Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

Resumen

Este protocolo describe cómo medir con precisión la viabilidad neuronal utilizando fluoresceína diacetato (FDA) y Propidium Iodide (PI) doble tinción en neuronas cultivadas de gránulos cerebelosos, un cultivo neuronal primario utilizado como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología investigación.

Resumen

Las neuronas de gránulos cerebelosos cultivadas primarias (CGN) han sido ampliamente utilizadas como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología. Sin embargo, la coexistencia de células gliales y neuronas en el cultivo CGN podría conducir a sesgos en la evaluación precisa de la viabilidad neuronal. El diacetato de fluoresceína (FDA) y la tinción doble de yoduro de propidio (PI) se han utilizado para medir la viabilidad celular mediante la evaluación simultánea de las células viables y muertas. Se utilizó FDA-PI doble tinción para mejorar la sensibilidad de los ensayos colorimétricos y para evaluar la viabilidad neuronal en CGNs. Además, se añadieron manchas azules fluorescentes de ADN ( por ejemplo, Hoechst) para mejorar la precisión. Este protocolo describe cómo mejorar la precisión de la evaluación de la viabilidad neuronal mediante el uso de estos métodos en CGN cultivo. Usando este protocolo, el número de células gliales puede ser excluido usando microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede aplicar para distinguir el gli no deseadoAl de células de neuronas en diversos cultivos celulares mixtos, tales como cultivo cortical primario y cultivo del hipocampo.

Introducción

Los ensayos de citotoxicidad colorimétrica, tales como el ensayo de bromuro de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazolio (MTT), se usan comúnmente para medir la viabilidad celular in vitro . Las neuronas de gránulos cerebelosos (CGN) de ratas primarias cultivadas son sensibles a diversas neurotoxinas, incluyendo el ion 1-metil-4-fenilpiridinio, el peróxido de hidrógeno y el glutamato ^{1 , 2} . Por lo tanto, los cultivos CGN pueden ser utilizados como un modelo in vitro en el campo de la neurociencia. Los cultivos CGN pueden contener una variedad de células, incluyendo neuronas y células gliales, que pueden representar alrededor del 1% del total de células en el cultivo CGN. Sin embargo, las células gliales responden de manera diferente a las neurotoxinas en comparación con las neuronas, lo que lleva a un sesgo en la viabilidad neuronal medido por ensayos colorimétricos [ ^3] .

En las células viables, el diacetato de fluoresceína (FDA) puede convertirse en fluoresceína por esterasa.El yoduro de propidio (PI) puede interactuar con el ADN después de penetrar en células muertas y puede usarse para indicar la apoptosis dentro del cultivo. Por lo tanto, la tinción doble FDA-PI puede evaluar simultáneamente células viables y células muertas, lo que sugiere que la viabilidad celular puede medirse con mayor precisión combinando ambos métodos colorimétricos. Además, añadiendo Hoechst, una mancha fluorescente azul para los núcleos, la exactitud de la viabilidad celular podría ser mejorada. El protocolo presentado aquí describe tinción doble FDA-PI y tinción triple FDA-PI-Hoechst, que puede usarse para analizar con precisión la viabilidad neuronal en CGNs cultivados primarios.

Este protocolo aprovecha la visualización y la distinción de CGNs y células gliales por sus diferentes tamaños y formas. Después de la tinción, el número de neuronas viables y neuronas muertas se cuentan a partir de imágenes representativas tomadas por microscopía fluorescente. Las células gliales de gran tamaño se excluyen mediante la comparación de CGN típicos tAken en modo fluorescente con las tomadas en modo de contraste de fase. Se puede llevar a cabo una estrategia similar para medir la viabilidad neuronal en cultivos de células mixtas que contienen neuronas y células gliales, tales como cultivos corticales primarios y cultivos de hipocampo.

Protocolo

Todos los procedimientos siguieron la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publications No. 80-23, revisada en 1996) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Ningbo SYXK-2008-0110).

1. Preparación de soluciones y medios de cultivo

Nota: Los reactivos y las existencias deben prepararse en condiciones estériles. Esterilizar por filtración utilizando un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm.

1. Preparar la solución madre de poli-L-lisina (PLL) añadiendo 5 mg de PLL a 10 ml de agua doblemente destilada (ddH2O). Esterilizar por filtrado. Alícuota y almacenar la solución madre PLL a -20 ° C durante varios meses.
2. Preparar el tampón de Krebs añadiendo 7,25 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 0,14 g de NaH _{$ ₂ $} PO _{$ ₄ $} , 2,6 g de D-glucosa y 5,94 g de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico a 100 ml de DdH _ _{2 }/ Sub> O. Esterilizar por filtrado. Guarde la solución tampón de Krebs a 4 ° C durante un máximo de un mes.
3. Se prepara _una solución de Mg _$ ₂ _$ SO _$ ₃ _$ al 3,82% añadiendo 3,82 g de Mg _$ ₂ _$ SO _$ ₄ _$ a 100 ml de ddH _$ ₂ _$ O. Se esteriliza por filtración. Guarde la solución de Mg2SO4 a 4 ° C durante varios meses.
4. Se prepara _una solución de CaCl _$ ₂ _$ al 1,2% añadiendo 1,2 g de CaCl _$ ₂ _$ a 100 ml de ddH _$ ₂ _$ O. Se esteriliza por filtración. Guarde la solución de CaCl ₂ a 4 ° C durante varios meses.
5. Preparar una solución de KCl 2M añadiendo 15 g de KCl a 100 mL de ddH2O. Esterilizar por filtración. Guarde la solución de KCl a 4 ° C durante varios meses.
6. Preparar la solución madre de D-glucosa añadiendo 1,8 g de D-glucosa a 100 mL de ddH2O. Esterilizar por filtración. Alícuota y almacenar la solución de D-glucosa a 4 ° C durante un máximo de un mes.
7. Preparar la solución madre de citosina β-D-Arabinofuranosida (Ara-C)Ion añadiendo 0,24 g de Ara-C a 10 ml de ddH _$ ₂ _$ O. Se esteriliza por filtración. Alícuota y almacenar la solución madre de Ara-C a 4 ° C durante varios meses.
8. Preparar 250 ml de medio de cultivo (para 25-30 crías) utilizando 25 ml de suero bovino fetal (FBS), 2,5 ml de glutamina 100x, 2,78 ml de solución de KCl 2M y 2,5 ml de antibióticos 100x en Basal Medium Eagle (BME) . Ajuste el volumen a 250 ml y esterilice por filtración.
9. Preparar medio 25K utilizando 2,5 mL de glutamina 100x, 2,78 mL de solución de KCl 2M y 2,5 mL de antibióticos 100x en BME. Ajuste el volumen a 250 ml y esterilice por filtración.
10. Preparar medio 5K utilizando 2,5 mL de 100x glutamina y 2,5 mL de antibióticos 100X en BME. Ajuste el volumen a 250 ml y esterilice por filtración.
    NOTA: El medio de cultivo, medio de 25 K y medio de 5 K deben estar recién preparados
11. Preparar la solución madre FDA añadiendo 5 mg de FDA a 1 mL de acetona. Guarde la solución madre FDA a 4 ° C para su almacenamiento a largo plazo.
12. Preparar la solución madre de PI añadiendo 1 mg de PI a 1 ml de ddH ₂ O. Almacenar la solución madre PI a 4 ° C durante varios meses.
13. Preparar Hoechst solución madre añadiendo 5 mg de Hoechst 33342 a 1 ml de ddH ₂ O. Almacenar la solución madre Hoechst a 4 ° C durante varios meses.

2. Preparación de soluciones de disección

NOTA: Haga esto 1 d antes de la disección.

1. Preparar la disolución de disección añadiendo 15 ml de tampón Krebs, 1,2 ml de solución de Mg _$ ₂ _$ SO _$ ₃ $ al 3,82% y 0,45 g de albúmina de suero bovino (BSA) a 150 ml de ddH _{$ ₂ $} O. Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH.
2. Marque los tubos de 5 x 50 mL como sigue: 1, 2, 3, 4 y 5.
3. Coloque 40 mL de solución de disección en una jeringa de 50 mL con un filtro. Filtrar 30 ml de solución de disección en el tubo 1 y 2 ml cada uno a varias placas de cultivo celular de 35 mm, que se utilizarán para procesar tejidos.
4. A tUbe 2, añadir 12,5 mg de tripsina en 50 ml de solución de disección. Mezclar por completo vortexing. Esterilizar por filtrado.
5. Al tubo 3, añadir 1,2 mg de DNAse I, 7,8 mg de inhibidor de tripsina de soja y 150 μl de solución de Mg ₂ SO ₄ al 3,82% en 15 mL de solución de disección. Mezclar por completo vortexing. Esterilizar por filtrado.
6. Al tubo 4, añadir 5 ml de la solución del tubo 3. Añadir 10,5 ml de solución de disección. Esterilizar por filtrado.
7. Al tubo 5, añadir 100 μl de una solución de 3,22% de Mg _$ ₂ _$ SO _$ ₄ _$ y 15 μl de solución de CaCl _$ ₂ _$ al 1,2% en 12,5 ml de solución de disección. Mezclar por completo vortexing. Esterilizar por filtrado.
8. Guarde todos los tubos a 4 ° C antes de usarlos.

3. Revestimiento de las placas de cultivo celular

NOTA: Haga esto 1 d antes de la disección.

1. Añadir 1 ml de solución madre PLL a 100 ml de ddH ₂ O (concentración final: 5 μg / ml). Capa de plásticoPlacas de cultivo celular de 6 o 12 pocillos (2 ml por pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos o 1 ml por pocillo para placas de cultivo celular de 12 pocillos) añadiendo 5 μg / ml de solución de poli-L-lisina.
2. Incubar a temperatura ambiente durante 1 día (o a 37 ° C durante 2 h). 1-2 h antes de la disección, retire la solución usando una pipeta. Lavar una vez con ddH ₂ O y secar en la campana de cultivo celular.

4. Procesamiento de tejidos para Ratas Sprague-Dawley de 8 dıas.

1. Ponga un plato de 100 mm en hielo. Decapitar a los cachorros de rata en el plato con un par de tijeras esterilizadas.
2. Inserte las tijeras en el agujero magno y corte los dos lados del cráneo, desde las orejas hasta los ojos. Levante el cráneo con un par de pinzas. Asegúrese de que todo el cerebro está en el cráneo. Aislar el cerebelo y ponerlo en el plato de 35 mm antes mencionado usando un par de fórceps.
3. Trabajo bajo un microscopio de disección. Retire las meninges y los vasos sanguíneos con dos pares de fórceps.
4. Cortar los tejidos con una cuchilla. Colocar los tejidos en el tubo 1. Centrifugar durante 5 min a RT y 1.500 x g.
5. Aspirar el sobrenadante. Guarde el pellet.
6. Añadir la solución en el tubo 2 al gránulo. Resuspender agitando suavemente.
7. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min. Agite suavemente cada 3 min.
8. Añadir la solución en el tubo 4 a esta solución. Agitar y centrifugar durante 5 min a RT y 1.500 x g.
9. Aspirar el sobrenadante. Guarde el pellet.
10. Añadir la solución en el tubo 3 para resuspender el gránulo.
11. Prepare dos tubos de 15 mL. Coloque la mitad de las células en cada tubo. Pipetar hacia arriba y hacia abajo 60-70x con una pipeta de Pasteur de algodón con tapón para homogeneizar las células.
12. Añadir 3 mL de la solución en el tubo 5 a cada tubo de 15 mL. Déjelos reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur de algodón. Colocar el sobrenadante en nuevos tubos de 15 mL y centrifugar durante 5 min a RT y 1.500 x g.
13. UNSpirate el sobrenadante. Guarde el pellet.
14. Añadir el medio de cultivo en el gránulo para obtener una densidad celular de alrededor de 1,5 x 10 ⁶ células / ml (aproximadamente 100 ml para 10 cachorros).
15. Colocar las células en placas de cultivo y cultivarlas en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ .

5. Adición de Ara-C y D-glucosa durante el cultivo

1. Después de 24 h, añadir solución madre de Ara-C (10 μL / pocillo para placas de cultivo celular de 12 pocillos o 20 μL / pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos, concentración final: 1 mM) para inhibir el crecimiento de las células gliales.
2. El dıa 7, a~nadir 50 μl de solución madre de D-glucosa por pocillo para placas de cultivo celular de 12 pocillos o 100 μl por pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos de manera que la concentración final sea 1 mM.

6. FDA-PI doble tinción y FDA-PI Hoechst triple tinción en CGN Cultura

1. Prepare la solución de trabajo FDA-PI añadiendo 20 μl de la solución madre FDA (Concentración final: 10 mu g / ml) y 50 mu l de solución madre PI (concentración final: 50 mu g / ml) en 10 ml de PBS. Mezclar vortexando y colocar esto en hielo.
   1. Para la solución de trabajo FDA-PI-Hoechst, añadir 20 μL de la solución madre FDA (concentración final: 10 μg / mL), 50 μl de la solución madre PI (concentración final: 50 μg / mL) y 10 μl de la solución madre Hoechst (Concentración final: 5 μg / ml) en 10 ml de PBS. Mezclar vortexando y colocar esto en hielo.
      NOTA: Prepare la solución de trabajo FDA-PI y la solución de trabajo FDA-PI-Hoechst antes de usarla.
2. Saque la placa de cultivo celular de la incubadora. Ponlo en hielo.
3. Aspirar el medio de cultivo y reemplazarlo con PBS frío.
   NOTA: El cambio de solución debe realizarse lenta y cuidadosamente. Evite tocar las celdas con puntas de pipeta.
4. Aspirar el PBS frío y reemplazarlo con solución de trabajo FDA-PI o FDA-PI-Hoechst fría (500 μl / weLl para placas de cultivo celular de 12 pocillos o 1 mL / pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos). Dejar en hielo durante 5 min.
5. Aspirar la solución de trabajo FDA-PI o FDA-PI-Hoechst y añadir PBS frío (100 μL / pocillo para placas de cultivo celular de 12 pocillos o 50 μL / pocillo para placas de cultivo celular de 6 pocillos).
   NOTA: No se debe permitir que las celdas se sequen al tomar imágenes.
6. Tomar imágenes usando microscopía fluorescente. Utilice un filtro de excitación con una banda de paso de 450 - 490 nm. Detectar las emisiones de fluorescencia para FDA, PI y Hoechst a 520, 620 y 460 nm, respectivamente. Bajo las mismas condiciones, tome una imagen bajo luz normal utilizando el modo de contraste de fase de la microscopía fluorescente.
   NOTA: Tome las imágenes dentro de los 15 minutos siguientes a la tinción FDA-PI o FDA-PI-Hoechst. El tiempo de exposición es 100-300 ms y la ganancia analógica es 2.8x.

7. Evaluación de la viabilidad neuronal

1. Para la tinción doble FDA-PI, se superponen las imágenes de las células detectadas después de filtrarPor diferentes filtros de fluorescencia arrastrando la capa FDA-positiva en la capa PI-positiva en un software de editor de gráficos.
   1. Ajuste la opacidad de la capa FDA-positiva introduciendo "50%" en el campo "Opacidad" del panel "Capas". Combinar dos capas haciendo clic en el botón "Merge Visible" en el menú "Layer". Ajuste el contraste de las imágenes de superposición introduciendo "50" en el campo "Contraste" en "Imagen" | "Ajustes" | "Brillo / Contraste". Asegúrese de que no hay células FDA y PI doble positivo en las imágenes de superposición.
2. Para la tinción triple FDA-PI-Hoechst, superponga las imágenes de las células detectadas después de filtrar diferentes filtros de fluorescencia arrastrando la capa FDA-positiva en la capa PI-positiva en un software de editor de gráficos. Ajuste la opacidad de la capa FDA-positiva introduciendo "50%" en el campo "Opacidad" de la sección "Capas & #34; panel.
   1. Combinar dos capas haciendo clic en el botón "Merge Visible" en el menú "Layer". Arrastre la capa positiva de Hoechst en la capa combinada. Ajuste la opacidad de la capa positiva de Hoechst introduciendo "50%" en el campo "Opacidad" del panel "Capas". Combinar las dos capas haciendo clic en el botón "Merge Visible" en el menú "Layer".
3. Distinguir visualmente las células gliales grandes y irregulares de las CGNs comparando las imágenes tomadas bajo el modo fluorescente con las tomadas bajo el modo de contraste de fase. Las células con diámetros tres veces mayores que las CGNs se consideran células gliales y deben ser excluidas.
4. Contar el número de neuronas viables y neuronas muertas, respectivamente, mediante el uso de un complemento de la célula en un programa de procesamiento de imágenes ( por ejemplo, ImageJ) [ ^4] .
   1. Para la tinción doble FDA-PI, marque manualmente pequeñas células FDA-positivas comoNeuronas viables. Marque manualmente las células PI-positivas como neuronas muertas. Para la tinción triple FDA-PI-Hoechst, marque manualmente pequeñas células positivas a la FDA y Hoechst como neuronas viables. Marque manualmente las células PI-y Hoechst-doble positivo como neuronas muertas.
5. Calcular el porcentaje de viabilidad neuronal utilizando la siguiente ecuación:% de viabilidad neuronal = [número de neuronas viables / (número de neuronas muertas + número de neuronas viables)] x 100%. Para cada pozo, elija cinco campos aleatorios y promedio el porcentaje de viabilidad neuronal.

Resultados

La inmunotinción dual de GAP43 (rojo) y GFAP (verde) se utilizó para analizar la forma de las neuronas y las células gliales, respectivamente [ ^{2 , 5]} . Tanto las neuronas como las células gliales están presentes en el cultivo CGN. Las células gliales GFAP-positivas son grandes e irregulares en forma, como lo indican las flechas en las imágenes ( Figura 1 ). Los ensayos tradicionales para la vitalidad celu...

Discusión

Este protocolo se modificó a partir de procedimientos que se han descrito previamente [ ^{6 , 7]} . Los investigadores han dedicado tiempo tratando de reducir el crecimiento de células no neuronales mediante la mejora de las condiciones de cultivo de neuronas primarias in vitro [ ^8] . Sin embargo, incluso con mejores condiciones de cultivo, algunas células gliales permanecen. Además, las células no neuronales son necesarias en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100× glutamine	Gibco	25030081
100× anti-biotic	Gibco	15240062
BME medium	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate	Sigma	F7378
Propidium iodide	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine serum albumin	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn  the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate  is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 ml	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 ml	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image process softeware	NIH	ImageJ