使用荧光素二乙酸酯 - 碘化丙啶双重染色在小脑颗粒神经元培养中评估神经元活力

摘要

该协议描述了如何使用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双重染色在培养的小脑颗粒神经元中准确测量神经元活力，这是一种初级神经元培养物，用作神经科学和神经药理学研究中的体外模型。

摘要

原代培养的小脑颗粒神经元（CGNs）已广泛用作神经科学和神经药理学研究中的体外模型。然而，CGN培养中神经胶质细胞和神经元的共存可能导致精确评估神经元活力的偏差。荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染法已被用于通过同时评估活细胞和死细胞来测量细胞活力。我们使用FDA-PI双染来提高比色测定的敏感性，并评估CGNs中的神经元活力。此外，我们添加蓝色荧光DNA污渍（ 例如 Hoechst）以提高准确性。该协议描述了如何通过在CGN培养中使用这些方法来提高神经元活力评估的准确性。使用该方案，可以通过使用荧光显微镜来排除胶质细胞的数量。可以应用类似的策略来区分不想要的gli来自各种混合细胞培养物中的神经元的细胞，例如原代皮质培养物和海马培养物。

引言

通常使用比色细胞毒性测定法（例如3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化物（MTT）测定法来测量体外细胞活力。来自大鼠的原代培养的小脑颗粒神经元（CGN）对各种神经毒素敏感，包括1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子，过氧化氢和谷氨酸盐^1,2 。因此，CGN培养可用作神经科学领域的体外模型。 CGN培养物可以含有多种细胞，包括神经元和神经胶质细胞，其可占CGN培养物中总细胞的约1％。然而，与神经元相比，神经胶质细胞对神经毒素的反应不同，导致通过比色测定法测量的神经元存活力的偏差³ 。

在活细胞中，荧光素二乙酸酯（FDA）可以通过酯酶转化为荧光素。碘化丙啶（PI）可以在穿透死细胞后与DNA相互作用，可用于指示培养物中的凋亡。因此，FDA-PI双染可以同时评估活细胞和死细胞，这表明通过组合比色法可以更精确地测量细胞活力。此外，通过添加Hoechst蓝色荧光染色剂可以进一步提高细胞活力的准确性。本文提出的方案描述了FDA-PI双染色和FDA-PI-Hoechst三重染色，可用于准确分析原代培养的CGNs中的神经元活力。

该协议利用其不同尺寸和形状可视化和区分CGN和胶质细胞。染色后，从通过荧光显微镜拍摄的代表性图像中计数活神经元和死亡神经元的数量。通过比较典型的CGN t来排除大尺寸胶质细胞在荧光模式下，在相位对比模式下拍摄。可以进行类似的策略来测量含有神经元和神经胶质细胞的混合细胞培养物中的神经元活力，例如原代皮层培养物和海马培养物。

研究方案

所有程序均遵循国家卫生研究院（NIH）实验动物护理和使用指南（NIH出版物第80-23号，修订1996年），并得到宁波大学体育动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（ SYXK-2008-0110）。

解决方案和文化媒体的准备

注意:试剂和库存需要在无菌条件下制备。通过使用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤灭菌。

1. 通过向10mL双蒸水（ddH ₂ O）中加入5mg的PLL制备聚-L-赖氨酸（PLL）储备溶液。过滤灭菌将PLL储存液等分并储存在-20°C几个月。
2. 通过将7.25g NaCl，0.4g KCl，0.14g NaH ₂ PO 4，2.6g D-葡萄糖和5.94g 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸加入到100mL的水中制备Krebs缓冲液ddH _{2 <}/子> 0。过滤灭菌将Krebs缓冲溶液在4℃下储存长达一个月。
3. 通过向100mL ddH ₂ O中加入3.82g的Mg ₂ SO ₄来制备3.82％Mg ₂ SO ₄溶液。通过过滤灭菌。将Mg ₂ SO ₄溶液在4℃下储存数月。
4. 通过向100mL ddH ₂ O中加入1.2g CaCl ₂制备1.2％CaCl ₂溶液。通过过滤灭菌。将CaCl ₂溶液在4℃下储存数月。
5. 通过向100mL ddH ₂ O中加入15克KCl来制备2M KCl溶液。通过过滤灭菌。将KCl溶液在4℃下储存数月。
6. 通过向100mL的ddH ₂ O中加入1.8g D-葡萄糖来制备D-葡萄糖储备溶液。通过过滤灭菌。将D-葡萄糖溶液在4℃下等分并储存长达一个月。
7. 制备胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（Ara-C）储备溶液通过将0.24g Ara-C加入到10mL ddH ₂ O中通过过滤灭菌。将Ara-C储备溶液等分并储存在4℃下几个月。
8. 在Basal Medium Eagle（BME）中，使用25mL胎牛血清（FBS），2.5mL 100x谷氨酰胺，2.78mL 2M KCl溶液和2.5mL 100x抗生素制备250mL培养基（25-30只幼仔） 。将体积调节至250 mL，过滤灭菌。
9. 使用2.5 mL 100x谷氨酰胺，2.78 mL 2M KCl溶液和2.5 mL 100x抗生素在BME中制备25K培养基。将体积调节至250 mL，过滤灭菌。
10. 在BME中使用2.5 mL 100x谷氨酰胺和2.5 mL 100X抗生素制备5K培养基。将体积调节至250 mL，过滤灭菌。
    注意:培养基，25K培养基和5K培养​​基需要新鲜准备
11. 通过向1 mL丙酮中加入5 mg FDA来准备FDA储备溶液。将FDA储存溶液储存在4°C长期储存/ LI>
12. 通过在1mL ddH ₂ O中加入1mg PI制备PI储备溶液。将PI储备溶液在4℃下储存几个月。
13. 通过向1mL ddH ₂ O中加入5mg Hoechst 33342制备Hoechst储备溶液。将Hoechst储备溶液在4℃下储存几个月。

2.解剖解决方案的准备

注意:在解剖前1 d做。

1. 通过加入15 mL Krebs缓冲液，1.2 mL 3.82％Mg ₂ SO ₄溶液和0.45 g牛血清白蛋白（BSA），加入到150 mL ddH ₂ O中来制备解剖溶液。用NaOH调节pH至7.4。
2. 标记5×50mL管，如下:1,2,3,4和5。
3. 将40 mL解剖溶液放入带过滤器的50mL注射器中。将30mL的解剖溶液过滤到管1中，并将2mL分别加到几个35mm的细胞培养皿中，这些培养皿将用于处理组织。
4. 要tub 2，在50mL的解剖溶液中加入12.5mg胰蛋白酶。通过涡旋完全混合。过滤灭菌
5. 向管3中加入1.2mg DNAse I，7.8mg大豆胰蛋白酶抑制剂和150μL3.82％Mg ₂ SO ₄溶液于15mL解剖溶液中。通过涡旋完全混合。过滤灭菌
6. 对管4，从管3中加入5mL溶液。加入10.5mL解剖溶液。过滤灭菌
7. 向管5中加入100μL3.82％Mg ₂ SO ₄溶液和15μL1.2％CaCl ₂溶液在12.5mL的解剖溶液中。通过涡旋完全混合。过滤灭菌
8. 使用前将所有的管保存在4°C。

3.涂覆细胞培养板

注意:在解剖前1 d做。

1. 加入1 mL PLL储备溶液至100mL ddH ₂ O（终浓度:5μg/ mL）。大衣塑料通过加入5μg/ mL聚-L-赖氨酸溶液，6孔或12孔细胞培养板（6孔细胞培养板每孔2mL或12孔细胞培养板每孔1mL）。
2. 在室温下孵育1天（或37℃，2小时）。解剖前1-2 h，用移液管取出溶液。用ddH ₂ O洗涤一次，在细胞培养罩中干燥。

4.加工8日龄Sprague-Dawley大鼠的组织。

1. 把一个100毫米的盘子放在冰上。使用一把无菌剪刀将大鼠幼仔放入盘中。
2. 将剪刀插入孔中，将头骨的两侧从耳朵切割到眼睛。用镊子提起头骨。确保整个大脑在头骨中。使用一对镊子将小脑隔离并放入上述35mm的盘中。
3. 在解剖显微镜下工作。用两对镊子去除脑膜和血管。
4. 用刀片切碎纸巾。将组织放入管1中。在室温和1500×g离心5分钟。
5. 吸出上清液。保存颗粒。
6. 将管2中的溶液加入沉淀。轻轻晃动重悬。
7. 将管置于37℃水浴中15分钟。每3分钟轻轻晃动一次。
8. 将管4中的溶液加入到该溶液中。摇匀并离心5分钟，室温和1500 x g。
9. 吸出上清液。保存颗粒。
10. 将溶液加入管3中以重悬。
11. 准备两个15 mL管。将一半的细胞放在每个管中。使用棉塞巴斯德移液器将60-70x上下移动，使细胞匀浆。
12. 在管5中加入3 mL溶液至每个15 mL管中。让他们在室温下静置10分钟，然后用棉塞巴斯德吸管小心地去除上清液。将上清液放入新的15 mL管中，并在室温和1500 x g离心5 min。
13. 一个旋转上清液。保存颗粒。
14. 将培养基添加到沉淀中以获得约1.5×10 ^6个细胞/ mL的细胞密度（10只幼仔约100mL）。
15. 将细胞置于培养板中，并在37℃和5％CO ₂的培养箱中培养。

5.培养过程中加入Ara-C和D-葡萄糖

1. 24小时后，加入Ara-C储备溶液（12孔细胞培养板10μL/孔或6孔细胞培养板20μL/孔;终浓度:1 mM），以抑制胶质细胞的生长。
2. 在第7天，对于12孔细胞培养板，每孔加入50μLD-葡萄糖储备溶液或每孔100μL用于6孔细胞培养板，使得终浓度为1mM。

6.GC-PI双重染色和CGI文化中的FDA-PI-Hoechst三重染色

1. 通过加入20μL的FDA储备溶液（准备FDA-PI工作溶液）最终浓度:10μg/ mL）和50μLPI储备溶液（终浓度:50μg/ mL）在10mL PBS中的溶液。通过涡旋混合并将其置于冰上。
   1. 对于FDA-PI-Hoechst工作溶液，加入20μLFDA储备溶液（终浓度:10μg/ mL），50μLPI储备溶液（终浓度:50μg/ mL）和10μLHoechst储备溶液（终浓度:5μg/ mL）在10mL的PBS中。通过涡旋混合并将其置于冰上。
      注意:在使用之前，新鲜准备FDA-PI工作解决方案和FDA-PI-Hoechst工作解决方案。
2. 将细胞培养板从培养箱中取出。放在冰上
3. 吸取培养基并用冷PBS代替。
   注意:解决方案的变化必须缓慢而小心地进行。避免用移液器吸头接触细胞。
4. 吸入冷PBS，并用冷的FDA-PI或FDA-PI-Hoechst工作溶液（500μL/我们）进行更换12孔细胞培养板或1mL /孔用于6孔细胞培养板）。在冰上离开5分钟。
5. 吸取FDA-PI或FDA-PI-Hoechst工作溶液，加入冷PBS（12孔细胞培养板100μL/孔或6孔细胞培养板50μL/孔）。
   注意:摄影时不应让细胞干燥。
6. 使用荧光显微镜拍摄图像。使用通过波长为450 - 490 nm的激发滤光片。分别在520,620和460nm检测FDA，PI和Hoechst的荧光发射。在相同条件下，使用荧光显微镜的相位对比模式在正常光照下拍摄图像。
   注意:在FDA-PI或FDA-PI-Hoechst染色后15分钟内拍摄图像。曝光时间为100-300 ms，模拟增益为2.8x。

7.神经元生存能力评估

1. 对于FDA-PI双染色，覆盖过滤后检测到的细胞的图像通过在图形编辑器软件中通过在PI阳性层上拖动FDA阳性层，通过不同的荧光滤光片。
   1. 通过在"图层"面板的"不透明度"字段中输入"50％"来调整FDA阳性层的不透明度。通过单击"图层"菜单中的"合并可见"按钮合并两个图层。通过在"图像"|下的"对比度"字段中输入"50"来设置重叠图像的对比度"调整"| "亮度/对比度"。确保覆盖图像中没有FDA和PI双阳性细胞。
2. 对于FDA-PI-Hoechst三重染色，通过在图形编辑器软件中拖动PI阳性层上的FDA阳性层，在过滤不同的荧光过滤器之后，覆盖检测到的细胞的图像。通过在"图层＆＃"中的"不透明度"字段中输入"50％"来调整FDA阳性层的不透明度，34;面板。
   1. 通过单击"图层"菜单中的"合并可见"按钮合并两个图层。拖动合并图层上的Hoechst正层。通过在"图层"面板的"不透明度"字段中输入"50％"来调整Hoechst正层的不透明度。通过单击"图层"菜单中的"合并可见"按钮合并两个图层。
3. 通过比较在荧光模式下拍摄的图像与在相位对比模式下拍摄的图像，可以将CGNs中的大型不规则胶质细胞视觉辨认为直径比CGN大三倍的细胞被认为是胶质细胞，应该被排除。
4. 通过在图像处理程序（ 例如， ImageJ） ⁴中使用细胞计数器插件分别计数可行神经元和死神经元的数量。
   1. 对于FDA-PI双重染色，手动标记小的FDA阳性细胞可行的神经元。手动将PI阳性细胞标记为死神经元。对于FDA-PI-Hoechst三重染色，手动将小型的FDA和Hoechst-双阳性细胞标记为可行的神经元。手动将PI-和Hoechst-双阳性细胞标记为死亡神经元。
5. 通过使用以下等式计算神经元活力的百分比:神经元存活力的百分比= [活神经元数量（死亡神经元数+可行神经元数）]×100％。对于每个井，选择五个随机场，平均神经元生存率的百分比。

结果

GAP43（红色）和GFAP（绿色）的双重免疫染色分别用于分析神经元和神经胶质细胞的形状。神经元和神经胶质细胞均存在于CGN培养物中。 GFAP阳性神经胶质细胞大，形状不规则，如图像中的箭头所示（ 图1 ）。当用于测量神经元活力时，细胞活力的传统测定法不能区分神经元神经元。因此，可以区分胶质细胞与神经元的FDA-PI和FDA-PI-Hoechst染色有利于准确评估CGN培...

讨论

该协议是从先前已经描述过的程序6,7修改的。研究人员花费时间尝试通过在体外培养原代神经元时改善条件来减少非神经元细胞生长⁸ 。然而，即使改善的培养条件，一些胶质细胞仍然存在。此外，非神经元细胞在原代神经元培养中是必需的，因为它们有助于神经元生长和成熟⁹ 。在这项研究中，Ara-C被用来尽可能减少神经胶质细胞的生长，尽管在CGN培养?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100× glutamine	Gibco	25030081
100× anti-biotic	Gibco	15240062
BME medium	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate	Sigma	F7378
Propidium iodide	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine serum albumin	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn  the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate  is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 ml	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 ml	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image process softeware	NIH	ImageJ