropriata con ridotte sollecitazioni meccaniche e una pipetta sierologica 2 mL per trasferire aggregati ad un nuovo piatto. Evitare di dissociazione di singole cellule, in quanto questo potrebbe indurre la differenziazione ed apoptosi nelle maggior parte delle linee IPSC. E 'stato riferito che a lungo termine, passaging unicellulare potrebbe aumentare alterazioni genomiche in iPSCs umano ^{19, 20.} Evitare procedure distacco delle cellule, che richiedono una fase di centrifugazione per rimuovere la soluzione distacco, in quanto ciò riduce la vitalità complessiva di iPSCs. Testtutte le culture di contaminazioni microbiche, in particolare micoplasma, su base regolare, poiché questo potrebbe alterare la qualità delle iPSCs e la loro capacità di differenziazione.
      1. Cappotto 60 millimetri di tessuto coltura piatto con matrice EHS secondo le istruzioni del produttore.
      2. Scongelare un'aliquota di 1 x 10 ⁶ iPSCs umani. Seme i iPSCs in un 60-mm piatto di coltura di tessuto rivestito in matrice EHS e contenente 5 ml di terreno A (vedere la Tabella Materials). Cambiare la media giornaliera e il passaggio dopo 5 a 7 giorni in cui le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza.
         NOTA: Passaggio le iPSCs scongelati a 80% di confluenza con metodi standard, come il distacco privo di enzimi di colonie ^21, almeno una volta prima di iniziare la differenziazione. In breve, rimuovere il terreno COPSI, lavare le cellule una volta con pre-riscaldato 37 mezzo di Eagle modificato di Dulbecco ° C: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), e incubare i iPSCs seguendo il produttoreistruzioni utilizzando il reagente A (vedere la tabella materiali). Non superare il tempo di incubazione consigliato al fine di evitare la dissociazione di singole cellule. iPSCs umani dovrebbero essere staccati e galleggianti come aggregati, cellule non come singoli. Possono poi essere trasferite in EHS piatti matrici rivestite; per esempio, COPSI aggregati da un piatto di 60 mm può essere distribuito a 4 nuovi piatti 60 mm.
      3. Verificare la presenza di micoplasma con un kit di rilevamento micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare iPSCs solo libero-Mycoplasma, come micoplasma può alterare la capacità di differenziazione dei iPSCs.
   2. Dissociare iPSCs (80% confluenti) e preparare una sospensione singola cella utilizzando reagente B.
      1. Lavare le iPSCs una volta con pre-riscaldato (37 ° C) DMEM / F12.
      2. Aggiungere preriscaldata reagente B (ad esempio, 1 ml in piastre da 60 mm) e incubare le iPSCs per 5 min a 37 ° C e 5% CO _2.
      3. Flick 20 volte con un dito sulla parte inferiore eil piatto permette il distacco dei iPSCs. Controllare per il distacco delle cellule sotto il microscopio.
      4. Pipetta la sospensione cellulare su e giù nel piatto 5 volte con una micropipetta 1 mL.
      5. Aggiungere 3 ml di terreno A diluire 1 ml di reagente B e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml.
      6. girare con cautela l'iPSCs (500 xg) per 4 minuti a temperatura ambiente.
      7. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno B e contare il numero di cellule con un emocitometro.
         NOTA: Essere consapevoli di utilizzare unico mezzo per B risospensione. Evitare l'uso medio A, in quanto contiene una troppo elevata concentrazione di bFGF, che potrebbe inibire la differenziazione.
   3. Diluire la sospensione cellulare di 4,5 x 10 ⁵ cellule per ml in terreno B supplementato con 10 pM rho associata inibitore della proteina chinasi (Y-27632).
   4. Aggiungere 100 microlitri per pozzetto in un non-aderenti, v-bottom, piastra da 96 pozzetti.
      NOTA: Assicurarsi che le celle sono equamente distribuiti nel suspensione agitando la provetta ogni volta prima di estrarre porzioni 100 microlitri. È importante che ogni pozzetto deve contenere un numero di cellule equivalente per ottenere neurosfere omogenee in dimensione e forma (tonda, superfici definite).
   5. Girare delicatamente la piastra con le cellule a 500 xg e temperatura ambiente per 3 min e incubare a 37 ° C e 5% CO _2.
   6. Cambiare la media giornaliera, eliminando 50 microlitri e l'aggiunta di 50 ml di mezzo fresco B in tutti i pozzetti per i prossimi 5 giorni.

2. Incorporare Neurosfere a EHS Matrix (4 giorni)

1. Preparare mezzo neurosfere miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 senza (w / o) La vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM aminoacidi non essenziali (MEM), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo.
2. Raccogliere il neurosfere ingegnoah 200 microlitri micropipetta con una punta ~ 2 millimetri precedentemente tagliato con forbici sterili.
3. Posizionare i neurosfere circa 5 mm distanti sulla pellicola paraffina (3 x 3 cm ²⁾ in un piatto vuoto 100 mm e rimuovere con attenzione tanto del mezzo rimanente come possibile.
4. Aggiungere una goccia (7 mL) di matrice EHS su ogni singola neurosfere.
5. Incubare la matrice EHS gocce con le neurosfere per 15 minuti in un incubatore.
6. Lavare le neurosfere con attenzione dal film di paraffina da vampate di calore con il mezzo neurosfere. Per lavare, utilizzare una micropipetta 1 ml e un nuovo 100 millimetri Petri contenenti 10 ml di terreno neurosfere.
7. Incubare le neurosfere per i prossimi 4 giorni e aggiungere 2 ml di terreno neurosfere fresco il giorno 2.
   NOTA: Assicurarsi che gli scaffali in incubatrice sono piatte in modo che i EHS neurosfere matrice-incorporato non ammassarsi su un lato del piatto.

3. organoidi in una sospensione RotaryCultura (14 giorni)

1. Preparare cervello medio organoide miscelando il seguente: 1: 1 miscela di DMEM / F12 e media C (v / v), 1: 200 (v / v) integratore 1, 1: 100 (v / v) integratore 2 w / o vitamina A, 1: 100 L-glutammina, 0,05 mM MEM, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 1,6 g / L di insulina, 0,5 uM dorsomorphin, 5 pM SB431542, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo.
2. Aggiungere 100 ml di cervello organoide mezzo a ciascuna beuta trottola attraverso i suoi bracci laterali e metterli in un incubatore per pre-riscaldamento per almeno 20 min.
3. Impostare un programma di agitazione a 25 giri al minuto, secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Prima di trasferire le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore, accertarsi che siano tutti separati. Se due o più sono collegati attraverso matrice EHS, separarli tagliando la matrice di collegamento con un bisturi.
4. Trasferire accuratamente le neurosfere matrice-embedded EHS in fiasche filatore contenenti 100 ml di terreno organoide noiing una pipetta sierologica 2 ml. Utilizzare i bracci laterali del pallone filatore per trasferire i neurosfere nel pallone.
5. Posizionare i contenitori filatore su una piattaforma di agitazione magnetica in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2; questo è il giorno 0 della cultura organoide.
6. Modificare la media una volta alla settimana (o più spesso quando c'è un cambiamento di colore), eliminando la metà del mezzo e aggiungendo la stessa quantità di terreno fresco.
   NOTA: Quando si riprendono i palloni filatore fuori dell'incubatore, attendere 3-5 minuti per consentire le organoidi affondare fino al fondo del pallone. Rimuovere il supporto posizionando la punta di vetro pipetta (collegato ad una pompa) sulla superficie del liquido; aspirare il mezzo attenzione attraverso un'apertura laterale / braccio del pallone. Queste manipolazioni devono essere eseguite sotto il cofano laminare.

4. Analisi di cervello organoidi

1. Fissazione di organoidi
   1. Raccogliere le organoidi il giorno 14 del pallone filatore cultura with un taglio 1 micropipetta mL (taglio ~ 5 mm). Mettere tutti in piastre da 60 mm e lavare una volta con 5 ml di caldo DMEM / F12 per 3 min.
   2. Preparare una provetta da 1,5 ml con 500 ml di caldo 4% paraformaldeide (PFA).
      Attenzione: Indossare pelle e protezione per gli occhi e il lavoro sotto una cappa di sicurezza durante la manipolazione PFA fissativo.
   3. Collocare ogni organoide separatamente in ciascun tubo e correggerli per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Non fissare le organoidi per più di 60 min. Per spostare i organoidi, utilizzare un ciclo inoculazione o qualsiasi altro escogitare che è conveniente.
   4. Rimuovere il PFA e lavare i organoidi fissati due volte per 10 minuti ciascuno con 1 ml di PBS.
   5. Memorizzare i organoidi in 1 ml di PBS a 4 ° C fino a 7 giorni, fino ad ulteriore utilizzo.
2. Incorporare le organoidi per criosezionamento
   1. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di 30% di saccarosio in soluzione acqua distillata per provetta a disidratare le organoidi prima di loro cryofreezing; dopo l'aggiunta di Sucrosoluzione se le organoidi dovrebbe essere galleggiante in superficie. Conservare le organoidi durante la notte in soluzione di saccarosio a 4 ° C; il giorno dopo, i organoidi dovrebbero hanno affondato fino al fondo della provetta.
      NOTA: organoidi possono essere conservati per un massimo di 3-5 giorni a 4 ° C in soluzione di saccarosio, se necessario.
   2. Riempire uno stampo vinile campione con 400 ml di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e utilizzare un ciclo inoculazione di effettuare un organoide al centro dello stampo. Etichettare il bordo dello stampo con il nome del campione.
   3. Congelare lo stampo organoide contenente a -80 ° C fino criosezionamento.
   4. cryoslides vetro cappotto con 0,1% di soluzione di lisina poli-l-(PLL) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente e lasciate asciugare i vetrini per 3 h. Conservare i campioni a 4 ° C e caldo fino a camera temperato prima dell'uso.
      NOTA: PLL-rivestimento è un passo importante, poiché impedisce le fette organoide dal galleggiante via. Raccogliere e conservare soluzione PLL a 4 ° C fino a 3mesi. Prima di riutilizzo, filtrare con una siringa 0,22-micron e farlo riscaldare a temperatura ambiente.
   5. Organoidi sezione cryofrozen in 20-50 fette um di spessore su vetro PLL rivestite cryoslides ^22. Lasciate che i vetrini con sezioni asciugare per 1 ora a temperatura ambiente. Conservare le sezioni a -80 ° C fino ad ulteriore trasformazione.

5. immunofluorescenza colorazione di sezioni organoide

NOTA: Per la caratterizzazione generale della organoidi, colorazione con nestina, un marker progenitore neuronale, e TUJ1, un marker pan-neuronale, è raccomandato. Come esempi aggiuntivi, immunofluorescenza con fosfo-Vimentin (p-Vim), le etichette mitotiche apicali cellule gliali radiali, e Arl13b, per ciglia, sono descritti. Per testare l'apoptosi, utilizzare il test Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL). Porre i vetrini in una scatola di plastica durante le incubazioni per proteggerli da polvere, luce,e l'essiccazione.

1. Scongelare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavare i vetrini due volte con 200 microlitri di PBS-glicina (0,225 g di glicina in PBS) per 3 min per estinguere l'autofluorescenza PFA-indotta.
3. Permeabilize sezioni con 200 microlitri di 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. lavarli due volte con 200 microlitri di soluzione di PBS-glicina per 3 min.
5. incubare con 200 ml di 0,5% gelatina di pesce / 0,1% Triton X100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C per bloccare l'antigene legame aspecifico.
   NOTA: Se è richiesto un saggio di TUNEL, eseguire il test come da protocollo del produttore. Iniziare con il saggio TUNEL prima di eseguire l'immunocolorazione, come potrebbe interferire con anticorpi secondari e spegnere fluorofori quando utilizzati in seguito.
6. Diluire gli anticorpi nel bloccare soluzione alle seguenti concentrazioni: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01:20; e anticorpi secondari, 1: 1000.
7. Incubare con 200 microlitri del primo anticorpo primario (per esempio, nestina) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
8. Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
9. Diluire il primo (anti-topo 488) anticorpo secondario 1: 1.000 in soluzione bloccante e incubare il vetrino in 200 microlitri per 1-2 ore a temperatura ambiente. D'ora in poi, proteggere sempre le diapositive dalla luce.
10. Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
11. Incubare con 200 microlitri della successiva anticorpo primario (per esempio, TUJ1) per 1-2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
12. Lavare 3 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
13. Aggiungere 200 microlitri della prossima anticorpo secondario (anti-coniglio 647) per 1-2 ore a temperatura ambiente.
14. Lavare 3 x 3 min. con 200 microlitri di soluzione di blocco.
15. Aggiungere 200 ml di 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ad una nM conc 30entration in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente per colorazione nucleare.
16. Lavare 2 x 3 min con 200 microlitri di soluzione di blocco.
17. Lavare 1 x 1 min con 200 ml di acqua distillata e lasciare che le sezioni asciugare per 10-20 minuti, fino a quando non goccia d'acqua ovvia è più visibile.
18. Montare le sezioni con mezzo di inclusione. Conservarli al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di diverse settimane.
19. Procedere con l'analisi microscopica all'immagine una panoramica, zona organoide ventricolare, corticale primitivo, e altre aree di interesse.
20. Utilizzare un microscopio confocale con un olio 63X filtri obiettive e fluorescenti, scelti in base alle anticorpi secondari colorante fluorescente-tag utilizzati ^{1, 10.}

Risultati

La generazione di organoidi cerebrali richiede almeno tre settimane di coltura continua (Figura 1A). Per ottenere risultati riproducibili, è consigliabile che il ricercatore documenta ogni passo e, soprattutto, evita alcuna modifica per quanto riguarda i componenti di media, punti di tempo, e la manipolazione delle cellule. Qui, diamo una sintesi di come valutare se le tappe critiche sono raggiunti al fine di ottenere organoidi di qualità sufficiente alla fine dell'...

Discussione

MCPH è un disordine dello sviluppo neurologico umana complessa che non può essere ricapitolato in modelli animali in vivo o in cultura semplici cellule umane in vitro si avvicina. La manifestazione clinica della MCPH comincia ad apparire durante il primo trimestre, quando comincia presto neurogenesi. Così, organoidi cerebrali in 3D rappresentano un sistema sperimentale affidabile per modellare lo sviluppo MCPH. Inoltre, 3D organoidi cervello umano sono un approccio ideale in quanto i) che consentono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 mL	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers